专利名称：使用表面增强相干反斯托克斯拉曼光谱学检测少量分子的方法和设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用光谱学的分子检测和/或表征的领域。更具体地，本发明一般地涉及在生物学、生物化学和化学测试中使用的方法和设备，并特别涉及利用表面增强相干反斯托克斯拉曼光谱学(surface enhanced coherent anti-Stokes Raman spectroscopy，SECARS)对例如核酸的分子进行检测、识别或测序的方法、仪器以及仪器的使用。
背景技术：
对来自生物学样本或者其他样本的少量(＜1000)分子的灵敏和准确的检测和/或识别已经被证明是很难达到的目标，在医学诊断学、病理学、毒物学、环境采样、化学分析、法医学以及许多其他的领域具有广泛的潜在用途。已经尝试过使用拉曼光谱学(Ramanspectroscopy)和/或表面等离子共振实现这个目标。当光通过所关心的介质时，一定的量变得偏离其原始方向。这种现象叫做散射。由于a)光被介质吸收，b)介质中的电子激发到更高的能态，和c)随后的来自介质的在不同波长上的光发射，一些被散射光在频率上和原始激发光不同。当频率差和所关心介质的分子振动能级匹配时，这个过程叫做拉曼散射。拉曼发射光谱的波长是样本中吸收光的分子的化学组成和结构的特征，而光散射的强度依赖于样本中分子的浓度以及分子的结构。当拉曼散射中发射的光波长比激发光波长更长时，这叫做斯托克斯拉曼散射。当发射光的波长比激发光波长更短时，这叫做反斯托克斯拉曼散射。
在样本中，激发光束和各别分子之间发生拉曼相互作用的概率非常低，导致了拉曼分析的低灵敏度和有限的适用性。“光学截面(optical cross section)”是指示由特定分子或粒子引发的光学事件发生概率的术语。当光子打在分子上时，几何上打在分子上的光子中只有一些在光学上和所述分子相互作用。所述截面是几何截面和光学事件概率的乘积(multiple)。光学截面包括吸收截面(用于光子吸收过程)、瑞利散射截面或散射截面(用于瑞利散射)，以及拉曼散射截面(用于拉曼散射)(见Biomedical Optics Course(生物医学光学教程)，Oregon Graduate Institute(俄勒冈研究生院)，可在http:/lomlc.ogi.edu/classroom/ece532/class3/muadefinition.html以及http://omlc.ogi.edu/classroom/ece532/class3/musdefinition.html.得到)。
对于少量分子的光学检测和光谱学，期望大于10-16cm2/分子或更大的截面，并且大于10-21cm2/分子或更大的截面是必须的。典型的自发拉曼散射技术具有大约10ucm2/分子的截面，因此不适于单分子检测。
已经观察到接近粗糙的银表面的分子显示出增强的拉曼散射，这种增强高达6到7个数量级。这种表面增强拉曼光谱(SERS)效应和等离子共振现象相关，其中，由于金属中导电电子的集体耦合(collective coupling)，金属表面响应入射的电磁辐射而表现出显著的光学共振。实际上，金属表面能够起到增强电磁辐射的定域效应(localized effect)的微型“天线”的作用。对于拉曼光谱分析，位于这样的表面附近的分子表现出更加高的灵敏度。
通常，通过使用被附着到(attach to)作为光谱测量设备的样本室的一部分的基底的粗糙金属膜，或者通过将作为悬浮液的一部分的金属纳米粒子或胶体引入样本室来实现SERS。然后，将样本施加到这些金属表面。SERS技术能给出强的强度增强，高达1014到1016倍，但只是对于接近单分子检测范围的某些分子(例如染料分子、腺嘌呤、血色素和酪氨酸)(见Kneipp等人，Physical Review E，57(6)R6281-R6284(1998)；Nie等人，Science，2751102(1997))。但是，对于大多数其他分子，使用SERS技术的增强仍旧在103到106的范围内，这远远低于单分子检测所需的范围。
相干反斯托克斯拉曼散射(Coherent anti-Stokes Raman scattering，CARS)是一种四波混频过程，它将中心频率分别在ωp和ωsd的泵浦拉曼光束或光波与斯托克斯光束组合使用。当将ωp-ωs调谐成与分子中的给定振动模式共振时，从在2ωp-ωs的反斯托克斯频率处所得出的(resultant)散射光中可以观察到增强强度的CARS信号。和自发拉曼散射不同，CARS高度灵敏，并且能够在存在由单光子激发引起的背景荧光下被检测。(见Cheng等人，J.Phys.Chem.1051277(2001))。CARS技术给出大约105倍的强度增强，这产生了在大约10-25cm2/分子范围内的截面，对于单分子的光学检测和光谱学来说还是太小了。
理论上，如果将CARS和SERS技术组合使用，则对于大范围的分子，始终能够观察到高达大约10-21到10-16cm2/分子的截面。在这个范围内的增强将始终处于单分子检测的范围内。使用金属膜SERS技术((Chen等人，Phys.Rev.Lett.43946(1979)；Y.R.Shen，The Principles of Non-Linear Optics(非线性光学原理)，John Willey&Sons，1984，p.492).)已经展示了SERS和CARS，表面增强相干反斯托克斯拉曼散射(此后的SECARS)的组合。但是，使用这种金属膜技术观察到的增强并不在允许单分子检测的范围内。使用SERS金属膜技术的增强一般不像针对使用悬浮金属粒子的SERS技术所观察到的增强那么多。此外，为了获得109到1018倍或者更大的SECARS增强，必须针对每一种类型的分子仔细地调整特定条件。
在实现这些用于检测少量分子的增强时的部分问题是检测少量分子的能力既是灵敏度问题，也是背景噪声问题。如果要检测溶液中的特定荧光分子，则它必须是从与溶剂相关联的背景中可区分的。为了使得背景影响最小，必须使用可能的最小样本体积。这是因为这样的事实，即背景和样本体积成比例，而来自分子的信号却独立于样本体积的。因此，少量分子的拉曼检测可以使用10pL或更少的样本体积。在这种规模上利用了SERS和CARS技术的组合的微器件目前不可获得并且是未知的。存在对使用拉曼光谱学提高来自分子的信号增强的方法以及用于采用SECARS来检测少量分子的设备的需求。
为了使本发明可以被更好地理解，现在将仅通过举例并参考附图描述它的几个实施方案，在附图中图1是根据本发明的一个实施方案的同步SECARS系统的原理图，所述同步SECARS系统使用各种光学装置聚焦光束并且还收集来自样本的拉曼散射光；图2示出了图1的样本室区域。该图的标度是使得拉曼活性表面被定位在距分析物(analyte)几十纳米以内，以便实现本发明的增强；图3是100纳摩尔浓度脱氧腺苷一磷酸(dAMP)的SECARS光谱。这对应于大约1000个dAMP分子。A代表dAMP的处于730cm-1的SECARS信号(它对应于742nm，泵浦激光为785nm)并产生大约70,000次计数。B代表处于785nm的泵浦激光信号。C代表处于833nm的斯托克斯激光信号。光谱被收集了100毫秒。泵浦和斯托克斯激光大约2皮秒一个脉冲。泵浦激光的平均功率大约是500毫瓦，并且斯托克斯激光的平均功率是大约300毫瓦。
图4是脱氧腺苷一磷酸(dAMP)在相同的100纳摩尔浓度的比较SERS光谱。A代表处于730cm-1的dAMP的SERS信号(它对应于833nm，泵浦激光为785nm)并且只产生大约1,500次计数。光谱被收集了100毫秒。泵浦激光工作于连续波模式。泵浦激光的平均功率是大约500毫瓦，并且不使用斯托克斯激光。
图5是脱氧腺苷酸(dAMP)也在100纳摩尔浓度的比较CARS光谱。A代表dAMP的处于730cm-1的CARS信号(它对应于742nm，泵浦激光为785nm)，产生大约2,500次计数。B代表处于785nm的泵浦激光信号。C代表处于833nm的斯托克斯激光信号。光谱也被收集了100毫秒。泵浦和斯托克斯激光大约2皮秒一个脉冲。泵浦激光的平均功率大约是500毫瓦，并且斯托克斯激光的平均功率是大约300毫瓦。利用100毫秒光谱收集时间不能获取100纳摩尔dAMP的CARS光谱。
图6是脱氧腺苷酸(dAMP)在100皮摩尔浓度的SECARS。平均来说，在这个浓度只有单个dAMP分子产生信号。dAMP的SECARS信号(A)处于730cm-1(它对应于742nm，泵浦激光为785nm)，产生大约27,000次计数。B代表处于785nm的泵浦激光信号。C代表处于833nm的斯托克斯激光信号。光谱被收集了100毫秒。泵浦和斯托克斯激光大约2皮秒一个脉冲。泵浦激光的平均功率大约是500毫瓦，并且斯托克斯激光的平均功率是大约300毫瓦。
具体实施方案定义为了本公开的目的，下列术语具有下列含义。未定义的术语根据其平常且一般的含义来使用。
如这里所使用的，″a″或″an″可以表示一个或超过一个的项目。
如这里所使用的，“大约”表示在一个值的百分之十以内。例如，“大约100”将表示在90和110之间的值。
如这里所使用的，“多个”项目表示两个或更多个所述项目。
如这里所使用的，“微米通道(microchannel)”是任何具有在1微米(μm)和999μm之间的截面直径的通道，而“纳米通道(nanochannel)”则是任何具有在1纳米(nm)和999nm之间的截面直径的通道。在本发明的某些实施方案中，“纳米通道或者微米通道”可以是直径为大约999μm或者更小。“微流体通道(″microfluidic channel)”是液体在其中可以通过微流体流动而移动的通道。通道直径、流体粘度和流动速率对微流体流动的影响在本领域是公知的。
如这里所使用的，“可操作地耦合”表示在装置和/或系统的两个或更多个单元之间存在功能性相互作用。例如，如果将拉曼检测器195安排成使得它能够在单分子分析物210(例如核酸)通过样本室175、纳米通道、微米通道或微流体通道185时对其进行检测，则拉曼检测器195可以被“可操作地耦合”到流经室(flow through cell)(样本室)175、纳米通道、微米通道或微流体通道185。又例如，如果计算机200能获取、处理、储存和/或传送关于由拉曼检测器检测到的拉曼信号的数据，则拉曼检测器195可以被“可操作地耦合”到计算机200。
如这里所使用的，术语“分析物”210表示对于检测和/或识别所关心的任何原子、化学试剂(chemical)、分子、化合物、组合物或聚集体。分析物的实施例包括但不限于氨基酸、肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、类脂、激素、代谢物、细胞因子(cytokine)、趋化因子(chemokine)、受体、神经递质、抗原、变态反应原、抗体、底物(substrate)、代谢物、辅因子、抑制剂、药(drug)、药物(pharmaceutical)、营养素、朊毒体(prion)、毒素、毒物、爆炸物、杀虫剂、化学战剂、生物危险制剂、放射性同位素、维生素、杂环芳香族化合物、致癌物质、诱变剂、镇静剂、安非他明、巴比妥酸盐、迷幻剂、废物(waste product)和/或污染物。在本发明的某些实施方案中，如下面公开的那样，可以用一个或更多个拉曼标记(Raman label)来标记一个或更多个分析物。
使用术语“标记”指任何原子、分子、化合物或组合物，它们可以被用来识别被所述标记附着的分析物210。在本发明的各种实施方案中，这种附着(attachment)可以是共价的或非共价的。在非限制性的实施例中，标记可以是荧光性的、磷光性的、发光的(luminescent)、电致发光的、化学发光的，或者可以是任何大基团(bulky group)，或者可以表现出拉曼或其他光谱特性。
“拉曼标记”可以是任何能够产生可检测拉曼信号的有机或无机分子、原子、复合物或结构，包括但不限于合成分子、染料、自然产生的色素(例如藻红蛋白)、有机纳米结构(例如C60、巴基球(buckyball)和碳纳米管)、金属纳米结构(例如金或银纳米粒子或纳米棱镜(nanoprism))以及纳米规模的半导体(例如量子点(quantum dot))。下面公开了许多拉曼标记的实施例。本领域普通技术人员将发现，这些实施例不是限制性的，并且“拉曼标记”包含在本领域公知的可通过拉曼光谱学检测的任何有机或无机原子、分子、化合物或结构。
如这里所使用的，术语“纳米晶体硅(nanocrystalline silicon)”指包括纳米规模的硅晶体的硅，典型地在从1到100纳米(nm)的尺寸范围内。“多孔硅”220指已经被刻蚀或者被处理以形成多孔结构。
表面增强相干反斯托克斯拉曼光谱学本发明的一个实施方案涉及通过使用表面增强相干反斯托克斯拉曼光谱学(此后的“SECARS”)——表面增强拉曼光谱学(此后的“SERS”)与相干反斯托克斯拉曼散射(此后的“CARS”)的组合——检测少量(＜1000)分子的设备和方法。本发明的设备和方法涉及在目标区域发出不同拉曼波长的斯托克斯光和泵浦光，所述目标区域由要被检测和/或识别的分子和拉曼活性表面之间的界面所限定。在一个实施方案中，拉曼活性表面可操作地耦合到一个或更多个拉曼检测单元195。
参考图1，在一个实施方案中，设备从源120和125分别提供两个输入激发电磁辐射束或波130和135。这些源可以各自包括普通光源，带有合适的滤光器和准直器，或者优选地，利用两个二极管激光器、固体激光器、离子激光器等等来提供这些源。这些激光器可以具有任何特定的尺寸；但是，因为人们期望实施本发明的方法以作为微器件的一部分，所以优选使用微激光器(microlaser)。合适的源包括但不限于来自SpectraPhysics的166型514.5nm线氩离子激光器、氪离子激光器(Innova 70，Coherent)的647.1nm线；处于337nm的氮激光器(Laser Science Inc.)；处于325nm的氦镉激光器(Liconox，见No.6,174,677号美国专利)；Nd:YLF激光器，和/或各种离子激光器和/或染料激光器；垂直腔表面发射激光器(“VCSEL”)(德克萨斯州Richardson的Honeywell或马萨诸塞州Southbridge的Schott)；其他微激光器，例如纳米线激光器(见Huang等人，Science(科学)2921897(2001))；处于532nm波长的倍频Nd:YAG激光器或者处于700nm和1000nm之间的任何波长的倍频钛:蓝宝石激光器；或者发光二极管。
表面增强CARS的信号强度依赖于输入泵浦束的强度；但是，界面上的最大激光强度经常受光学损伤的限制。由于这个原因，最好使用具有高峰值功率的比典型的连续波激光束更短的泵浦脉冲激光束。连续波(“CW”)激光器在高峰值功率水平通常供给微瓦到瓦，而脉冲激光器在以相同的平均功率工作时，在高峰值功率水平供给千瓦到千兆瓦。这产生了仍旧在光学损伤阈值以下的更强的信号。脉冲的宽度从大约100纳秒到大约80飞秒变动。通常，从大约100飞秒到大约7皮秒的脉冲宽度产生最佳的结果，取决于束的峰值功率和谱线宽度。
可以使用脉冲激光束或者CW激光束。当使用激光时，输入束必须同步，以便确保这些束的交迭(overlap)。这可以通过合适的激光控制器或者其他类型的同步电子装置110来实现。商业上可获得的可使用的电子设备的实施例包括但不限于Lok-to-Clock设备(Spectra-Physics)或SynchroLock设备(Coherent)。这些电子设备可能需要未在图中绘出的额外的光电二极管和分束器用于其工作。另外的实施方案使用光学参量振荡器(OPO)，所述光学参量振荡器接受输入的单个激光束并产生两个处于不同可调谐波长的同步束。
可以调整泵浦波的波矢量以便满足表面相位匹配条件2k1-k2＝ka(ωa)＝K′(ωa)其中，k1是第一束的波矢量；k2是第二束的波矢量；ka(ωa)是反斯托克斯信号的波矢量；K′(ωa)是表面EM波的波矢量。
有几种将这两束光传递到样本的方法。如图1中所示，SECARS设备的一个实施方案可以使用标准的全场光学装置(full field optics)或共焦光学装置(confocal optics)，例如反射镜145和150，以及分色镜(dichoric mirror)155和/或棱镜140的串联，将输入束130和135导入样本室。这些束可以通过半圆柱镜(直角或者等边的)或物镜160聚焦，物镜160由例如玻璃或石英的透明材料制成。这些聚焦透镜的实施例，包括但不限于可从尼康、蔡斯、奥林巴斯和Newport获得的显微镜物镜，例如6X物镜(Newport，Model L6X)或100X物镜(尼康，Epi 100x消色差透镜)。使用聚焦透镜160将激发束聚焦在包含拉曼活性表面和分析物的区域上，并收集来自所述样本的拉曼散射光。
这些束可以可选择地通过改变束的性质或者降低背景信号的其他设备，例如偏振器、狭缝、额外的透镜、全息分束器和/或陷波滤波器、单色仪、二色滤光器、带通滤波器、反射镜、遮光滤光器，以及共焦针孔，等等。例如，全息分束器(Kaiser Optical Systems，Inc.，HB 647-26N18型)为激发束135和被发射的拉曼信号产生了直角几何构形。可以使用全息陷波滤波器(Kaiser Optical Systems，Inc.)降低瑞利散射辐射。同样地，在光谱上可以纯化激发束130和135，例如利用带通滤波器(Corion)。
聚焦透镜将光165聚焦在光学上可透射的样本室175中，在图2A和2B中更详细地示出了样本室175。如图2A和B中所示，光被聚焦在包含通常被示为210的要被检测的分析物和拉曼活性表面之间的界面的区域中，在下面更详细地描述了拉曼活性表面。
本发明的某些实施方案是关于使用各种形式的拉曼表面。例如，拉曼活性表面包括但不限于金属表面，220和230，或270和280，例如一层或更多层用金属或其他导电材料涂敷的纳米晶体和/或多孔硅；粒子240，例如金属纳米粒子；粒子的聚集体250，例如金属纳米粒子聚集体；粒子胶体(240及离子化合物260)，例如金属纳米粒子胶体；或它们的组合。
从分析物和拉曼活性表面之间的界面发射的反斯托克斯辐射束190从样本室传出，并作为相干束传播，所述相干束被共焦或标准光学装置收集，并可选择地耦合到单色仪，用于光谱分解(spectral dissociation)。利用拉曼检测器195检测所述束。反斯托克斯束的高度方向性的输出使得即使在存在很强的发光背景下也允许其检测。
拉曼检测单元拉曼检测单元并非特别重要，并且可以是任何具有足以检测少量特定分析物分子的灵敏度和速度的通用光学检测器。可与冷却型电荷耦合器件(“CCD”)阵列比拟的灵敏度是足够的。检测的速度在毫秒到纳秒范围以内。拉曼检测单元可以包括大面积或小面积检测器、检测器阵列，等等。这种检测器的实施例包括光电二极管、雪崩光电二极管、CCD阵列、互补金属氧化物半导体(CMOS)阵列，强化CCD，等等。优选CCD、CMOS和雪崩光电二极管。差分检测器195产生指示贯穿反斯托克斯波或束190位置的光强变化的电输出信号；支配强吸收的SECARS效应将发生在由被测试样本中的材料所确定的特定角度或强度。这些电信号被采样/计数并被数字化，并通过相关联的电路(未示出)馈至适当的数据分析装备(统称200)，所述数据分析装备可以包括信息处理和控制系统或计算机。
拉曼检测单元15的实施例包括但不限于带有作为单光子计数模型(RCA C31034型或者Burle Indus.C3103402型；见No.5,306,403号美国专利)工作的砷化镓光电倍增管的Spex 1403型双光栅分光光度计；配备有红增强强化电荷耦合器件(red-enhancedintensified charge-coupled device，RE-ICCD)检测系统(Princeton Instruments)的ISA HR-320摄谱仪；傅立叶变换摄谱仪(基于麦克尔干涉仪)，电荷注入器件；光电二极管阵列，包括雪崩光电二极管阵列；InGaAs检测器；电子倍增CCD；强化CCD和/或光电晶体管阵列。
信息处理和控制系统或计算机和数据分析在本发明的某些实施方案中，所述装置可以包括信息处理系统或计算机200。所公开的实施方案不限制所使用的信息处理系统或计算机200的类型。示例性的信息处理系统或计算机可以包括用于沟通信息的总线和用于处理信息的处理器。在本发明的一个实施方案中，所述处理器是从Pentium系列处理器中选择的，包括但不限于可从英特尔公司(SantaClara，CA)获得的PentiumII系列、PentiumIII系列以及Pentium4系列处理器。在本发明另外的实施方案中，所述处理器可以是Celeron、Itanium、Pentium Xeon处理器(英特尔公司，Santa Clara，CA)。在本发明各种其他的实施方案中，所述处理器可以基于Intel体系结构，例如IntelIA-32或IntelIA-64体系结构。另外也可以使用其他的处理器。
信息处理和控制系统或计算机200还可以包括随机访问存储器(RAM)或其他的动态储存设备、只读存储器(ROM)或其他静态储存和数据储存设备，例如磁盘或光盘及其对应设备的。信息处理和控制系统或计算机200还可以包括本领域已知的任何外围设备，例如存储器、显示设备(例如阴极射线管或液晶显示器(LCD))、字母数字输入设备(例如键盘)、光标控制设备(例如鼠标、跟踪球或光标方向键)，以及通讯设备(例如调制解调器、网络接口卡或用于耦合到以太网、令牌环或其他类型的网络的接口设备)。
来自检测单元195的数据可以由处理器处理，并且数据被储存在存储器(例如主存储器)中。关于标准分析物的发射分布图的数据也可以储存在存储器(例如主存储器或者ROM)中。处理器可以比较来自分析物分子210的样本和拉曼活性表面的发射光谱，以便识别样本中分析物的类型。例如，当检测到作为核苷酸识别的一部分的交迭的信号，信息处理系统可以执行诸如减去背景信号以及“碱基识别(base-calling)”确定的过程。要理解，不同配备的计算机200可以用于某些实施。因此，在本发明的不同实施方案中，系统的结构可能变化。
虽然这里公开的方法可以在被编程的处理器控制之下执行，但是在本发明另外的实施方案中，这些过程可以全部或部分地由任何可编程或硬编码逻辑实施，例如现场可编程门阵列(FPGA)、TTL逻辑或专用集成电路(ASIC)。此外，所公开的方法可以由被编程的通用计算机200部件和/或定制硬盘部件的组合执行。
跟随着数据收集操作，通常将数据报告给数据分析操作。为了使分析操作更容易，通常将使用例如如上所述的数字计算机来分析检测单元195所获取的数据。通常，将针对接收和储存来自检测单元195的数据以及针对所述被收集的数据的分析和报告适当地对计算机编程。
在本发明的某些实施方案中，可以使用定制设计软件包来分析从检测单元195获取的数据。在本发明另外的实施方案中，可以使用信息处理系统或计算机200以及可公开获得的软件包执行数据分析。可获得的用于DNA序列分析的软件的非限制性实施例包括PRISMTMDNA测序分析软件(Applied Biosystems，加利福尼亚州的Foster City)、SequencherTM包(密歇根州Ann Arbor的Gene Codes)，以及可通过国家生物技术信息机构在网站、www.nbif.org/links/1.4.1.php获得的各种软件包。
拉曼活性表面A.纳米粒子、聚集体，以及胶体在本发明的某些实施方案中，拉曼活性表面由金属纳米粒子240提供，金属纳米粒子240可以单独使用或者与其他的拉曼活性表面组合使用，用于进一步增强从分析物210的少量分子获取的拉曼信号，其他的拉曼活性表面例如具有230的金属涂敷多孔硅基底220。在本发明的各种实施方案中，纳米粒子是银、金、铂、铜、铝或其他导电材料，尽管可以使用任何能够提供SECARS信号的纳米粒子。特别优选由银或金制成的粒子。
粒子或胶体表面可以具有各种形状和尺寸。在本发明的各种实施方案中，可以使用直径在1纳米(am)和2微米(μm)之间的纳米粒子。在本发明可供选择的实施方案中，可以使用2nm到1μm、5nm到500nm、10nm到200nm、20nm到100nm、30nm到80nm、40nm到70nm或50nm到60nm直径的纳米粒子。在本发明的某些实施方案中，可以使用具有10到50nm、50到100nm或大约100nm平均直径的纳米粒子。如果与其他拉曼活性表面(例如金属涂敷多孔硅基底)组合使用，则纳米粒子的尺寸将取决于所使用的其他表面。例如，可以选择具有230的金属涂敷多孔硅220中的孔的直径，以便所述纳米粒子适于在这些孔里。
纳米粒子在形状上可以大致是球形的、圆柱形的、三角形的、杆状的、带棱的(edgy)、多面的(multi-faceted)、棱柱形的(prism)、或者有尖头的(pointy)，尽管可以使用任何规则或不规则形状的纳米粒子。制备纳米粒子的方法发是已知的(例如见No.6,054,495、6,127,120、6,149,868号美国专利；Lee和Meisel，J.Phys.Chem.863391-3395，1982)。在Jin等的“Photoinduced conversion of silver nanospheres to nanoprisms(从银纳米球到纳米棱柱的光诱导转化)”，Science 2941901，2001中描述了纳米棱镜。也可以从商业来源获取纳米粒子(例如Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY；Polysciences，Inc.，Warrington，PA)胶体和聚集体在本发明的某些实施方案中，纳米粒子可以是单一纳米粒子240，和/或纳米粒子的随机胶体(240及离子化合物260)。纳米粒子胶体通过标准技术合成，例如通过将诸如NaCl的离子化合物260添加到纳米粒子240中(见Lee和Meisel，J.Phys.Chem863391(1982)；J.Hulteen等人，″Nanosphere LithographyA materials general fabrication process forperiodic particle array surfaces，(纳米球光刻法用于周期粒子阵列表面的材料常规制作方法)″J.Vac.Sci.Technol.A 131553-1558(1995))。
可以利用“耗尽机制(depletion mechanism)”来诱导聚集体，其中，由于纳米粒子从两种紧密接近的纳米粒子之间的区域耗尽，添加非吸附性纳米粒子有效地导致了吸引电势(见J.Chem.Phys.，110(4)2280(1999))。
在本发明其他的实施方案中，纳米粒子240可以被交联，以产生特定的纳米粒子聚集体250，例如二聚体、三聚体、四聚体或其他聚集体。用于SECARS检测的“热点”的形成可以和特定聚集体250或纳米粒子胶体(240及离子化合物260)相关联。本发明的某些实施方案可以使用不同尺寸的聚集体或胶体的非均匀混合物(heterogeneous mixture)，而其他的实施方案可以使用纳米粒子240和/或聚集体250或胶体(240及离子化合物260)的同质群体(homogenous population)。在本发明的某些实施方案中，可以利用已知技术，例如在蔗糖梯度溶液中的超速离心来浓缩或纯化包含选择数量的纳米粒子的聚集体250(二聚体、三聚体等)。在本发明的各种实施方案中，使用尺寸大约为100、200、300、400、500、600、700、800、900到100nm或更大的纳米粒子聚集体250或胶体(240及离子化合物260)。在本发明的特定实施方案中，纳米粒子聚集体250或胶体(240及离子化合物260)的尺寸可以在大约100nm和大约200nm之间。
交联纳米粒子形成聚集体的方法在本领域也是已知的(参见，例如Feldheim，″Assembly of metal nanoparticle arrays using molecular bridges，(采用分子桥的金属纳米粒子阵列集合)”The Electrochemical Society Interface，Fall，2001，pp.22-25)。例如，金纳米粒子可以被交联，例如，采用带有末端硫醇或巯基的双官能连接体(linker)化合物(Feldheim，2001)。在本发明的一些实施方案中，可以利用硫醇基在两端衍生单连接体化合物。在与金纳米粒子反应以后，所述连接体就将形成纳米粒子二聚体，所述的纳米粒子二聚体被所述连接体的长度所隔开。在本发明的其他实施方案中，可以使用具有三个、四个或更多个硫醇基的连接体，以便同时附着多个纳米粒子(Feldheim，2001)。相对于连接体化合物使用过量纳米粒子防止多交联(multiple cross-link)形成和纳米粒子沉淀。利用本领域已知的标准合成方法也可以形成银纳米粒子的聚集体。
在本发明的其他实施方案中，纳米粒子240聚集体250或胶体(240及离子化合物260)可以被共价地附着到分析物210的分子样本。在本发明可选的实施方案中，分析物210的分子样本可以被直接附着到纳米粒子240，或者可以被附着到连接体化合物，所述连接体化合物被共价或非共价地结合到所述的纳米粒子聚集体250。
也可以使用各种已知的用于交联纳米粒子的方法将分析物210的分子附着到纳米粒子或其他的拉曼活性表面。预期用来附着分析物210的分子的连接体化合物几乎可以具有任意长度，从大约0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、30、35、40、45、50、55、60、65、60、80、90到100纳米甚至更大的长度的范围。本发明的某些实施方案可以使用不同长度的连接体。
在被公开的本发明的一个实施方案中，当分析物210的分子沿通道185往下运动时，它们可以被附着到纳米粒子240，形成分子-纳米粒子复合物。在本发明的某些实施方案中，可供交联反应发生的时间长度可能非常有限。这些实施方案可以利用具有快速反应速度的高反应性交联基团，例如环氧化物基团、叠氮基基团、芳基叠氮基基团、三嗪基团或重氮基基团。在本发明的某些实施方案中，可以通过用例如激光的强光曝光使交联基团光活化。例如，重氮基或叠氮基化合物的光活化分别导致高反应性的卡宾和氮宾部分(moiety)的形成。在本发明的某些实施方案中，可以选择反应性基团以使它们只能将纳米粒子240附着到分析物210而不能使纳米粒子240彼此交联。能够结合到分析物210的反应交联基团的选择和制备在本领域是已知的。在本发明可选的实施方案中，分析物210自身可以被共价改性，例如利用能够附着到金纳米粒子240的巯基基团。
在本发明其他的实施方案中，可以用衍生的硅烷，例如氨基硅烷、3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(GOP)或氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)涂敷纳米粒子或者其他拉曼活性表面。可以使用硅烷末端的反应性基团形成交联的纳米粒子240的聚集体。预期所使用的连接体化合物几乎可以具有任意长度，范围从大约0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、21、22、23、24、25、27、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90到100nm甚至更大的长度变化。本发明的某些实施方案可以使用不同长度的连接体。也可以使用标准方法将这些被改性的硅烷共价地附着到分析物210。
在本发明的另一个可选的实施方案中，纳米粒子在其被附着到连接体化合物之前可以被改性成包含各种反应性基团。在商业上可获得经过改性的纳米粒子，例如来自Nanoprobes，Inc.(纽约州的Yaphank)的Nanogold纳米粒子。可以利用每个纳米粒子所附着的单个或多个马来酰亚胺、胺或其他的基团获得Nanogold纳米粒子。为了使在电场中操纵纳米粒子更容易，也可以获得带正电或带负电形式的Nanogold纳米粒子。可以将这种经过改性的纳米粒子附着到各种已知的连接体化合物以便提供纳米粒子的二聚体、三聚体或其他的聚集体。
所使用的连接体化合物的类型不是限制性的，只要它导致产生将在溶液中不沉淀的小的纳米粒子聚集体250和/或分析物。在本发明的某些实施方案中，连接体基团可以包括苯乙炔聚合物(Feldheim，2001)。另外，连接体基团可以包括聚四氟乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯或其他已知的聚合物。使用的连接体化合物不限于聚合物，而是可以包括其他类型的分子，例如硅烷、链烷、衍生的硅烷或衍生的链烷。在本发明的特定实施方案中，可以使用化学结构相对简单的连接体化合物，例如链烷或硅烷，以便避免干扰由分析物发射的拉曼信号。
另外，所使用的连接体化合物可以包含单个反应性基团，例如硫醇基。包含单个被附着的连接体化合物的纳米粒子可以自聚集为二聚体，例如通过附着到两个不同纳米粒子的连接体化合物的非共价相互作用。例如，连接体化合物可以包括链烷硫醇。跟随着将硫醇基附着到金纳米粒子，链烷基团倾向于通过疏水作用而缔合(associate)。在本发明其他可选的实施方案中，连接体化合物可以在任一端包含不同的官能团。例如，连接体化合物可以在一端包含巯基，以便允许附着到金纳米粒子，并且在另一端包含不同的反应性基团，以便允许附着到其他的连接体化合物。在本领域已知很多这样的反应性基团，并且它们可以在本方法和装置中使用。
在本发明其他的实施方案中，分析物210可以与纳米粒子240的表面紧密缔合，或者可以非常接近纳米粒子240(在大约0.2到1.0nm之间)。如这里所使用的，术语“与……紧密缔合”指被附着(共价或非共价)或吸附在拉曼活性表面上的分析物分子样本。本领域的熟练技术人员将认识到，为了通过SECARS产生表面增强拉曼信号，不要求分析物210的分子样本共价附着到纳米粒子240。
b.金属涂敷和非金属涂敷的纳米晶体和/或多孔硅在本领域已知各种产生粗糙或高表面面积表面的方法，例如纳米晶体硅(例如Petrova-Koch等人，″Rapid-thermal-oxidized porous silicon-the superior photoluminescent Si，(快速热氧化的多孔硅——优良的光致发光硅)″Appl.Phys.Lett.61943，1992；Edelberg等人，″Visible luminescence from nanocrystalline silicon films produced by plasma enhancedchemical vapor deposition，(来自由等离子增强化学汽相沉积制备的纳米晶体硅膜的可见光发光)″Appl.Phys.Lett.，681415-1417，1996；Schoenfeld等人，″Formation of Si quantumdots in nanocrystalline silicon，(在纳米晶体硅中硅量子点的形成)″Proc.7th Int.Conf.onModulated Semiconductor Structures，Madrid(第七届调制半导体结构国际会议(马德里)论文集)，pp.605-608，1995；Zhao等人，″Nanocrystalline Sia material constructed by Siquantum dots，(纳米晶体硅由硅量子点构建的材料)″lst Int.Con，on Low DimensionalStructures and Devices，Singapore(第一届低维结构和器件国际会议(新加坡))，pp.467-471，1995；Lutzen等人，″Structural characteristics of ultrathin nanocrystalline silicon films formedby annealing amorphous silicon(由退火非晶硅形成的超薄纳米晶体硅膜的结构特征)″，J.Vac.Sci.Technology B 162802-05，1998；No.5,770,022、5,994,164、6,268,041、6,294,442、6,300,193号美国专利)。这里所公开的方法和装置不受产生粗糙或高表面面积基底的方法限制，并且预期可以使用任何已知的方法。
例如，产生纳米晶体硅的方法包括但不限于硅(Si)注入富硅氧化物并退火；利用金属成核催化剂的固相结晶化；化学汽相沉积；PECVD(等离子增强化学气相沉积)；气体蒸发；气相热解；气相光热解(photopyrolysis)；电化学刻蚀；硅烷和聚硅烷的等离子分解；高压液相还原-氧化反应；非晶硅层的快速退火；使用LPCVD(低压化学汽相沉积)沉积非晶硅层，跟着是RTA(快速热退火)周期；使用硅阳极的等离子电弧沉积和硅的激光烧蚀(laser ablation)(No.5,770,022、5,994,164、6,268,041、6,294,442、6,300,193号美国专利)。依赖于工艺，从1到100nm或更大的任何尺寸的Si晶体可以作为芯片上的薄层、单独的层和/或聚集的晶体来被形成。在本发明的某些实施方案中，可以使用包括附着到基底层220的纳米晶体硅的薄层。
但是，针对起始材料的组成，这些实施方案不受限制，并且，在本发明可选的实施方案中，预期可以利用其他的材料，唯一的要求是材料必须能够形成可用拉曼敏感金属涂敷的基底220或270，如图2中举例说明的那样。
在本发明的某些实施方案中，例如为了优化金属涂敷的多孔硅(具有230的220)的等离激元共振频率，可以选择硅晶体的尺寸和/或形状和/或多孔硅中的孔尺寸处于预先确定的限度以内(例如见No..6,344,272号美国专利)。通过控制涂敷多孔硅220的金属层230的厚度，也可以调整等离激元共振频率(No.6,344,272号美国专利)。用于控制纳米规模硅晶体的技术是已知的(例如No.5,994,164和6,294,442号美国专利)。
1.多孔硅如上面所讨论的那样，粗糙表面基底220不限于纯硅，而是也可以包括氮化硅、锗和/或其他已知的用于芯片制造的材料。也可以存在其他的少量材料，例如金属成核催化剂和/或掺杂剂。唯一的要求是基底材料必须能够形成可用拉曼敏感金属或其他的导电或半导体材料230或280涂敷的基底220或270，如图2中举例说明的那样。多孔硅具有高达783m2/cm3的大表面积，为表面增强拉曼光谱学技术提供了非常大的表面。
如本领域已知的那样，可以通过在电化学池(electrochemical cell)中利用稀释的氢氟酸(HF)刻蚀硅基底产生多孔硅220。在某些情况下，最初可以以低电流密度在HF中刻蚀硅。在形成初始孔以后，可以从电化学池中将硅除去并在非常稀的HF中刻蚀，以便加宽在电化学池中形成的孔。硅基底的组成也将影响孔尺寸，取决于硅是否被掺杂、掺杂剂的类型以及掺杂程度。掺杂对硅孔尺寸的影响在本领域是已知的。对于本发明的涉及检测和/或识别大生物分子的实施方案，可以选择大约2nm到100nm或200nm的孔尺寸。在本发明的特定实施方案中，还可以选择多孔硅中孔的取向。例如，被刻蚀的1，0，0晶体结构将具有取向垂直于晶体的孔，而1，1，1或1，1，0晶体结构将具有对角取向沿着晶轴的孔。晶体结构对孔取向的影响在本领域也是已知的。为了增强拉曼信号并降低背景噪声，晶体组成和孔隙性也可以被调节，以便改变多孔硅的光学性质。多孔硅的光学性质在本领域是公知的(例如Cullis等人，J.Appl.Phys.82909-965，1997；Collins等人，Physics Today 5024-31，1997)。
在本发明的各种实施方案中，通过用例如聚甲基丙烯酸甲酯的任何已知的抗蚀剂化合物涂敷，可以保护硅晶片的一些部分免受HF刻蚀。使用例如光刻法的平版印刷方法将硅晶片的一些被选择的部分暴露给HF刻蚀在本领域是公知的。为了控制用被用于拉曼光谱学的多孔Si腔的尺寸和形状，选择性刻蚀可能是有用的。在本发明的某些实施方案中，可以使用直径大约是1μm(微米)的多孔硅腔。在本发明的其他实施方案中，可以使用宽度大约是1μm的多孔硅沟槽或通道。多孔硅腔的尺寸不是限制性的，并且预期可以使用任何尺寸或形状的多孔硅腔。例如，对于尺寸为1μm的激发激光，1μm的腔尺寸可能是有用的。
上面公开的示范性方法对于产生多孔硅基底220不是限制性的，并且预期可以使用任何本领域已知的方法。用于制作多孔硅基底220的方法的非限制性实施例包括硅晶片或栅网(mesh)的阳极浸蚀；电镀；以及沉积含硅/氧的材料，跟着是受控退火(例如Canham，″Silicon quantum wire array fabrication by electrochemical and chemical dissolution of wafers，(通过晶片的电化学和化学溶解制造硅量子线阵列)″Appl.Phys.Lett.571046，1990；No.5,561,304、6,153,489、6,171,945、6,322,895、6,358,613、6,358,815、6,359,276号美国专利)。在本发明的各种实施方案中，多孔硅层220可以被附着到一个或更多个支撑层，例如本体硅、石英、玻璃和/或塑料。在某些实施方案中，可以使用例如氮化硅的刻蚀停止层控制刻蚀的深度。
在本发明某些可选的实施方案中，预期在金属涂敷230之前或之后，可以对多孔硅基底220进行额外的改性。例如，在刻蚀以后，多孔硅基底220可以被使用本领域已知的方法氧化为氧化硅和/或二氧化硅。例如可以使用氧化来提高多孔硅基底220的机械强度和稳定性。或者，具有230的金属涂敷的硅基底220可以受到进一步的刻蚀，以便除去硅材料，剩下可以保持中空或者可以用其他材料填充的金属壳，所述其他材料例如额外的拉曼活性材料。
2.硅基底的金属涂敷可以通过本领域已知的任何方法，利用例如金、银、铂、铜或铝的拉曼活性材料涂敷硅基底220或270。非限制性的示例性方法包括电镀；阴极电迁移；金属蒸发和溅射；使用籽晶来催化镀覆(plating)(例如使用铜/镍籽晶来镀覆金)；离子注入；扩散；或本领域已知的任何其他用于在硅基底220或270上镀覆薄金属层的方法。(例如见Lopez和Fauchet，″Erbium emission form porous silicon one-dimensional photonic band gap structures，(铒发射形成多孔硅一维光子带隙结构)″Appl.Phys.Lett.773704-6，2000；No.5,561,304、6,171,945、6,359,276号美国专利。)金属涂敷的另一种非限制性实施例包括无电镀镀覆(例如Gole等人，″Patterned metallization of porous silicon from electroless solution for directelectrical contact，(用于直接电接触体的由无电镀溶液进行的多孔硅图案化敷金属法)″J.Electrochem.Soc.1473785，2000)。可以控制金属层的组成和/或厚度以便优化具有230的金属涂敷的硅220或具有280的金属涂敷的硅270的等离激元共振频率。
在本发明可选的实施方案中，用于分析物检测的拉曼活性表面可以包括被选择的不同类型的拉曼活性表面的组合，例如金属涂敷、纳米晶体、多孔硅基底与金属涂敷的纳米晶体、多孔硅纳米粒子的固定化胶体(immobilized colloid)的组合。这种组成将具有非常高的拉曼活性金属表面面积，对于在溶液中的分析物具有相对较小的通道。尽管这对于例如大蛋白质或核酸的大的分析物分子不那么有利，但是它可以对小分子分析物(例如单个核苷或氨基酸)提供更好的灵敏度和检测。
流动路径，通道以及微型机电系统(MEMS)如在图1中举例说明的那样，在本发明的某些实施方案中，分析物210的分子样本被沿着例如微流体通道、纳米通道或微米通道185和/或样本室175的流动路径或通道向下移动，并经过装置的检测单元195。根据这些实施方案，拉曼活性表面和分析物可以被合并到更大的装置和/或系统中。在某些实施方案中，拉曼活性表面可以被合并到微型机电系统中(MEMS)。
MEMS是集成系统，包括机械元件、传感器、致动器以及电子装置。所有那些部件可以通过已知的微制造技术在公共芯片(common chip)上制造，所述公共芯片包括硅基的或等效的衬底(例如Voldman等人，Ann.Rev.Biomed.Eng.1401-425，1999)。可以使用MEMS的传感器部件来测量机械、热学、生物学、化学、光学和/或磁现象。电子装置可以处理来自传感器的信息并控制致动器部件，例如泵、阀、加热器、冷却器、过滤器，等等，从而控制MEMS的功能。
a.集成芯片制造可替换地，在本发明的某些实施方案中，使用已知的芯片制造方法，可以合并具有230的金属涂敷的多孔硅层220或具有280的非多孔硅层270，作为MEMS半导体芯片的样本室的主要部分。在可选的实施方案中，具有230的金属涂敷的多孔硅220腔可以被从硅晶片分割出，并被合并到在芯片和/或其他器件中。
此外，可以使用集成电路(IC)工艺(例如CMOS、双极型或BICMOS工艺)制造MEMS的电子部件。可以使用已知的用于计算机芯片制造的光刻和刻蚀方法对它们进行图案化。可以使用相容的“显微机械加工”工艺制造微机械部件，所述“显微机械加工”工艺选择性地刻蚀掉硅晶片的一些部分或者添加新的结构层，以便形成机械和/或机电部件。MEMS制造中的基本技术包括在衬底上沉积材料薄膜、利用光刻成像或其他已知的平版印刷方法，在所述膜的顶部施加被图案化的掩模，以及，选择性地刻蚀所述膜。薄膜可以具有在几纳米到100微米范围内的厚度。使用的沉积技术可以包括化学过程，例如化学汽相沉积(CVD)、电沉积、外延(epitaxy)和热氧化，以及物理过程，像物理汽相沉积(PVD)和铸造。针对本发明的某些实施方案可以使用制造纳米机电系统的方法。(参见，例如Craighead，Science 2901532-36，2000)b.微流体通道和微米通道在本发明的一些实施方案中，拉曼活性表面可以连接到各种填充了流体的分隔间(compartment)，例如微流体通道、纳米通道和/或微米通道。装置的这些以及其他部件可以作为单个单元形成，例如以半导体芯片和/或微毛细管或微流体芯片中已知的芯片的形式。或者，拉曼活性表面可以从硅晶片移走，并被附着到装置的其他部件。在所公开的装置中可以使用任何已知的供在这种芯片中使用的材料，包括硅、二氧化硅、氮化硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、塑料、玻璃、石英，等等。
在本发明的某些实施方案中，预期通道185将具有在大约3nm和大约1μm之间的直径。在本发明的特定实施方案中，可以选择通道185的直径在尺寸上略微小于激发激光束。在计算机芯片制造和/或微毛细管芯片制造领域，用于芯片的批量制造的技术是公知的。可以通过技术上已知的任何方法制造这些芯片，例如通过光刻和刻蚀、激光烧蚀、喷射模塑、铸造、分子束外延、蘸水笔式纳米光刻法(dip-pen nanolithography)、CVD制造、电子束或聚焦离子束技术或压印(imprinting)技术。非限制性实施例包括利用可流动、光学上透明的材料的常规模塑，所述材料例如塑料或玻璃；二氧化硅的光刻和干法刻蚀；使用聚甲基丙烯酸甲酯抗蚀剂图案化二氧化硅基底上的铝掩模的电子束光刻，跟着是反应离子刻蚀；针对本发明的某些实施方案可以使用用于制造纳米机电系统的方法(参见，例如Craighead，Science 2901532-36，2000)。在商业上可从例如Caliper Technologies Inc.(加利福尼亚州的Mountain View)以及ACLARA BioSciences Inc.(加利福尼亚州的MountainView)的来源获得各种形式的微制造芯片。
对于可以被暴露给例如蛋白质、肽、核酸、核苷酸等的各种单个生物分子的填充了流体的分隔间，可以通过涂敷对被暴露给这些分子的表面进行改性，例如将表面从疏水的转换为亲水的表面和/或降低分子对表面的吸附。例如玻璃、硅、石英和/或PDMS的常见芯片材料的表面改性在本领域是已知的(例如No.6,263,286号美国专利)。这些改性可以包括但不限于用商业上可获得的毛细管涂料(capillary coatings)(宾夕法尼亚州Bellafonte的Supelco)、带有各种官能团(例如聚乙烯氧化物或丙烯酰胺)的硅烷或者任何其他本领域已知的涂料来涂敷。
为了使分析物210检测更容易，本发明的一个实施方案包括对于处在所使用的激发和发射频率的电磁辐射是透明的材料。可以使用玻璃、硅、石英或任何其他的在用于拉曼光谱学的频率范围内一般是透明的材料。在一些实施方案中，纳米通道或微米通道185可以由和用于使用喷射模塑或其他已知的技术制造加载腔180的相同的材料制造。对于样本室，任何几何构形、形状和尺寸是可能的，因为可以忽略或者补偿由这个部件所导致的任何折射。排列最好是使得来自透镜160的会聚光束中的所有光线放射状地通过光学上可透射的样本室175，从而不经受折射。光学上可透射的样本室175和通道185可以是微流体器件的一部分，微流体器件例如在Keir等人，Anal.Chem.741503-1508(2002)中公开的那种。
在例如Jacobsen等人(Anal.Biochem，209278-283，1994)；Effenhauser等人(Anal.Chem.662949-2953，1994)；Harrison等人(Science 261895-897，1993)以及No.5,904,824号美国专利中已经讨论了微流体器件的微制造，包括微毛细管电泳器件的微制造。
c.纳米通道通过已知的方法可以制备更小直径的通道，例如纳米通道185，所述已知的方法包括但不限于涂敷微米通道185的内部以便缩小直径，或者使用纳米光刻法(nanolithography)、聚焦电子束、聚焦离子束或聚焦原子激光技术。
纳米通道185的制造可以利用本领域已知的任何用于纳米规模制造的技术。下列技术仅仅是示范性的。例如，可以使用高吞吐量(high-throughput)电子束光刻系统(可在http://www.mdatechnology.net/techsearch.asp？articleid＝510处获得)制造纳米通道185。可以使用电子束光刻技术在硅芯片上写小到5nm的特征。可以不使用掩模而图案化涂敷在硅表面上的例如聚甲基丙烯酸甲酯的灵敏抗蚀剂(sensitive resist)。电子束阵列可以将场发射集群与微米通道放大器进行组合，以便提高电子束的稳定性，允许在低电流下工作。在本发明的某些实施方案中，SoftMaskTM计算机控制系统可以用来控制在硅或其他芯片上的纳米规模特征的电子束光刻。
在本发明可选的实施方案中，可以使用聚焦原子激光产生纳米通道185(例如Bloch等人，″Optics with an atom laser beam，(带有原子激光束的光学装置)″Phys.Rev.Lett.87123-321，2001)。聚焦原子激光可被用于光刻，和标准激光或聚焦电子束非常类似。这些技术能够在芯片上产生微米规模或者甚至纳米规模的结构。在本发明另外的可选实施方案中，可以使用蘸水笔式纳米光刻法来形成纳米通道103(例如Ivanisevic等人，Dip-PenNanolithography on Semiconductor Surfaces，(在半导体表面上的蘸水笔式纳米光刻法)″J.Am.Chem.Soc.，1237887-7889，2001)。蘸水笔式纳米光刻法使用原子力显微技术在例如硅芯片的表面上沉积分子。可以用10nm的空间分辨率形成尺寸小至15nm的特征。可以通过组合使用蘸水笔式纳米光刻法和常规的光刻技术形成纳米规模的通道185。例如，通过标准光刻法可以在抗蚀剂层中形成微米规模的线。使用蘸水笔式纳米光刻法，通过在所述抗蚀剂的边缘上沉积额外的抗蚀剂化合物，可以使得所述线的宽度(以及刻蚀以后通道185的对应直径)变窄。在刻蚀了更细的线以后，可以形成纳米规模的通道185。可替换地，可以使用原子力显微技术去除光致抗蚀剂以便形成纳米规模的特征。
在本发明另外的可选实施方案中，可以使用离子束光刻法在芯片上生成纳米通道185(例如Siegel，″Ion Beam Lithography，(离子束光刻法)″VLSI Electronics，MicrostructureScience(VLSI电子学，微结构科学)，Vol.16，Einspruch和Watts编，Academic Press，New York，1987)。无需使用掩模，可以使用精细聚焦的离子束在抗蚀剂层上直接写特征，例如纳米通道185。可替换地，宽离子束可以与掩模组合使用，以便形成规模上小至100nm的特征。使用化学刻蚀，例如利用氢氟酸，将被曝光的未受抗蚀剂保护的硅除去。熟练技术人员将发现，上面所公开的技术不是限制性的，并且可以利用本领于已知的任何方法形成纳米通道185。
可以很容易地使得这些技术适合在所公开的方法和装置中使用。在本发明的一些实施方案中，可以使用本领域已知的技术，由和被用于制造加载腔(loading chamber)180的相同的材料制造微毛细管。
在本发明的一个实施方案中，由例如硅基材料的适当的惰性材料制成的紧凑的微流体器件被压印，以便要被分析的分子样本和拉曼活性表面可以被制造或输送到样本室中。玻璃窗提供了聚焦激光斑的观察窗(view)，并且封闭溶液与周围环境隔开，这对于对空气敏感的分子很重要。所述的室可以具有用惰性气体吹扫溶液的口(port)。此外，所述的室可以具有如下尺寸的口所述尺寸允许包含要被测试的分析物的样本以及拉曼活性纳米粒子、聚集体和胶体流入所述的池，彼此相互接触并流出所述的室，从而允许样本在测试期间被恒定地补充，这确保了最大的灵敏度。
d.流动路径在本发明的某些实施方案中，可以利用本领于已知的任何方法，例如微流体、纳米流体、流体聚焦(hydrodynamic focusing)或电渗透，操纵纳米粒子240进入微流体通道、纳米通道或微米通道185。例如，在本发明的一个实施方案中，要被检测的分析物210和/或纳米粒子、聚集体或胶体可以通过加载腔180引入，并利用溶剂的总体流动向下向样本室175和/或微流体通道、纳米通道和/或微米通道185移动。在本发明的其他实施方案中，可以使用微毛细管电泳向下输送分析物210到样本室175和/或微流体通道、纳米通道和/或微米通道185。微毛细管电泳通常涉及使用可以填充或未填充特定分离介质的细毛细管或通道。响应被施加的电场，例如在检测单元一侧为正而相反一侧为负，发生适当带电的分子种类的电泳，例如带负电的分析物210的电泳。尽管电泳经常用于被同时添加到微毛细管的组分的混合物的颗粒离析，但是它也能被用来输送尺寸类似的分析物210。因为某些分析物210比其他一些更大，因此将迁移得更慢，所以样本室175和/或流动路径185的长度以及对应的通过检测单元195的穿越时间可以被保持最小，以便在检测或识别不同类型的分析物时防止有差别的迁移而不使分析物210的顺序混乱。可替换地，也可以选择填充微毛细管的分离介质，以使分析物210的沿样本室175和/或流动路径185向下的迁移速率类似或者相同。微毛细管电泳方法已经由例如Woolley和Mathies(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111348-352，1994)公开过。
在本发明的一些实施方案中，通过使用电势梯度(electrical gradient)，使用带电的连接体化合物或者带电的纳米粒子240可以使操纵纳米粒子240更容易一些。在本发明的其他实施方案中，样本室175和/或流动路径185可以包含具有相对较高粘度的水溶液，例如甘油溶液。这种高粘度的溶液可以起到降低流动速度并提高例如可用于将分析物210交联到纳米粒子240的反应时间的作用。在本发明其他的实施方案中，样本室175和/或流动路径185可以包含非水溶液，包括但不限于有机溶剂。
可以通过各种方式将要被分析的分析物的样本和金属微粒或胶体表面传递到样本室。例如，金属微粒或胶体表面能够被传递到要被分析的分子样本，要被分析的分子样本可以被传递到金属微粒或胶体表面，或者要被分析的分子和金属微粒或胶体表面可以被同时传递。如图1和图2中所示，可以利用泵送样本或以其他方式允许样本通过通道185流入样本室的设备自动地传递要被分析的分子样本和/或金属微粒或胶体表面。这样的设备包括线性微流体器件。在另一个实施方案中，可以通过利用试管、移液管或其他的这种手工传递设备，将一滴或几滴样本溶液直接放入样本室中，手工地传递要被分析的分子的样本和/或金属微粒或胶体表面。其他的输送分析物分子样本和拉曼活性表面的方法也是可能的。当分析物的分子样本通过样本室175流动时，输出反斯托克斯束190被更改/改变，这在测试期间被持续地监测。
从这些图很清楚，SECARS设备的光学仪器用来将拉曼活性表面引入到要被利用CARS类型的设备检测和/或识别的分析物(SERS)附近。作为线性微流体器件的一部分，可以用各种方式组合纳米粒子、聚集体或胶体和要被分析的分析物。这些包括a)将分析物的分子样本附着或吸附随后流入样本室的纳米粒子、聚集体或胶体；b)将分析物的分子样本流入样本室，所述样本室具有被固定化在所述样本室内的纳米粒子、聚集体或胶体；或c)将纳米粒子、聚集体或胶体和分析物的分子样本流经具有分叉的微流体通道的器件，所述器件将流入的纳米粒子、聚集体或胶体和流入的分析物的分子样本混和，并且一旦纳米粒子、聚集体或胶体被与分析物的分子样本完全混和，则允许进行光学测量。
预期了几种不同的实施方案，用于在微米规模上实现这种技术，包括但不限于使用各种波长、波导、光耦/泵浦束的选择，等等，以便实现精确的发射取向，所述精确的发射取向允许检测和识别仅少量分析物分子的样本。如上所述，必须选择拉曼光的两个单独的波长与目标分析物的振动能级对应，并取高方向性输出的方向。例如，为了在735cm-1探测腺嘌呤环呼吸模式，激发光可以被调谐到785nm并且斯托克斯光可以被调谐到833nm，以使它们的能级差和735cm-1的振动能级匹配。
拉曼标记本发明的某些实施方案涉及将标记附着一个或更多个分析物210的分子，以使通过拉曼检测单元195对它们的测量更容易。可用于拉曼光谱学的标记的非限制性实施例包括TRIT(四甲基罗丹明异硫醇(tetramethyl rhodamine isothiol))、NBD(7-硝基苯-2-氧-1，3-二唑(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazole))、德克萨斯红色染料(Texas Red dye)、邻苯二甲酸、对苯二酸、间苯二酸、甲酚紫(Cresyl fast violet)、甲酚蓝紫(cresyl blue violet)、亮甲酚蓝(brilliant cresy blue)、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、洋地黄毒苷、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基-荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明，6-羧基四甲基氨基酞菁素、偶氮甲碱、菁蓝、黄嘌呤、琥珀酰荧光素(succinylfluoresceins)、氨基吖啶、量子点、碳纳米管、富勒烯(fullerenes)、有机氰化物(例如异氰化物)，等等。可以从商业来源获得这些以及其他拉曼标记(例如俄勒冈州尤金的Molecular Probes，；俄勒冈州圣路易斯的Sigma Aldrich Chemical Co.)，和/或通过本领域已知的方法合成(参见Chem.Commun.，724(2003))。
多环芳香化合物可以起到拉曼标记的作用，这在本领域是已知的。其他可用于本发明的特定实施方案的标记包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。在本发明的某些实施方案中，碳纳米管可以用作拉曼标记。在拉曼光谱学中标记的使用是已知的(例如No.5,306,403和6,174,677号美国专利)。本领域的熟练技术人员将发现所使用的拉曼标记应该产生可辨识的拉曼光谱，并且可以特定地与不同类型的分析物210结合或缔合。
标记可以直接附着分析物210的分子，或者可以通过各种连接体化合物被附着。下面进一步描述在所公开的方法中使用的交联试剂和连接体化合物。可替换地，可以从商业来源获得共价地附着拉曼标记的分子(例如印地安那州印第安纳波利斯的Roche MolecularBiochemicals；威斯康星州麦迪逊的Promega Corp.；德克萨斯州奥斯汀的Ambion，Inc.；新泽西皮斯卡塔韦的Amersham Pharmacia Biotech)。在商业上可获得包含被设计成与其他分子(例如核苷酸)共价反应的反应性基团的拉曼标记(例如俄勒冈州尤金的MolecularProbes)。制备被标记的分析物的方法是已知的(例如No.4,962,037、5,405,747、6,136,543、6,210,896号美国专利)。
在本发明的增强之后存在两种主要的理论，但是没有一个被很好地理解，而且对本发明的描述也不重要。
从前面的描述将理解，本发明的传感器的响应时间和本发明的方法只受到不同的检测设备及其相关联的采样和计算电路特性的限制。商业上可获得的集成前置放大器提供了几皮秒范围内的响应时间。这些超快的响应时间使得监测初始的瞬态过程以及在测试或分析期间可能发生的其他转换成为可能，并且也允许进行快速的校准检测。本发明使得在比样本的有关成分和金属或半导体微粒或胶体表面之间完成化学结合所花费的时间还要短的时间量程上确定期望的反射率特性成为可能。
本发明的高分辨率、快速反应时间以及紧凑的设计允许本发明的方法和设备被用于许多生物学的、生物化学的和化学的应用，在这些应用中检测和识别少量的特定分析物的分子是有用的。这些设备和方法的一个特别的应用是通过检测和识别少量被标记和未被标记的核苷酸分子对聚合物进行测序，所述的聚合物例如单链核酸，像DNA或RNA，所述核苷酸分子被从核酸链顺序地切割。例如，核苷酸和金属粒子都可以通过微米通道中的水/缓冲液引入微型化的样本室供检测。
提供了下面的实施例，用于进一步说明本发明的特定方面和实践。这些实施例描述了本发明的特定实施方案，但是不要被理解为对本发明的范围或者所附权利要求的限制。
实施例1SECARS设置1
这种设置包括两个激光器一个激光器即泵浦激光器，发射泵浦束，而另一个激光器即斯托克斯激光器，发射斯托克斯束。泵浦激光器以76MHz重复频率产生10nJ的脉冲，具有1皮秒的脉冲宽度。斯托克斯激光器以76MHz重复频率产生6nJ的脉冲，具有1皮秒的脉冲宽度。泵浦和斯托克斯激光器通过和电子控制器连接(来自Coherent的SynchroLock AP)同步工作，所述电子控制器同步两个激光器产生的输出脉冲的定时(timing)。来自Coherent(加利福尼亚州Santa Clara)的两个钛蓝宝石激光器提供泵浦和斯托克斯束。这两个束利用由Chroma(佛蒙特州Brattleboro)制造的分色镜在空间上交迭。这些束被调谐到特定波长，以便这两个束的能级差和目标分析物的某个振动能级匹配。这些束通过显微物镜(蔡司)传递到微流体通道的检测窗区域上。
反应腔、微流体通道和微米通道的制备Borofloat玻璃晶片(加利福尼亚州Santa Ana的Precision Glass&Optics)在浓缩的HF(氢氟酸)中预先刻蚀一短时间段，并在等离子增强化学汽相沉积(PECVD)系统(PEII-A，加利福尼亚州San Jose的Technics West)中沉积无定形硅牺牲层之前被清洁。用六甲基二硅氮烷(HMDS)给晶片打底，用光致抗蚀剂(马萨诸塞Marlborough的Shipley1818)旋涂并软烘(soft-baked)。使用接触掩模对准器(mask aligner)(加利福尼亚州San Jose的Quintel Corp.)，利用一个或更多个掩模设计来曝光所述光致抗蚀剂层，并且使用Microposit显影剂浓缩液(Shipley)和水的混合物除去被曝光的光致抗蚀剂。经过显影的晶片被硬烘(hard-baked)，并且在PECVD反应器中使用CF4(四氟化碳)等离子体除去被曝光的无定形硅。利用浓缩的HF化学刻蚀晶片，以便产生反应腔和微流体通道或微米通道。剩余的光致抗蚀剂被剥离，并且无定形硅被除去。
通过这种方案的变化形成纳米通道。使用如上所述的标准光刻法形成集成芯片的微米规模的特征。薄抗蚀剂层被涂敷在芯片上。使用原子力显微术/扫描隧道探针从芯片表面移走5到10nm宽的抗蚀剂带。芯片被用稀释的HF简单地刻蚀以便在芯片表面上产生纳米规模的凹槽。在当前的非限制性实施例中，制备具有500nm和1μm之间直径的通道。
利用金刚石钻头(俄亥俄州Westerville的Crystalite)将接触孔钻入被刻蚀的晶片。通过在可编程真空炉(Centurion VPM，J.M.Ney，加利福尼亚州Yucaipa)中将两个互补的被刻蚀并钻孔的板相互热接合(thermally bonding)来制备完成的芯片。在反应腔和微流体通道之间插入具有2500道尔顿分子量截断的尼龙过滤器，以便防止核酸外切酶离开反应空。
纳米粒子制备根据Lee和Meisel(J.Phys.Chem.863391-3395，1982)制备银纳米粒子。从Polysciences，Inc.(宾夕法尼亚州Warrington)或Nanoprobes，Inc.(纽约州Yaphank)购买金纳米粒子。尺寸5、10、15、20、40和60nm的金纳米粒子可从Polysciences获得，尺寸1.4nm的金纳米粒子可从Nanoprobes，Inc.获得。在当前的非限制性实施例中使用60nm的金纳米粒子。
金纳米粒子与具有从5nm到50nm变化的链长度的链烷二硫醇(alkane dithiol)反应。连接体化合物在链烷的两端均包含硫醇基以便与金纳米粒子反应。使用相对于连接体化合物过量的纳米粒子，并且连接体化合物被缓慢地添加到纳米粒子，以避免形成大的纳米粒子聚集体。室温下培育2小时以后，通过在1M蔗糖中的超速离心将纳米粒子聚集体与单个纳米粒子分离。电子显微术揭示，利用这种方法制备的聚集体每个聚集体包含2到6个纳米粒子。聚集的纳米粒子被利用微流体流加载到微米通道中。在微米通道远端的收缩(constriction)保持纳米粒子聚集体处于原处。
多孔基底制备如上所述，利用阳极刻蚀、电化学刻蚀制备基底。更具体地说，通过将高度硼掺杂的P型硅晶片在包含乙醇和HF的含水电解溶液中经受刻蚀制备所述基底，基于所述溶液的总体积，HF按体积以大约15％的浓度存在(按体积15％的HF)。阳极化处理由施加通过室(在铂阴极和硅阳极之间)的受计算机控制的恒稳电流执行。由5个周期的两种不同的电流密度设置产生多层多孔硅。一种这样的设置是5mA/cm2持续20秒，这提供了具有大约42％的孔隙率和大约80nm厚度的层。其他的设置是30mA/cm2持续10秒，这提供了具有大约63％的孔隙率和大约160nm厚度的层。所形成的基底是圆形，盘状，具有大约1英寸的直径。尽管一般可以认为所形成的基底是同质的，但是当将基底的中心部分与基底的边缘部分比较时，存在细微差别(例如孔隙率、厚度等)。这样的层可以被归于层形成过程的本质。当将朝着基底的中心部分激发的光(截面直径大约1微米)的光发射光谱和向着基底的边缘部分激发的光进行比较时，所述细微差别是明显的。
核酸的制备和核酸外切酶处理根据Sambrook等人(1989)纯化人染色体DNA。在用Bam H1消化后，将基因组DNA片段插入到pBluescriptII噬菌粒载体(加利福尼亚州La Jolla的Stratagene，Inc.)的多克隆位点中，并在大肠杆菌中生长。在涂布到含有氨苄青霉素的琼脂糖平板上之后，选取单个克隆并令其生长用于测序。基因组DNA插入物的单链DNA拷贝通过用辅助噬菌体共转染来进行挽救。在蛋白酶K∶十二烷基磺酸钠(SDS)的溶液中消化后，对DNA进行苯酚抽提，然后通过加入乙酸钠(pH6.5，约0.3M)和0.8体积的2-丙醇对其进行沉淀。将含有DNA的沉淀物重悬浮在Tris-EDTA缓冲液中，并储存在-20℃，直至使用。琼脂糖凝胶电泳显示了纯化DNA的单一的带。
与已知的pBluescript序列互补的M13正向引物位于基因组DNA插入物的旁边，是从Midland Certified Reagent Company(德克萨斯州Midland)购买的。对引物进行共价修饰，使其含有连接于该寡核苷酸5’端的生物素部分。该生物素基团通过(CH2)6间隔物与引物的5’-磷酸共价连接。允许生物素标记的引物与由pBluescript载体制备的ssDNA模板分子杂交。然后根据Dorre等人(Bioimaging 5139-152，1997)将引物-模板复合体附着链霉抗生物素包被的珠子上。以合适的DNA稀释度，将单个引物-模板复合体附着到单个珠子上。将含有单个引物-模板复合体的珠子插入到测序装置的反应室中。
将引物-模板与修饰的T7 DNA聚合酶(俄亥俄州Cleveland的United StatesBiochemical Corp.)一同温育。反应混合物含有未标记的脱氧腺苷-5’-三磷酸(dATP)和脱氧鸟苷-5’-三磷酸(dGTP)，洋地黄毒苷-标记的脱氧尿苷-5’-三磷酸(洋地黄毒苷-dUTP)和罗丹明-标记的脱氧胞苷-5’-三磷酸(罗丹明-dCTP)。允许聚合反应于37℃进行2小时。在合成洋地黄毒苷和罗丹明标记的核酸之后，将模板链与标记的核酸分开，并将模板链、DNA聚合酶和未掺入的核苷酸洗出反应室。在本发明的替换性实施方案中，用于聚合反应的所有脱氧核苷三磷酸都是未标记的。在其他替换性实施方案中，单链核酸可以被直接测序而无需互补链的聚合反应。
通过向反应室中加入核酸外切酶III来启动核酸外切酶活性。将反应混合物维持在pH8.0和37℃。当核苷酸由核酸的3’端释放时，它们由微流体沿着微流体通道进行运送。在微米通道的入口处，由电极形成的电势梯度驱动核苷酸从微流体通道出来，进入微米通道。当核苷酸通过堆积的(packed)纳米粒子时，它们被暴露于来自激光的激发辐射。通过下文所述的拉曼检测仪检测拉曼发射光谱。
核苷酸的拉曼检测来自分子样本的拉曼散射光被同一显微物镜收集，并经过分色镜到达拉曼检测器。拉曼检测器包括聚焦透镜、摄谱仪和阵列检测器。聚焦透镜聚焦拉曼散射光通过摄谱仪的入口狭缝。摄谱仪(RoperScientific)包括按光的波长对其进行分散的光栅。被分散的光在阵列检测器(RoperScientific的后照明深耗尽CCD摄像机)上成像。阵列检测器被连接到控制器电路，所述电路被连接到用于数据转移和检测器功能控制的计算机。
拉曼检测器能够检测和识别移经检测器的单个未被标记的分子。将激光器和检测器安排成使得分子样本在其通过纳米通道或微米通道中密堆积的纳米粒子区域时被激发和检测。纳米粒子被交联，形成拉曼检测的“热点”。通过使核苷酸通过纳米粒子热点，拉曼检测的灵敏度被提高了许多个数量级。
通过利用试管、移液管或其他的这种手工传递设备，将一滴或几滴样本溶液直接放入样本室中，手工地传递要被分析的分子的样本和金属纳米粒子。
分子样本和胶体银粒子被分别引入微流体芯片，并在所述的流到达检测窗之前混合。当分子样本和银胶体的混合物被两个激光束激发时产生SECARS信号。导致电子返回到较低能态的拉曼发射信号被用于激发的同一显微物镜收集，并且束路径中的另一个分色镜将信号引向拉曼光谱检测器，一种雪崩光电二极管检测器(EG&G)。使用信号放大器和模数转换器将所述信号转换为数字输出。使用计算机记录所述数字输出并在数学上处理数据。
实施例2SECARS设置2在另一种SECARS设置中，来自Spectra-Physics(加利福尼亚的Mountain View)的钛蓝宝石激光器产生脉冲激光束。激光脉冲由可从Spectra-Physics获得的光学参量振荡器(OPO)使用，所述振荡器产生了处于两个不同波长的两个同步束。通过转动OPO内的光学晶体，两个束之间的波长差可以改变。使用微光学装置，由OPO产生的两个束被传递到微流体通道的检测窗区域。两个束的角度被设置成匹配相位匹配条件(Fayer，UltrafastInfrared and Raman spectroscopy(超速红外和拉曼光谱学)，Marcel-Dekker，2001)，在所述条件下最有效率地产生SECARS信号。胶体银粒子已经被附着到微流体通道的下表面(例如氟化钙或氟化镁窗)。当分子样本被引入微流体通道时，分子暂时吸附到附着在表面上的胶体银粒子上或者移动得更靠近所述胶体银粒子。当分子被所述两个束激发时，SECARS信号被作为相干单向束产生。SECARS信号的方向再次由相位匹配条件确定。光电倍增管(EG&G)被置于SECARS信号的方向，并收集所述信号。放大器和A/D转换器以及计算机可以被用于数据捕获、显示和处理。
实施例3SECARS设置3在可替换的SECARS设置中，由两个钛蓝宝石激光器(Coherent的Mira)产生激发束。利用二色干涉滤光器(由Chroma或Omega Optical制造)将来自两个激光器的激光脉冲交迭为与被收集束共线的几何构形。交迭束通过显微物镜(Nikon LU系列)，并聚焦在目标分析物所处的拉曼活性基底上。所述拉曼活性基底是金属纳米粒子。分析物被与氯化锂盐混合。来自分析物的拉曼散射光被同一显微物镜收集，并被第二个分色镜反射到拉曼检测器。所述拉曼检测器包括带通滤波器、聚焦透镜、摄谱仪，以及阵列检测器。带通滤波器衰减激光束并传送来自分析物的信号。聚焦透镜聚焦拉曼散射光通过摄谱仪的入口狭缝。摄谱仪(Acton Research)包括按光波长对其进行分散的光栅。被分散的光成像在阵列检测器(RoperScientific的后照明深耗尽CCD摄像机)上。阵列检测器被连接到控制电路，所述控制电路连接到用于数据转移和检测器功能控制的计算机。结果示于图3和图6中。
比较实施例4SERS设置1图4通过使用单个钛:蓝宝石激光器而产生。激光器以连续波模式或脉冲模式产生处于近红外波长(700nm到1000nm)的0.5-1.0瓦激光束。激光束通过分色镜和显微物镜，并聚焦在目标分析物所处的拉曼活性基底上。所述拉曼活性基底是金属纳米粒子或金属涂敷的纳米结构。分析物被与氯化锂盐混合。来自分析物的拉曼散射光被同一显微物镜收集，并被分色镜反射到拉曼检测器。所述拉曼检测器包括陷波滤波器、聚焦透镜、摄谱仪，以及阵列检测器。陷波滤波器(Kaiser Optical)衰减激光束并传送来自分析物的信号。聚焦透镜聚焦拉曼散射光通过摄谱仪的入口狭缝。摄谱仪(Acton Research)包括按光波长对其进行分散的光栅。被分散的光成像在阵列检测器(RoperScientific的后照明深耗尽CCD摄像机)上。阵列检测器被连接到控制电路，所述控制电路连接到用于数据转移和检测器功能控制的计算机。
比较实施例5CARS设置1在CARS设置中，由两个钛蓝宝石激光器(Coherent的Mira)产生激发束。利用二色干涉滤光器(由Chroma或Omega Optical制造)将来自两个激光器的激光脉冲交迭为和被收集束共线的几何构形。交迭束通过显微物镜(Nikon LU系列)，并聚焦在目标分析物所处的拉曼活性基底上。不使用拉曼活性基底。分析物被直接引入样本室。来自分析物的拉曼散射光被同一显微物镜收集，并被第二个分色镜反射到拉曼检测器。所述拉曼检测器包括带通滤波器、聚焦透镜、摄谱仪，以及阵列检测器。带通滤波器衰减激光束并传送来自分析物的信号。聚焦透镜聚焦拉曼散射光通过摄谱仪的入口狭缝。摄谱仪(ActonResearch)包括按光波长对其进行分散的光栅。被分散的光成像在阵列检测器(RoperScientific的后照明深耗尽CCD摄像机)上。阵列检测器被连接到控制电路，所述控制电路连接到用于数据转移和检测器功能控制的计算机。结果示于图5中。
图3与图4和图5的比较显示，当与单独的SERS比较时，SECARS技术显示在灵敏度上提高了25倍，当与单独使用CARS比较时，在灵敏度上提高了30,000,000倍。灵敏度上30,000,000倍的提高使得少量分子(小于1000、100或10个分子乃至单个分子)检测具有可行性。
上面的实施例展示了本发明的高分辨率SECARS设备和方法的新颖性和实用性。仅仅是为了理解清晰而给出了对本发明的优选实施方案的前述详细描述，并且不应该由此理解为任何不必要的限制，因为修改对于熟练技术人员来说将是清楚的。不偏离本发明的范围可以作出如前面给出的那样的本发明的变化，因此，只应施加由所附权利要求指示的这些限制。
权利要求
1.一种检测或识别分析物的方法，包括a)将分析物的少于大约103个分子暴露给至少一个拉曼活性表面；b)用处于第一波长的激光束照射至少一个分子和所述表面之间的界面，以使所述分子产生处于第二波长的自发斯托克斯拉曼发射和处于第三波长的自发反斯托克斯拉曼发射；c)与b)基本同时地，用处于所述第二波长的第二束照射所述分子和所述表面之间的所述界面，以使来自所述分子的处于所述第三波长的所述反斯托克斯拉曼发射的强度增加；以及d)通过在b)和c)之后利用拉曼检测单元检测或识别来自所述界面的处于所述第三波长的所述反斯托克斯发射的强度变化，检测或识别所述分析物。
2.如权利要求1所述的方法，包括将分析物的少于大约102个分子暴露给至少一个拉曼活性表面。
3.如权利要求1所述的方法，包括将分析物的少于大约10个分子暴露给至少一个拉曼活性表面。
4.如权利要求1所述的方法，包括将分析物的单个分子暴露给至少一个拉曼活性表面。
5.如权利要求1所述的方法，还包括移动所述分析物通过通道。
6.如权利要求5所述的方法，还包括在含水介质中检测和识别所述分析物。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述表面由选自由用金属或导电材料涂敷的硅基底；金属或导电纳米粒子；金属或导电纳米粒子的聚集体；金属或导电纳米粒子的胶体；以及它们的组合；所组成的组中的一项来提供。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述分析物选自由氨基酸、肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、类脂、激素、代谢物、细胞因子、趋化因子、受体、神经递质、抗原、变态反应原、抗体、底物、代谢物、辅因子、抑制剂、药、药物、营养素、朊毒体、毒素、毒物、爆炸物、杀虫剂、化学战剂、生物危险制剂、细菌、病毒、放射性同位素、维生素、杂环芳香族化合物、致癌物质、诱变剂、镇静剂、安非他明、巴比妥酸盐、迷幻剂、废物和污染物组成的组。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述分析物是核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、氨基酸、肽、多肽或蛋白质。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述分析物是核酸。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述分析物与拉曼活性表面紧密缔合。
12.如权利要求1所述的方法，其中，所述拉曼活性表面用有机化合物来共价地改性。
13.如权利要求5所述的方法，其中，所述通道选自由微流体通道、纳米通道、微米通道及它们的组合所组成的组。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述纳米粒子尺寸在大约1nm和2μm之间。
15.如权利要求13所述的方法，其中，所述纳米粒子的所述尺寸选自由大约10到50nm、大约50到100nm、大约10到100nm、大约100nm和大约200nm所组成的组。
16.如权利要求7所述的方法，其中，所述金属选自由金、银、铜、铂、铝及它们的组合所组成的组。
17.如权利要求1所述的方法，其中，所述拉曼检测的器件选自由光电二极管、雪崩光电二极管、电荷耦合器件阵列、CMOS阵列、强化电荷耦合器件以及它们的组合所组成的组。
18.如权利要求1所述的方法，还包括将所述分析物的所述检测到的强度与先前识别的分析物进行比较，以便能够确定所述分析物的所述的身份。
19.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大约为每分子10-22cm2的光学截面。
20.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大约为每分子10-20cm2的光学截面。
21.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大约为每分子10-19cm2的光学截面。
22.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大约为每分子10-18cm2的光学截面。
23.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大约为每分子10-17cm2的光学截面。
24.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大约为每分子10-16cm2的光学截面。
25.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大约为每分子10-15cm2的光学截面。
26.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大约为每分子10-14cm2的光学截面。
27.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大约为每分子10-13cm2的光学截面。
28.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大约为每分子10-12cm2的光学截面。
29.如权利要求1所述的方法，其中，所述分析物用一个或更多个可辨识的拉曼标记来标记。
30.如权利要求1所述的方法，还包括施加电场来使所述分析物移动通过所述通道。
31.如权利要求1所述的方法，其中，每一种类型的分析物产生独特的拉曼信号。
32.一种用于检测分析物的少于大约103个分子的设备，所述设备包括(a)用于产生处于第一波长的第一束电磁辐射的装置；(b)用于产生处于第二波长的第二束电磁辐射的装置；所述第二波长不同与所述第一波长；(c)样本室；(d)用于将所述分析物和拉曼活性表面引入所述样本室的装置；(e)用于将所述第一束和所述第二束聚焦在所述分析物和所述拉曼活性表面之间的界面上的光学装置；以及(f)用于检测从所述分析物和所述拉曼活性表面之间的所述界面发射的光强、被定位来接收所述发射的装置。
33.如权利要求32所述的设备，其中，所述用于产生第一束电磁辐射的装置和所述用于产生第二束电磁辐射的装置包括两个脉冲激光器。
34.如权利要求32所述的设备，其中，所述光学装置包括显微物镜、反射镜、棱镜，或它们的组合。
35.如权利要求32所述的设备，其中，所述样本室包括(a)样本室主体，所述样本室主体的材料将所述样本与环境空气隔离；(b)所述样本室主体中的窗，所述窗的材料对电磁辐射透明；以及(c)至少一个口，用于引入和除去所述分析物和可选择地引入和移走所述拉曼活性表面。
36.如权利要求32所述的设备，其中，所述用于将分析物和拉曼活性表面引入所述样本室的装置包括微流体器件。
37.如权利要求32所述的设备，其中，所述用于检测从所述界面发射的光强的装置是差分光检测器件，所述的差分光检测器件选自由光电二极管、雪崩光电二极管、电荷耦合器件阵列、CMOS阵列、强化电荷耦合器件以及它们的组合所组成的组。
38.一种用于检测分析物的少于大约103个分子的设备，所述设备包括a)反应腔；b)与所述反应腔流体连通的第一通道；c)与所述第一通道流体连通的第二通道；d)与所述第一和所述第二通道流体连通的样本室；e)所述流经室中的众多纳米粒子、纳米粒子聚集体、纳米粒子胶体，或金属涂敷的基底。f)激光器；以及g)可操作地耦合到所述流经室的表面增强、相干反斯托克斯拉曼检测器。
39.如权利要求38所述的设备，其中，所述拉曼检测器包括CCD摄像机或光电二极管阵列。
40.如权利要求38所述的设备，其中，所述CCD摄像机或光电二极管阵列可操作地耦合到数据处理单元。
41.如权利要求38所述的设备，其中，所述数据处理单元包括计算机。
42.如权利要求38所述的设备，还包括第一电极和第二电极，所述电极将单个分析物从所述第一通道移动进入所述第二通道中。
43.如权利要求38所述的设备，其中，所述第一通道是微流体通道。
44.如权利要求38所述的设备，其中，所述第二通道是纳米通道或微米通道。
45.如权利要求38所述的设备，其中，所述纳米粒子是金属。
46.如权利要求45所述的设备，其中，所述金属包括银、金、铂、铜和/或铝。
47.如权利要求38所述的设备，还包括可操作地耦合到所述拉曼检测器的流经室，其中，流经过所述样本室内部的所述金属涂敷的纳米晶体多孔硅基底。
48.如权利要求38所述的设备，其中，所述金属涂敷的基底被结合在集成芯片或者微机电系统(MEMS)中。
49.如权利要求38所述的设备，其中，所述检测单元包括激光器和CCD摄像机。
全文摘要
在此所公开的设备和方法涉及使用表面增强相干反斯托克斯拉曼光谱学以高分辨率和快速的响应时间来检测、识别和/或量化例如核酸的分析物。在本发明的某些实施方案中，少量例如核苷酸的分析物210的分子样本经过微流体通道、微米通道或纳米通道185和包含拉曼活性表面的样本室175，并通过表面增强相干反斯托克斯拉曼光谱学(SECARS)而被检测。本发明的其他实施方案有关于用于分析物检测的装置。
文档编号G01N21/65GK1954199SQ200480037756
公开日2007年4月25日 申请日期2004年10月6日 优先权日2003年10月17日
发明者T-W·库, 米尼奥·山川, 克里斯托弗·格斯 申请人:英特尔公司