离内。在各种实 施例中，此类距离可以是约或低于lnm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、15nm、 20nm、30nm、40nm、50nm、100nm、200nm、300nm、400nm或 500nm。在一些实施例中，惨杂剂实体 与衬底表面之间的距离在2nm到5nm、5nm到10nm或10nm到15nm范围内。在一些实施例 中，掺杂剂实体可以与衬底或相邻层的表面直接接触。
[0146] 在一些实施例中，在衬底合成之后，可以使用表面底涂剂。示例性表面底涂剂 包括（但不限于）官能化二氧化硅试剂，例如MPTMS和APTMS，或聚合物（例如聚乙二 醇-(PEG)-硫醇）。
[0147] 在一些实施例中，掺杂剂实体对纳米粒子的一或多种组分具有足够的亲和力以允 许封端剂置换和/或允许纳米粒子中或其上掺杂剂实体的高密度和/或紧密的表面局部负 载。封端剂可以是能与衬底可置换地结合的实体。不希望受任何特定理论束缚，此处应注 意，在一些实施例中，封端剂可以在衬底合成中发挥重要作用。在一些实施例中，封端剂控 制衬底的大小和几何形状。在一些实施例中，封端剂是在合成之后作为合成的衬底上所吸 附的单层存在。在一些实施例中，封端剂被强力地吸附到衬底的表面上。在一些实施例中， 封端剂提供稳定性和/或防止衬底聚集。示例性封端剂包括（但不限于）有机试剂，例如 柠檬酸酯、柠檬酸、抗坏血酸、抗坏血酸酯、棕榈酰基抗坏血酸酯、四（羟基甲基）氯化磷鑰 盐及氨基酸。在一些此类实例中，一些或全部封端剂最终通过表面底涂剂从衬底移除。与 封端剂被表面底涂剂置换的传统表面底涂法不同，在本发明的一些实施例中，封端剂本身 能够用于进行衬底包封。
[0148] 在各种实施例中，一或多个层中可以掺杂有一或多种实体/试剂（例如可检测实 体、靶向实体或PEG)。一般来说，任何相关实体都可以用作根据本发明的掺杂剂实体。单一 掺杂剂实体（或层/衬底）可以对以多种模式进行的成像敏感。
[0149] 在一些实施例中，掺杂剂实体为可检测实体，包括（但不限于）SE(R)RS活性剂、荧 光染料（例如近红外（金属增强的焚光剂、2-光子焚光剂）、MRI试剂、光声活性染料、上转 换材料、正电子发射断层扫描（PET)示踪剂、单光子发射断层扫描（SPECT)示踪剂、计算机 断层扫描（CT)试剂、X射线试剂、超声波（US)试剂以及其组合。
[0150] 在一些实施例中，层可以掺杂有化合物/材料，例如（但不限于）SER(R)S活性染 料、（近红外）荧光染料、发光化合物、光声活性染料、上转换材料（例如由来自稀土金属和 /或过渡金属的群组的材料组成）、（激光）栗送材料（例如由（但不限于）来自基于稀土 金属和/或过渡金属的化合物的群组的材料组成）、"慢光"诱导材料（例如基于镨的化合 物）、MRI活性材料（例如由（但不限于）以下组成：稀土金属和/或过渡金属，例如钆、锰、 铁（其氧化物））。在一些实施例中，至少一个层掺杂有例如SERRS活性染料并且至少另一 层掺杂有例如近红外荧光染料。在某些实施例中，一些层不含掺杂剂，但用作两个含有掺杂 剂的壳层之间的间隔物和/或分隔物。层可以另外掺杂治疗剂，所述治疗剂由以下（但不 限于）组成：基于（放射性标记的）小分子、基于螯合剂、基于肽、基于蛋白质、基于抗体、基 于RNA、基于DNA、基于适体的化合物/材料，及其组合。
[0151] SE(R)RS活性剂
[0152] 在一些实施例中，掺杂剂实体为或包含染料，例如共振染料。掺杂剂实体可以是或 包含可用于拉曼光谱测定法的试剂（例如SE(R)RS活性剂）。示例性掺杂剂实体包括（但 不限于）此项技术中描述的那些试剂，例如美国专利第5, 306, 403号、第6, 002, 471号及 6, 174, 677中所述，其内容以引用的方式并入。
[0153] 在一些具体实施例中，掺杂剂实体为SE(R)RS活性剂和/或光声活性剂。在一些 具体实施例中，位于衬底附近的高密度SE(R)RS活性剂有助于通过本文中所描述的粒子实 现前所未有的拉曼灵敏度。SE(R)RS活性剂一般受益于金属表面附近的信号强度增强。根 据本发明，所属领域的技术人员将能够考虑例如衬底材料、衬底配置、层材料等因素来选择 SE(R)RS活性剂以实现化学增强和/或电磁增强。此类SE(R)RS活性剂可以具有从金属到 分子或从分子到金属的电荷转移作用。
[0154] SE(R)RS活性剂是指在适当照射时能够产生SERS或SE(R)RS光谱的分子。SE(R) RS活性剂的非限制性实例包括酞菁，例如甲基酞菁、亚硝酰基酞菁、磺酰基酞菁和氨基酞 菁；萘酞菁；基于硫族元素的染料；甲亚胺；花青；方酸；以及黄嘌呤，例如甲基衍生物、硝 基衍生物、磺基（sulphano)衍生物和氨基衍生物。可以任何常规方式取代这些物质中的每 一者，产生大量有用的标记。应注意，SE(R)RS活性剂的选择会受到例如分子的共振频率、 样品中存在的其它分子的共振频率等因素影响。
[0155] 通常，SE(R)RS信号检测涉及使用来自激光器的入射光。确切频率的选择将取决 于SE(R)RS活性剂和金属表面。对于例如银和金等贵金属表面来说，可见光谱或近红外光 谱中的频率大体上趋向产生更好的表面增强作用。然而，可以设想可使用例如在紫外线范 围内的其它频率的情形。适当光源的选择以及必要时使用适当的频率和功率进行调谐刚好 在所属领域的普通技术人员的能力范围内，尤其参考可用的SE(R)RS文献。
[0156] 拉曼增强一般与结合于（例如吸附于）金属表面上的SE(R)RS活性剂的密度成比 例。吸附于根据本发明的衬底表面上的极高密度的SE(R)RS活性剂可以促成本文揭示的粒 子的优良灵敏度。
[0157] 荧光剂
[0158] 在一些实施例中，掺杂剂实体为或包含荧光染料/试剂（例如近红外（NIR)荧光 染料）。举例来说，可根据本发明使用的荧光染料/试剂包括（但不限于）聚甲炔、花青、 (萘）酞菁、扑啉、部花青、芮（茈）（双酰亚胺）、方酸、花青素、藻青蛋白、氟硼荧、轮烷、若 丹明（rhodamine)、某些有机金属络合物。
[0159] 在一些实施例中，荧光染料/试剂借助于其中所述的合成方法而与衬底具有预定 距离。在一些实施例中，纳米粒子掺杂有近红外（NIR)荧光染料和其它试剂。
[0160] MRI试剂
[0161] 在一些实施例中，掺杂剂实体为或包含MRI试剂。在一些实施例中，与层结合的 MRI试剂的量或数目可以是约1到10, 000, 000种MRI试剂或约5000到500, 000种MRI试 剂。参看美国专利申请公开案第20120179029号，其内容以引用的方式并入。
[0162] MRI试剂的一些实施例可以为Gd(其盐）、氧化铁、顺磁性化学交换饱和转移 (CEST)试剂、19F活性材料、锰、黑色素，或缩短或延长T1或T2的物质，以及其组合。在某 些实施例中，GdMRI试剂可以是例如D0TA-Gd、DTPA-Gd、在聚合物螯合剂内的Gd，以及通过 负电荷固定于层上的Gd等化合物。在某些实施例中，在具有或不具有葡聚糖或其它稳定层 的情况下，氧化铁MRI试剂可以为例如小顺磁性氧化铁（SPI0)或超小SPI0等化合物。在 某些实施例中，顺磁性CESTMRI试剂可以是例如镧系络合物等化合物。
[0163] 在一些实施例中，MRI试剂可以通过例如顺丁烯二酰亚胺键等键、NHS酯、点击化 学（clickchemistry)或另一共价或非共价方法或其组合连接至层。在一些实施例中，MRI 试剂还可以在不添加任何外源试剂的情况下装载，即，仅有层和MRI试剂。
[0164] 作为MRI试剂的替代或除MRI试剂以外，一或多种其它试剂可以与粒子结合。示 例性诊断剂可以与粒子结合并且使用适当检测系统检测，所述诊断剂包括：PET(例如1SF、 64Cu、nC、13N、150等）、SPECT(例如"Tc、67Ga、192Ir等）、荧光染料（例如阿莱克萨（A1 exa) 647、 阿莱克萨488等）、放射性核素（例如发射α粒子的放射性核素（例如At-211、Bi-212、 Bi-213、Ra-223以及Ac-225)、发射β粒子的放射性核素（例如Cu-67、Y-90、Ag-111、 I-131、Pm-149、Sm-153、H〇-166、Lu-177、Re-186以及Re-188))等。在某些实施例中，放射 性核素的使用可以用于通过切伦科夫（Cerenkov)辐射诱导信号。
[0165] 除了可检测实体之外或作为其替代，本文所述的粒子可以使用掺杂剂实体制备， 所述掺杂剂实体为打算投与或递送的试剂。在一些实施例中，在投与粒子之后，此类试剂与 粒子保持结合；在一些实施例中，此类试剂在投与之后从粒子释放或以其它方式离解。
[0166] 多种掺杂剂实体中的任一种都可以根据本发明使用。举例来说，掺杂剂实体可以 为或包含任何治疗剂（例如抗生素、NSAID、血管生成抑制剂、神经保护剂）、细胞毒素剂、诊 断剂（例如对比剂；放射性核素；以及荧光部分、发光部分及磁性部分）、靶向试剂、预防性 试剂（例如疫苗）和/或营养剂（例如维生素、矿物质等），或适合于引入生物组织中的其 它物质，包括医药赋形剂和用于化妆品的物质等。示例性掺杂剂实体可以包括（但不限于） 治疗剂和/或成像剂。
[0167] 靶向试剂
[0168] 在一些实施例中，本文中所描述的拉曼纳米粒子包括一或多种靶向试剂以促进和 /或增加纳米粒子对患病组织的革E1向性。革E1向试剂包括例如各种特定的配体，例如抗体、单 克隆抗体和其片段、叶酸、甘露糖、半乳糖以及其它单糖、二糖和低聚糖，及RGD肽。靶向试 剂的其它实例包括（但不限于）核酸（例如RNA和DNA)、多肽（例如受体配体、信号肽、抗 生物素蛋白、蛋白质A及抗原结合蛋白）、多糖、生物素、疏水性基团、亲水性基团、药物以及 结合到受体的任何有机分子。
[0169] 在一些实施例中，靶向试剂是一种抗原结合蛋白（例如抗体或其结合部分）。抗 体可以使用已知方法产生，以允许抗原或免疫原（例如肿瘤、组织或病原体特异性抗原） 特异性靶向各种生物靶（例如病原体或肿瘤细胞）。此类抗体包括（但不限于）多克隆 抗体；单克隆抗体或其抗原结合片段；经修饰的抗体，例如嵌合抗体、重构抗体、人类化抗 体或其片段（例如Fv、Fab'、Fab、F(ab'）2);或生物合成抗体，例如单链抗体、单结构域抗 体（DAB)、Fv或单链Fv(scFv)。制备和使用多克隆抗体和单克隆抗体的方法是此项技术 中众所周知的，例如见于哈洛（Harlow)等人，抗体使用实验室手册：简明方案I(Using Antibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolI.)，冷泉港实验室（ColdSpring HarborLaboratory) (1998年12月1日）。用于制备经修饰的抗体和抗体片段（例如嵌 合抗体、重构抗体、人类化抗体，或其片段，例如Fab'、Fab、F(ab'）2片段）；或生物合成抗体 (例如单链抗体、单结构域抗体（DAB)、Fv、单链Fv(scFv)等））的方法是此项技术中已知的 并且可以见于例如左拉（Zola)，单克隆抗体：单克隆抗体和工程改造的抗体衍生物的制备 和使用(MonoclonalAntibodies:PreparationandUseofMonoclonalAntibodiesand EngineeredAntibodyDerivatives),斯普林格出版社（SpringerVerlag) (2000 年 12 月 15日；第1版）。
[0170] 在一些实施例中，靶向试剂是一种核酸（例如RNA或DNA)。在一些实例中，核酸 革巴向试剂被设计成通过碱基配对与特定核酸（例如染色体DNA、mRNA或核糖体RNA)杂交。 在其它情况下，核酸结合配体或生物靶。举例来说，核酸可以结合HIV的逆转录酶、Rev或 Tat蛋白质（图尔克（Tuerk)等人，基因（Gene) 137:33-9(1993));人神经生长因子（宾 克雷（Binkley)等人，核酸研究（Nuc.AcidsRes. )23:3198-205(1995));或血管内皮生长 因子（杰林克（Jellinek)等人，生物化学（Biochem. )83:10450-10456 (1994))。结合配 体的核酸可以通过已知方法鉴别，例如SELEX程序（参见例如美国专利第5, 475, 096号、第 5, 270, 163 号和第 5, 475, 096 号；及W0 97/38134、W0 98/33941 和W0 99/07724)。靶向试 剂也可以是结合到特定序列的适体。
[0171] 靶向试剂可以识别预先选择的生物靶（例如病原体或肿瘤细胞）上的多种已知表 位。在一些实施例中，靶向试剂使纳米粒子靶向由致癌基因表达的因子。这些可以包括（但 不限于）酪氨酸激酶（膜结合和细胞质形式），例如Src家族的成员；丝氨酸/苏氨酸激酶， 例如Mos;生长因子和受体，例如血小板源性生长因子（PDDG)、小GTP酶（G蛋白），包括ras 家族、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（cdk)，myc家族成员，包括c-myc、N-myc和L-myc，及 bcl-2家族成员。
[0172] 其它试剂
[0173] 根据本发明，粒子可以包括一或多种用于在投与/植入之后递送的试剂。此类试 剂可以是或包含小分子、大分子（即，高分子）或其任何组合。另外或或者，试剂可以是包 括例如液体、液体溶液、凝胶、水凝胶、固体粒子（例如微米粒子、纳米粒子）或其组合等多 种形式的调配物。
[0174] 在代表性非限制性实施例中，试剂可以选自氨基酸、疫苗、抗病毒剂、核酸（例如 siRNA、RNAi和微RNA试剂）、基因递送载体、白细胞介素抑制剂、免疫调节剂、神经营养因 子、神经保护剂、抗肿瘤剂、化学治疗剂、多糖、抗凝血剂、抗生素、止痛剂、麻醉剂、抗组织 胺、消炎剂、维生素和/或其任何组合。在一些实施例中，试剂可以选自可以为天然存在的、 合成的或重组产生的适合蛋白质、肽和其片段。
[0175] 在一些实施例中，试剂为或包含生物制剂。生物制剂的实例包括（但不限于） 单克隆抗体、单链抗体、适体、酶、生长因子、激素、融合蛋白、细胞因子、治疗性酶、重组疫 苗、血液因子以及抗凝血剂。适合根据本发明使用的示例性生物制剂论述于S.阿加沃尔 (S.Aggarwal),自然生物技术（NatureBiotechnology), 28:11,2010 中，其内容以引用的 方式并入本文中。
[0176] 在一些实施例中，根据本申请案的组合物和方法特别适用于递送一或多种治疗 剂。
[0177] 在一些实施例中，治疗剂是具有医药活性的小分子和/或有机化合物。在一些实 施例中，治疗剂为临床上使用的药物。在一些实施例中，治疗剂为或包含抗癌剂、抗生素、 抗病毒剂、麻醉剂、抗凝剂、酶抑制剂、类固醇试剂、消炎剂、抗肿瘤剂、抗原、疫苗、抗体、解 充血剂、抗高血压剂、镇静剂、节育剂、促孕剂、抗胆碱能剂、止痛剂、抗抑郁剂、抗精神病剂、 β-肾上腺素能阻滞剂、利尿剂、心血管活性剂、血管活性剂、抗青光眼剂、神经保护剂、血管 生成抑制剂等。
[0178] 示例性抗癌剂包括（但不限于）细胞因子、趋化因子、生长因子、光增敏剂、毒 素、抗癌抗生素、化学治疗性化合物、放射性核素、血管生成抑制剂、信号传导调节剂、抗代 谢物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗癌剂、抗生 素、免疫治疗剂、高温或高温疗法、细菌、辐射疗法以及此类试剂的组合。在一些实例中， 抗癌剂为顺钼（cisplatin)、卡钼（carboplatin)、吉西他滨（gemcitabine)、伊立替康 (irinotecan)、抗EGFR抗体、抗VEGF抗体以及其任何组合。
[0179] 根据本申请案使用的治疗剂可以为或包含可用于对抗炎症和/或感染的试 剂。治疗剂可以为抗生素。示例性抗生素包括（但不限于）β-内酰胺抗生素、大环 内酯、单环β-内酰胺类（monobactams)、利福霉素（rifamycin)、四环素、氯氨苯醇、 克林达霉素（clindamycin)、林可霉素（lincomycin)、夫西地酸（fusidicacid)、新生 霉素（novobiocin)、磷霉素（fosfomycin)、夫西地酸钠、卷曲霉素（capreomycin)、多 粘菌素（colistimethate)、短杆菌肽（gramicidin)、米诺环素（minocycline)、多西环 素（doxycycline)、杆菌肽（bacitracin)、红霉素（erythromycin)、萘啶酸（nalidixic acid)、万古霉素（vancomycin)以及甲氧节氨啼啶（trimethoprim)。举例来说，β-内酰 胺抗生素可以为安比西林（ampicillin)、阿洛西林（aziocillin)、氨曲南（aztreonam)、 卡本西林（carbenicillin)、头抱哌酮（cefoperazone)、头抱曲松（ceftriaxone)、头抱 噻啶（cephaloridine)、先锋霉素（cephalothin)、氯唑西林（cloxacillin)、拉氧头孢 (moxalactam)、青霉素G、哌拉西林（piperacillin)、替卡西林（ticarcillin)以及其任何 组合。其它抗微生物剂（例如铜）也可以根据本发明使用。举例来说，抗病毒剂、抗原生动 物剂、抗寄生虫剂等可能有用。另外或或者，治疗剂可以是消炎剂。
[0180] 治疗剂可以为医药活性剂的混合物。举例来说，局部麻醉剂可以与如类固醇等 消炎剂组合递送。局部麻醉剂也可以与例如肾上腺素等血管活性剂一起投与。再举一个 例子，抗生素可以与通常由细菌产生的酶抑制剂组合以使抗生素（例如青霉素和克拉维酸 (clavulanicacid))失活。
[0181] 在一些实施例中，治疗剂可以包括如此项技术中已知的治疗性基因。在一些实施 例中，治疗剂是非病毒载体。典型的非病毒基因递送载体包含DNA(例如，在细菌中产生的 质粒DNA)或RNA。在某些实施例中，借助于递送媒剂，根据本发明使用非病毒载体。递送媒 剂可以基于脂质（例如脂质体），其与细胞膜融合，从而将核酸释放到细胞的细胞质中。或 者或另外，肽或聚合物可以用于与核酸形成复合物（例如呈粒子形式），所述核酸在试图到 达靶目标时可以凝集并保护治疗活性。
[0182] 系统和仪器
[0183] 本发明的系统包括用于检测细胞和/或组织的拉曼光谱的检测器和相关部件。在 一些实施例中，此类系统包括激发源（例如光源）、用于将此类激发源导引到样品（例如细 胞和/或组织）的光学器件及用于检测此类样品的拉曼光谱的检测器。
[0184] 用于产生激发光的光源可以包括一或多种激光器，并且用于将激发光导引到靶组 织上和/或其中的光学器件被配置用于在对应于所述靶组织的宽视场内均匀地分散激发 光。举例来说，可以使用近红外（NIR)激光器，例如785nm二极管，300mW，和/或1064nm Nd:YAG激光器。
[0185] 在一些实施例中，高光谱宽视场成像装置是与CCD检测器和滤波器一起使用。举 例来说，整个宽视场的单色图像是在多种波长（例如一组有限的2到10个波长）中的每一 种下获得，每个波长对应于拉曼报告子的特征光谱峰。激光器可以是可调谐激光源。光学 器件可以包括可调谐激光线滤波器（LLF)和/或可调谐陷波滤波器（NF)，其中所述滤波器 是串联式厚体积布拉格光栅。所述多个单色图像可以通过检测器分析以对宽视场内的拉 曼报告子进行图形鉴别。显示R-MR纳米粒子报告子（指示肿瘤或其它异常组织）的位置 的图像可以例如叠加在宽视场的相应视频图像上，使外科医生能够观测此类组织并将其移 除，同时对周围健康组织造成有限的损害。
[0186] 所述系统可以允许对约5X5cm、10X10cm、20X20cm的宽视场进行扫描/成像。在 一些实施例中，视场是约 25cm2、50cm2、75cm2、100cm2、150cm2、200cm2、300cm2、400cm2、500cm2 或更大面积。R-MR纳米粒子的个别图像可以例如在数秒内，或不到一秒内采集，由此可以查 看一系列实时或近实时图像（例如每秒10个图像或超过10个图像，例如每秒20个或超过 20个图像）。
[0187] 在一些实施例中，本发明的系统包括用于检测细胞和/或组织的拉曼光谱的检测 器和相关部件，及用于治疗（例如消融和/或切除）检测到拉曼光谱的细胞和/或组织的 器具。在一些实施例中，此类系统包括激发源（例如光源）、用于将此类激发源导引到样品 (例如细胞和/或组织）上的光学器件、用于检测此类样品的拉曼光谱的检测器，及用于治 疗（例如消融和/或切除）检测到拉曼光谱的细胞和/或组织的器具。