mL。
[0172] 使用ELISA技术依照制造商（IBL-America, Inc.，MN，USA)随上述A型流感IgG ELISA试剂盒提供的说明书分析血浆中的疫苗特异性IgGl和IgG3,并且采用下列的改良： 通过稀释度为1:2000的对人IgGl或IgG3特异的二级辣根过氧化物（HRP)缀合抗体（Alpha Diagnostic Inti. Inc.，Texas, USA)检测与固定化抗原结合的样品中的特异性抗体。在底 物反应后，添加终止溶液，并且在60分钟内用分光光度计在450nm测量0D。显色的颜色强 度与检测到的IgG特异性抗体的量成正比。使用标准曲线直接确定样品中的IgGl或IgG3 的量。在此测定中A型流感IgG的检出限为1. 09U/mL。
[0173] 唾液中的疫苗特异性抗体
[0174] 使用 ELISA 技术依照制造商（IBL-America, Inc.，MN，USA)随 A 型流感 IgG/IgA/ IgM ELISA试剂盒提供的说明书分析唾液中的疫苗特异性抗体IgG、IgA和IgM。这些测定提 供的微量滴定板已经预先包被有A型流感抗原。通过对人IgG、IgA或IgM特异的二级酶联 抗体检测与固定化抗原结合的样品中的特异性抗体。在底物反应后，通过吸取终止溶液在 60分钟内用分光光度计在450nm测量0D。显色的颜色强度与检测到的IgG、IgA或IgM-特 异性抗体的量成正比。使用标准曲线直接确定每个样品中的特异性抗体的量。在这些测定 中A型流感IgG、IgA或IgM的检出限为分别为1. 09U/mL、1. 29U/mL和1. 17U/mL。
[0175] 血浆中的破伤风特异性IgG
[0176] 使用ELISA技术依照制造商（武汉生物制品研究所，武汉，中国）随破伤风抗体 Elisa试剂盒提供的说明书分析血浆中的破伤风特异性抗体。在此试剂盒中提供的微量滴 定板已经预先包被有对破伤风特异性IgG特异的抗体。然后向适宜的微量滴定板孔中添加 标准品或样品。对破伤风特异性IgG特异的生物素缀合的多克隆抗体制剂和与HRP缀合的 抗生物素蛋白也添加至每个微量滴定板孔中并孵育。然后向每孔添加 TMB底物溶液，并且 含有破伤风特异性IgG、生物素缀合抗体和酶联抗生物素蛋白的孔显示颜色变化。通过添加 硫酸溶液终止酶-底物反应，并通过分光光度计在450nm的波长测量颜色变化。通过将样 品的0D与标准曲线比较来确定样品中破伤风特异性IgG的浓度。在此测定中破伤风特异 性IgG的检测范围为0. 1-40IU/L，且检测低限为0. 1IU/L。
[0177] 血浆中的总抗体
[0178] 使用 ELISA 技术依照制造商（Groundwork Biotechnology Diagnosticate, San Diego, USA)随人免疫球蛋白ELISA试剂盒提供的说明书分析血浆IgA、IgG、IgM、IgGl和 IgG3的总浓度。对于使用ELISA法的这些抗体，终止溶液将颜色从蓝色改变为黄色，并且 使用分光光度计在450nm测量颜色的强度。为了测量样品中抗体的浓度，每个ELISA试剂 盒包括一组校准标准品。在与样品同时一式两份地测定校准标准品，并且得到相对于抗体 浓度的0D标准曲线。然后通过将样品的0D与标准曲线比较来确定样品中抗体的浓度。对 于IgGl和IgG3的检出限为0· 01mg/mL。IgG、IgA和IgM测定的灵敏度分别为L Omg/mL、 0· 01mg/mL 和 0· lmg/mL。
[0179] 唾液中的总抗体
[0180] 使用ELISA技术并且依照制造商（USCNLIFE?武汉，中国）随人分泌性免疫球蛋白 A，SIgA ELISA试剂盒提供的说明书分析唾液SIgA的总浓度。在此试剂盒中提供的微量滴 定板已经预先包被有对SIgA特异的抗体。然后向适宜的微量滴定板孔中添加标准品或样 品。对SIgA特异的生物素缀合的多克隆抗体制剂和与HRP缀合的抗生物素蛋白也添加至 每个微量滴定板孔中并孵育。然后向每孔添加 TMB底物溶液，并且含有SIgA、生物素缀合抗 体和酶联抗生物素蛋白的孔显示颜色变化。通过添加硫酸溶液终止酶-底物反应，并通过 分光光度计在450nm的波长测量颜色变化。通过将样品的0D与标准曲线比较来确定样品 中SIgA的浓度。在此测定中SIgA的检出限一般为3. 9ng/mL，并且检测低限定义为可与0 区分的最低蛋白浓度。
[0181] 使用 ELISA 技术依照制造商（ZeptoMetrix Corporation, NY, USA)随定量人 IgG ELISA/定量人IgM ELISA试剂盒提供的说明书分析唾液IgG或IgM的总浓度。调整样品 的浓度以获得最适检测浓度。在这些测定中提供的微量滴定板已经预先包被有对人IgG或 IgM特异的多克隆抗体。将标准品或样品一式两份地添加至适宜的微量滴定板孔并孵育。 吸取与HRP缀合的检测剂抗体至每个标准品和样品孔中。孵育后，向每孔添加 TMB底物溶 液，并且含有人IgG或IgM的孔中显示蓝色。通过添加硫酸溶液终止酶-底物反应，并且发 生从蓝色至黄色的颜色变化。通过分光光度计在450nm的波长测量颜色变化。通过将样品 的0D与标准曲线比较来确定样品中IgG或IgM的浓度。在这些测定中IgG和IgM的检出 限一般为3. 9ng/mL，并且检测低限定义为可与0区分的最低蛋白浓度。
[0182] 血浆中的 11-2, INF-γ 和 IL-10
[0183] 使用 ELISA 技术依照制造商（Quantikine' R&D Systems, Inc.，MN, USA)随人 IL-2/INF- γ /IL-10免疫测定试剂盒提供的说明书分析细胞因子的血浆浓度。在这些测定 提供的微量滴定板已经预先包被有对IL-2、IFN-y或IL-10特异的单克隆抗体。一式两份 吸取标准品和样品至孔中，并且存在的细胞因子被固定化抗体结合。洗掉任何未结合物质 后，将对IL-2、IFN-y或IL-10特异的酶联多克隆抗体加入至孔中。洗涤去除任何未结合 的抗体-酶试剂后，将底物溶液加入至孔中，并且与初始步骤中结合的细胞因子的量成比 例地显色。停止显色，并且通过分光光度计在450nm的波长测量颜色的强度。通过将样品 的0D与标准曲线比较来确定样品中细胞因子的浓度。在这些测定中IL-2、IFN-y或IL-10 的检出限一般分别小于7· 0、8· 0和3. 9pg/mL。
[0184] 吞噬作用和吞噬细胞杀伤
[0185] 根据以前由Saresella及同事（1997)描述的方法确定吞作用和杀伤。全血白 细胞（⑶13+细胞）与经调理的异硫氰酸荧光素-标记的（FITC-标记）白色念珠菌芽生孢 子孵育用于吞噬作用和杀伤测定。仅活的FITC-标记的白色念珠菌芽生孢子用作对照。
[0186] 通过对吞噬细胞（⑶13+细胞）设门（gating)和计算吞噬细胞相关的绿色荧光细 胞的百分比来确定吞噬作用和杀伤。此程序基于下列的观察：FITC-标记的白色念珠菌芽 生孢子在用溴化乙锭（EtBr)染色后丧失其绿色荧光且获得红色荧光。因此，内化的白色念 珠菌芽生孢子仍然是绿色的，而贴壁的和未被吞噬的芽生孢子染成红色。吞噬和杀死的PMN 的百分比与绿色的-和双重标记的-绿色和红色的数目相等。
[0187] 使用装配有在488nm下工作的风冷的15mW氩离子激光的Coulter EPICS XL流式 细胞仪进行吞噬作用和杀伤的细胞计数分析。基于约10, 〇〇〇次事件的登记采集多参数数 据并且使用Coulter System II软件分析。借助于525nm带通滤波器测量来自FITC的绿 色荧光，而通过620nm带通滤波器测量来自EtBr的红色荧光。
[0188] 鉴定四个不同的组：吞噬细胞与贴壁的FITC-标记的白色念珠菌芽生孢子 贴壁率），吞噬细胞与摄入的和贴壁的FITC-标记的白色念珠菌芽生孢子贴壁和摄入 率），吞噬细胞与仅摄入的FITC-标记的白色念珠菌芽生孢子摄入率），和无相互作用 的吞噬细胞无相互作用）。
[0189] 自然杀伤细胞活性
[0190] 通过用50mL预温（37°C )的完全培养基填充50mL测试试管开始自然杀伤（NK)细 胞评估。通过在37°C水浴中快速搅动来快速复温解冻一小瓶K562靶细胞。当冰熔化时， 从水浴移除小瓶，将细胞悬液转移至含有温完全培养基的试管中并轻轻混合。细胞悬液在 室温下在1500rpm离心5min。弃去上清液，并将细胞沉淀物重悬于lmL完全培养基中。通 过台盼蓝拒染实验确定细胞数目，并且将细胞浓度在完全培养基中调整至lXl〇5/mL。如靶 细胞一样复温解冻和制备效应器细胞。通过台盼蓝拒染实验确定细胞数目，并且将细胞浓 度在完全培养基中调整至lxl〇5/mL。对于"高对照"样品，将30μ1 IL-2(200U/mL)加入至 效应器细胞悬液中。将效应器细胞与K562靶细胞以25:1E:T的比率以200 μ 1的最终体积 混合。使用单独的靶细胞作为对照。将所有试管涡旋并在1500rpm离心3min。然后在湿 化C0J?箱中将试管孵育120min。每个试管加入50 μ 1 DNA染色溶液，涡旋并在冰上孵育 5min。最后，加入250 μ1 PBS，并通过流式细胞仪分析样品。ΝΚ细胞活性计算为以25:1的 Ε:Τ比率杀死的％靶细胞。
[0191] CD4阳性Τ淋巴细胞
[0192] 采用流式细胞检测技术使用与人CD4(由大多数胸腺细胞，成熟Τ辅助细胞的亚 群，和单核细胞（以低水平）表达的59kDa细胞表面受体）反应的单克隆抗体（藻红蛋白 抗人⑶4 ;eBioscience?，San Diego，USA)分析⑶4+T细胞。此抗体被预滴定且通过正常人 PBMC的流式细胞检测分析进行测试。其以100 μ 1的总染色体积以5 μ 1 (0. 125 μ g)/百万 个细胞使用。
[0193] 实施例5
[0194] 使用 SAS 包 9· 2 版（SAS Institute Inc.，Cary, NC, USA)进行统计学分析。
[0195] 多重比较（MC)
[0196] 为多重性的缘故通过Holm-Bonferroni法（Holm 1979)调整主要功效变量。仅相 关的配对进行统计学比较：干酪乳杆菌431 ?饮