对比例1所得的精华素对脂肪细胞脂解作用。
[0105] 二、实验材料
[0106] 1、实验样品及试剂：
[0107] TRIzoI总RNA提取试剂盒（天为时代），TG试剂盒（中生北控），Taq DNA聚合酶 (MBI)，反转录试剂盒(MBI)，DNA lander marker (MBI)，DEPC(MBI)，胰蛋白酶(Gibco)，牛血 清白蛋白，油红〇工作液，TBE缓冲液，溴酚蓝溶液，EB溶液，琼脂糖等。
[0108] 胰蛋白酶溶液:0.25g胰蛋白酶溶解于100mL灭菌PBS中，过滤除菌，4°C保存。
[0109] 分化诱导培养液：100腦〇1凡重组牛胰岛素、氢化可的松5〇1^/1111、转铁蛋白1〇1^/ ml的无血清培养液。
[0110] 油红0原液:0.5g油红0,溶于100mL异丙醇，60°C过夜，自然冷却，中性滤纸过滤，常 温保存。
[0111] 油红〇工作液:临用时取6ml油红0原液4ml双蒸水，过滤后使用。
[0112] DEPC水：ImlDEPC溶于99ml四蒸水中，高压灭菌后使用。
[0113] 溴化乙啶(EB)溶液：IOOmg溴化乙啶溶于100mL灭菌双蒸水中，4°C或室温保存。
[0114] 10XTBE缓冲液储存液:Tris 108.99g、硼酸55.62g,EDTA 29.23g溶于1000 ml双蒸 水中，PH8.0-8.2，高压灭菌，4°C或室温保存。
[0115] I X TBE缓冲液应用液:取10 X TBE加9倍体积的去离子水用于电泳缓冲液。
[0116] 溴酚蓝溶液:0.25g溴酚蓝溶解于100mL灭菌双蒸水中，4°C或室温保存。
[0117]琼脂糖凝胶:0.24g琼脂糖于30ml I XTBE中，微波炉中加热溶解，当溶液温度降至 60°C加入溴化乙啶使其终浓度为0.5ug/ml。
[0118] 紫外分光光度计、甘油检测试剂盒，其他试剂及样品同实施例4中所述；
[0119] 2、实验动物
[0120] 参见实施例4;
[0121] 三、实验方法
[0122] 1、脂肪细胞原代培养
[0123]猪前体脂肪细胞分离后同时接种于24孔培养板中，24孔培养板接种细胞24小时换 为分化诱导培养液，培养7天后换为对应浓度的实验处理培养液，处理24小时后收集培养液 储存于_70°C用于甘油释放量的测定，细胞提取总RNA，实验每组2个平行并重复三次。其他 程序同实施例4。
[0124] 2、培养液中甘油含量测定
[0125] 甘油测定反应体系：
[0126] 表2甘油测定体系
[0128]反应步骤:灭菌试管中加入去离子水、待测样品溶液、溶液2和3-混合，室温反应 至少6min-340nm测吸光度值，记录为A1-加入溶液4-混合，室温反应至少5min-测吸光 度值，记录为A2-每隔2min读一次值，直至数值不再改变。
[0129] 甘油浓度按以下公式计算：
[0130] C = VXMW/| X d X V X Δ Aglycerol
[0131 ]其中：V =最终体积(ml)，丽=甘油摩尔质量(g/mol)，| = NADH在340nm的消光系数 = 6300(1 XmoΓ1 X cm-〇，d =光程(cm)，V =样品体积(ml)。
[0132] 3、脂肪细胞总RNA提取
[0133] 使用TRIzoI(天为时代)试剂盒，按厂商提供的说明书提取细胞总RNA。
[0134] (1)吸出六孔培养板中的培养液，加入1ml TRIzoI，用取样器吹打几次；
[0135] (2)将匀浆样品在15_30°C放置15min，使核酸蛋白复合物完全分离；
[0136] (3)在高速冷冻离心机中4°C10,000Xg离心10min，吸取上清液；
[0137] (4)加0 · 2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min;
[0138] (5)4°C 10，000 X g离心15min。样品分为黄色有机相、中间层和无色水相三层，RNA 主要在水相中，将水相转移到新管中；
[0139] (6)加入0· 5ml异丙醇，混勾，室温放置IOmin;
[0140] (7)4°C10,000Xg离心10min，弃上清液。离心后在管侧和管底可见RNA胶状沉淀；
[0141] (8)加 lml75 %乙醇（用DEPC处理水配制)洗涤沉淀；
[0142] (9)4°C7500Xg 离心 5min，弃上清液；
[0143] (10)室温放置晾干，按RNA提取量的多少，加25_200μ1无 RNAse的DEPC处理水，55-60°C溶解后，_70°C保存。
[0144] 提取的RNA溶解在适量无 RNAse的DEPC水中，在1 %的含溴化乙啶的琼脂糖凝胶上 电泳，紫外光下观察RNA完整性和有无降解及基因组DNA污染；以500倍DEPC水稀释，用紫外 分光光度计测定波长260、280处的OD值，计算A 26Q/A28Q值和RNA浓度，提取的无污染、无降解 1?^\26()/^28()值为1.8-2.0 〇
[0145] 4、cDNA 第一链合成
[0146] 从细胞提取的总RNA用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(IBM)反 转录得到cDNA。
[0147] 反应体系如表3
[0148] 表3反转录反应体系
[0149]
[0151] 反应步骤和条件：
[0152] 在冰上依次加入反应物1、2、3共12ul -混合，在PTC-200热循环仪中70°C孵育 5min，短暂离心收集液滴-置于冰上按顺序加入4、5、6反应液-混合，离心收集液滴，25°C 孵育5min-置于冰上加入反转录酶，25°C孵育10min，42°C孵育60min-70°C加热IOmin终止 反应，冰上冷却。合成的cDNA产物在-20°C保存。
[0153] 5、PCR 扩增
[0154] PCR反应体系:反应体积为25ul时的反应体系如表4。
[0155] 表4 PCR反应体系
[0157] PCR引物参数见表5
[0158] 表5 PCR引物参数
[0160]注:S，上游引物;A，下游引物；
[0161 ]扩增条件为：95°C，8min-94°C，lmin-53~55°C，lmin-72°C，Imin; 30个循环- 72°C，10min-4°C 保存。
[0162] 6、电泳及凝胶成像和定量分析
[0163] 2.5yPCR扩增产物与微量溴酚蓝混合，在1 %的含溴化乙啶的琼脂糖凝胶上电泳。 同时加2000bp的DNA分子量ladder Marker，以确定扩增产物片段的大小。电泳分离的DNA片 段在Wealtec凝胶成像系统拍照，并用Dophin-ID凝胶分析软件分析(WealtecCorp.)。结果 用特异基因和β-actin电泳带吸光度的相对比值表示。
[0164] 四、实验结果
[0165] 1、实施例1~3及对比例1所得的精华素对脂肪细胞甘油释放量的影响见表6:
[0166] 表6甘油释放量结果
[0167]
[0168] 2、实施例1~3及对比例1所得的精华素对HSL基因 mRNA表达的影响见表7:
[0169] 表7 HSL基因 mRNA表达结果
[0170]
[0171] 结果以平均值土SD表示，标有不同字母的平均值之间差异显著(P〈0.05)。
[0172] 结果分析:从表6和表7可以看出实施例1~3及对比例1所得的精华素可以使释放 入培养液中的甘油三酯水解产物浓度升高以及使HSL的表达降低(这与脂肪细胞中水解甘 油三醋的酶