0
[0153] 在有恢复的比格(Beagle)犬中，进行14-天重复给药口服毒性研究。在比格犬中完 成所述GLP顺应口服毒性，以评价当在食品中在12h内以6h间隔、一天3次施用、持续至少14 个连续日时，ZS-9的潜在口服毒性。在主要研究中，将ZS-9以Omg/kg/剂量(对照）、325mg/ kg/剂量、650mg/kg/剂量或1300mg/kg/剂量的剂量施用至3/狗/性别/剂量。分配至恢复研 究的另外两只狗/性别/剂量与主要研究的动物同时接受〇mg/kg/剂量或1300mg/kg/剂量， 并再维持不治疗另外10天。对于含水量，将校正因子1.1274用于校正ZS-9。将剂量记录用于 确保剂量施用的准确性。
[0154] 在顺应期（第-7天至第-1天），训练狗，以便以6h间隔，食用3份湿的狗粮。治疗期 间，将规定量的测试物品（基于最近记录的体重)与~100g湿的狗粮混合，并以6h间隔，提供 至狗。食用最后的每日剂量后，提供另外的干燥食品。每只狗接受相同量的湿的狗粮。到达 时和在第-2、_1、6、13和20天，记录狗的体重。顺应、治疗和恢复期间，每天两次，进行临床观 察。治疗期间，每天测量湿和干燥的食品消费。测试前(第-1天)和第13天，收集血和尿样，用 于分析血清化学、血液学、凝固和尿分析参数。测试前(第-6/7天)和在第7(雌性)或8(雄性） 天，完成眼科检查。测试前(第-1天)和第11天，完成心电图评价。研究结束(第14天-主要研 究和第24天-恢复研究），进行尸检，称量方案指定的器官重量，并用显微镜检查所选的组 织。
[0155] 在12h期间以6h间隔、一天3次、持续14天，口服施用325mg、650mg和1300mg ZS-9/ kg/剂量的食品被良好耐受。第二周治疗期间，临床体征限于325mg/kg/剂量的一些狗，以及 接受2 650mg/kg/剂量的所有动物的粪便中，白色物质的观察，推定所述白色物质是测试物 品。对体重、体重变化、食物摄入、血液学和凝固参数或者眼科和ECG检查，无不良作用。
[0156] 无与施用ZS-9相关的宏观结果。微观地，在治疗动物的肾脏而不是对照动物的肾 脏中，观察到极轻微至弱的局灶和/或多病灶炎症。在650mg/kg和1300mg/kg，损害具有相似 的发生率和严重性，并且在325mg/kg，损害是更少见和更不严重的。在一些狗中，炎症是单 侧而不是双侧，并且在一些情况下，伴随膀胱和输尿管起端的炎症。总之，所述观察表明除 了直接肾损伤之外的因素例如ZS-9-治疗狗的尿组成的变化可能导致对亚临床泌尿道感染 增加的易感性，尽管在所述组织中未观察到微生物。在恢复动物中，炎症在雌性中完全解 决，且在雄性中部分解决，表明给药停止后，无论炎症的起因如何，其是可逆转的。
[0157] 将用ZS-9治疗的比格犬中观察到的混合性白细胞炎症的发生率增加总结如下：
[0158]
[0159]在施用650mg/kg/剂量的雌性的肾盂和尿中，还观察到极轻的极性膀胱炎症和未 鉴定的晶体，总结如下：
[0161 ]第2组或第4组雌性或者任何ZS-9治疗的雄性，未鉴别晶体。
[0162] 在两项研究中，应该注意：与对照相比，尿pH升高，并且假定尿pH和/或尿组成的变 化影响尿溶质的溶解度，致使晶体形成，其引起尿道刺激和/或对尿道感染(UTIs)增加的易 感性。
[0163] 尿结晶的描述(长细的尖簇），以及颗粒大小分布和测试物的不溶解性，致使这些 晶体是ZS-9为非常不可能的。
[0164] 实施例11
[0165] 制备ZS-9的晶体，并指定为"未筛选的ZS-9"。根据实施例10中的方法，对ZS-9晶体 的样品进行筛选，并将筛选的样品指定为"ZS-9>5ym"。根据上述实施例6的方法，将另一 ZS-9晶体样品进行离子交换，然后，根据实施例10的方法筛选。将得到的H-ZS-9晶体指定为 "ZS-9+>5ym"。
[0166]将下述14-天研究进行设计，以显示粒度和颗粒形式对尿pH和尿中晶体存在的作 用。通过与湿狗粮混合，将上述化合物口服施用至比格犬。以下述方式，在12小时内间隔6小 时一天三次施用所述疗法：
[0167]研究设计
[0170] *对于水未校正的
[0171] zS_9+ = pH 中性晶体
[0173]下述表格列出观察、毒代动力学评价、实验室研究(血液学、尿分析)和终端操作。
[0179] 用雌性狗的研究期间，利用湿食品溶媒，将测试品、未过筛的ZS-9、ZS-9>5ym和ZS-9+>5μπι经饮食摄入，在12小时内以6小时间隔每天施用三次，持续连续的14天。剂量水平是 100mg/kg/剂量或 600mg/kg/剂量。
[0180] 所有动物活过14天的施用期。在死亡率、体重、体重增加、器官重量、宏观检查或者 临床化学或血液气体参数方面，无与测试品相关的变化。ZS-9相关的发现限于接受6000mg/ kg/剂量的剂量的过筛或未过筛ZS-9的动物中，钠排泄分数的增加和尿pH的增加，以及以 600mg/kg/剂量施用未过筛的ZS-9、ZS-9>5ym和ZS-9+>5ym的动物中，钾排泄分数和尿液尿 素氮/肌酐酸比率的减少。
[0181] 与对照相比，用600mg/kg/剂量的未过筛ZS-9和ZS-9>5ym治疗的动物，尿液pH统计 学显著地增加，所述未发现于100mg/kg/剂量或者用600mg/kg/剂量ZS-9+>5ym治疗的动物 中。在这些动物中的尿液pH平均值在第7天从5.33增加至~7.67，并在第13天，从5.83增加 至7.733。对用600mg/kg/剂量质子化ZS-9(ZS-9+>5ym)治疗的动物的尿液pH无影响，表明用 较高剂量的载钠 ZS-9(未过筛ZS-9和ZS-9>5ym)治疗的动物的尿液pH增加是胃肠道氢吸收 的结果。
[0182] 认为尿液体积和比重方面发现的所有差异是在正常生物学和/或方法相关的变异 性的可接受范围内。治疗组间的生化(蛋白质、酮类等）和显微的（晶体、血细胞等）、尿组分 有一些变化，其也被认为在生物学和/或方法相关的变异性的可接受范围内。在所有研究周 期，大多数动物中观察到三磷酸盐结晶（磷酸铵镁），在少数动物中还观察到罕见的草酸钙 二水合物晶体。这些晶体类型在狗中被认为是正常发现。未观察到表明在任何动物中观察 到的任何晶体是治疗相关或者测试品相关的模式。在任何动物的尿沉淀物中，未观察到未 鉴定晶体。
[0183] 在第7天和第13天，在所有组中包括对照，相对于给药前间隔，钠排泄分数增加。与 其他治疗组或对照动物中发现的相比，接受600mg/kg/剂量的未过筛ZS-9、ZS-9>5ym和ZS-9 +>5μπι的动物趋向于具有轻微更大的增加(相对于对照最多116 % )。在所述三组中观察到的 增加偶尔达到认为高于预期范围的幅度，并且其归因于测试品。在所述三组中观察到的变 化间不能鉴定可识别的差异。在用600mg/kg/剂量的质子化ZS-9治疗的动物中，无钠排泄分 数的不同。所述变化归因于测试品，且不认为是毒理学不良的。
[0184] 相对于对照，在用600mg/kg/剂量的未过筛ZS-9、ZS-9>5ym和ZS-9+>5ym，以及 100mg/kg/剂量的ZS-9>5ym治疗的动物中，在第7天和第13天，观察到钾排泄分数的显著降 低。相对于对照在第7天和第13天，大多数所述值达到统计学显著性。所述降低归因于测试 品的药理作用。
[0185] 在第7天和第13天，在所有组包括对照，相对于给药前间隔，尿素氮/肌酸酐比率轻 微增加。在第7天和第13天，相对于对照，接受600mg/kg/剂量的未过筛ZS-9、ZS-9>5ym和ZS-9+>5μπι的动物中，尿素氮/肌酸酐比率轻微下降（至多26 %)。对于第7天和第13天，与对照相 比，在所述四组中观察到的变化大多数达到统计学显著性，尽管当与其各自测试前的值相 比，组平均值无明显不同。认为所述发现是测试品相关的。尽管其他端点间存在偶尔的统计 学显著差异，在任何治疗组，没有识别对肌酸酐清除、钙/肌酸酐比率、镁/肌酸酐比率或者 尿渗摩尔浓度的测试品相关影响。
[0186]在600mg/kg/剂量，观察到肾中的测试品相关的显微发现。最常见的发现是极轻至 轻度的混合白细胞浸润(淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞和/或中性白细胞），以及极轻至轻度 的肾管再生(衬有减弱的上皮细胞的轻微扩大的小管、具有丰满的核的上皮细胞和噬碱细 胞质）。在接受600mg/kg/剂量的未过筛ZS-9的1/3狗中和接受600mg/kg/剂量的ZS-9>5ym的 1/3狗中，观察到极轻的肾盂炎(肾盂粘膜下层中的中性白细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润)和 极轻的肾管变性/坏死(小管，其衬有具有皱缩或核破裂的核的高嗜酸性粒细胞，并在管腔 中含有腐坏的上皮细胞和/或炎症细胞）。尿道和输尿管中极轻的肾盂炎和混合白细胞浸润 还存在于一些施用ZS-9>5ym的狗中。
[0187] 肾脏的变化主要存在于皮质，并偶而随机存在于髓质，病灶至多病灶(至多4个病 灶(foci))分布。这些病灶大小不定，大多不规则，偶而呈线性(从皮外层延伸至髓质），并在 给定的截面涉及低于5%的肾实质。这些病灶大多数由混合性白细胞的极轻至轻度浸润与 极轻至轻度的管再生组成，一些病灶仅有极轻至轻度管再生，无混合白细胞浸润。少数的这 些病灶(施用600mg/kg/剂量的未筛选ZS-9的两只狗和施用600mg/kg/剂量ZS-9>5ym的一只 狗)含有少数降解/坏死的小管。肾盂炎存在于四只狗中（施用600mg/kg/剂量的未筛选ZS-9 的一只狗和施用600mg/kg/剂量ZS-9>5ym的三只狗）。
[0188] 混合性白细胞浸润还存在于施用600mg/kg/剂量ZS-9>5ym的狗的两条输尿管的粘 膜下层，以及施用600mg/kg/剂量的未筛选ZS-9、600mg/kg/剂量ZS-9>5ym的动物的尿道的 粘膜下层。与无肾盂炎的狗相比，患肾盂炎的狗中，肾实质的混合性白细胞浸润的发生率 和/或严重性是更高的。一些狗的尿道和输尿管中肾盂炎和/或混合性白细胞浸润的出现， 以及患有炎症浸润的肾的随机分布的检查结果表明尿道感染上升，并提示600mg/kg/剂量 的肾检查结果可能是测试品的间接作用。
[0189] 上施用600mg/kg/剂量的未筛选ZS-9的狗中，三只狗中的两只的肾脏受一种或多 种上述检查结果的影响。给予600mg/kg/剂量ZS-9>5ym的所有三只狗具有肾脏损害，包括肾 盂炎和尿道或输尿管粘膜下层中的混合性白细胞浸润。给予600mg/kg/剂量ZS-9>5ym的狗 中，具有管再生的极轻混合性白细胞浸润仅存在于一只狗的左肾，并且另一只狗具有少数 极轻管再生的病灶。
[0190] 测试品相关的检查结果(直接或间接)不存在于施用100mg/kg/剂量的未筛选ZS-9 (ZS-9、ZS-9>5ym、ZS-9+>5ym)的雌性狗中。偶发病灶或两种极轻管再生存在于三只动物中， 无混合性白细胞浸润或管变性/坏死的证据。类似管的再生灶/病灶还存在于对照雌性狗 中。施用较低剂量的未过筛ZS-9的雌性狗中观察到的管再生病灶是略微更小的，并且与混 合性白细胞浸润或管变性/坏死无关。检测的任何切片中没有晶体证据。乳突和肾小球脂肪 沉积中的管矿化是比格犬中的背景检查结果，且不认为是测试品相关的。
[0191] 600mg/kg/剂量的未筛选ZS-9、ZS-9>5ym和ZS-9+>5ym在肾脏中具有极轻至轻度混 合性白细胞浸润，有时伴有极轻至轻度肾脏管再生，以及偶发极轻肾脏管变性/坏死，施用 未筛选ZS-9与ZS-9>5ym的狗中的输尿管和/或尿道中极轻混合性白细胞浸润和极轻肾盂 炎。
[0192] 用600mg/kg/剂量的ZS-9+>5ym治疗的狗中，无尿液pH增加，以及这些狗中和用补 充钾的600mg/kg/剂量的ZS-9治疗的狗中，显微镜下发现的发生率降低，表明由于测试品的 药理作用升高的尿液pH和/或钾的除去可对尿结晶和细菌引起的背景损害具有增加的易感 性。
[0193] 基于这些结果，无可观察到的效应水平(NOEL)是100mg/kg/剂量的未筛选ZS-9、 ZS-9>5ym 和 ZS-9+>5ym。对于600mg/kg/剂量的未筛选 ZS-9、600mg/kg/剂量的筛选 ZS-9(ZS-9>5μπι)、以及600mg/kg/剂量的筛选和质子化ZS-9(ZS-9+>5ym)，确立无可观察到的有害作 用水平(NOAEL)。
[0194] 实施例12
[0195] 通过标准5-G结晶容器中的反应，制备ZS-9晶体。
[0196] 如下，制备反应物。将22-L莫顿(Morton)烧瓶装配顶式搅拌机、热电偶和平衡加料 漏斗。将烧瓶填充去离子水(3.25L)。以大约IOOrpm开始搅拌，并向烧瓶中，加入氢氧化钠 (1091g NaOH)。随着氢氧化钠溶解，烧瓶内容物放热。搅拌溶液，并冷却至低于34°C。加入硅 酸钠溶液(5672.7g)。历经43分钟，向所述溶液中，加入醋酸锆溶液(3309.5g)。将产生的混 悬液再搅拌22分钟。向反应器中加入ZS-9种晶(223.8g)，并搅拌大约17分钟。
[0197] 在去离子水(0.5L)辅助下，将混合物转移到5-G Parr压力容器中。该容器具有平 滑的壁和标准搅拌器。反应器没有冷却管存在。将容器密封，并在大约275-325rpm下搅拌反 应混合物，并将其加热至185+/-10°C历经4小时，然后保持于184-186°C，并浸泡72小时。最 后，将反应物继续冷却至80°C历经12.6小时。在去离子水（18L)辅助下，将产生的白色固体 物过滤。将固体物用去离子水（125L)冲洗，至流出滤液的pH是低于11(9.73)。在95-105°(3， 将湿饼真空(25英寸Hg)干燥48小时，以得到2577.9g( 107.1 % )ZS-9，为白色固体物。
[0198] 图10中显示在该实施例中得到的ZS-9的XRD谱。图11中显示所述物质的FTIR谱。这 些XRD和FTIR谱特征在于存在与ZS-Il晶型相关的典型吸收峰。此外，由于晶体杂质，与ZS-9 相关的峰显示显著扩展(例如ZS-9组合物中存在ZS-Il晶体）。例如，FTIR谱显示大约764CHT1 和955CHT1的显著吸收。该实施例的XRD谱显示显著噪音，以及在7.5、32和42.5的2-Θ值处难 以确定的峰。
[0199] 实施例13
[0200]在本实施例中，ZS-9晶体被质子化。
[02011向100L反应器中，真空和搅拌(60-100rpm)下，填充去离子水（15.1L)。将ZS-9晶体 (2.7kg)加入到100L含有去离子水的容器中，并让反应进行5-10分钟的一段时间。记录起始 pH读数。
[0202]在单独的50L酸坛中，制备盐酸溶液，其包含向酸坛填充去离子水(48L)，随后填充 盐酸(600ml)的步骤。向所述IOOL反应器中，历经1.5-2小时，添加盐酸溶液。将盐酸溶液加 入到反应混合物中，直到pH达到大约4.45-4.55的范围。将反应混合物再继续混合30-45分 钟。如果pH大于4.7，加入另外的盐酸溶液，直到pH是大约4.45-4.55。再将反应搅拌15-30分 钟。
[0203]经装配大约18英寸直径的2微米不锈钢网筛的布氏漏斗，过滤质子化ZS-9晶体。将 形成的滤饼用大约6L去离子水冲洗3次，除去任何过量的盐酸。将含有质子化晶体的滤饼在 大约95-105°C的真空干燥箱中干燥12-24小时。继续干燥，直到历经大于2小时的一段时间， 净重减少的百分比差异是低于2%。一旦产物达到适当干燥，晶体是合格的样品。
[0204] 实施例14
[0205]根据下述代表性实施例，制备高能力ZS-9晶体。
[0206]如下准备反应物。将22-L莫顿烧瓶装配顶式搅拌机、热电偶和平衡加料漏斗。将烧 瓶填充去离子水(8,60(^，477.37摩尔）。在大约145-150印111开始搅拌，并向烧瓶中，加入氢 氧化钠(661. Og，16.53摩尔NaOH，8.26摩尔Na2O)。随着氢氧化钠溶解，烧瓶内容物放热，历 经3分钟从24°C到40°C。将溶液搅拌1小时，以让开始的放热减退。加入硅酸钠溶液(5，017g， 22.53摩尔SO 2，8.67摩尔Na20)。利用加料漏斗，历经30min，向所述溶液中加入醋酸锆溶液 (2，080g，3.76摩尔ZrO 2)。将得到的混悬液再搅拌30min。
[0207] 利用去离子水(500g，27.75摩尔），将混合物转移至5-G Parr压力容器Model 4555 中。将反应器装配具有蛇形结构的冷却管，以在接近搅拌器的反应器内提供挡板样结构。冷 却管不填充热交换液体，因为其在反应中仅为了提供邻近搅拌器的挡板样结构。
[0208]将容器密封，并将反应混合物在大约230-235rpm搅拌，并历经7.5小时，从21°C加 热至140-145°C，并在140-145°C保持10.5小时，然后历经6.5小时加热至210-215°C，其中得 到295-300?8丨的最大压力，然后在210-215°(3保持41.5小时。随后，历经4.5小时，将反应器 冷却至45°C。利用去离子水（1.0KG)，将得到的白色固体物过滤。将固体物用去离子水(40L) 冲洗，直到流出滤液的pH是小于11 (10.54)。将湿饼的代表部分在100°C真空（25英寸Hg)干 燥过夜，得到I，376g(87.1 % ) ZS-9，为白色固体物。
[0209]图12中显示得到的ZS-9的XRD谱。图13中显示所述物质的FTIR谱。当与实施例12的 谱（图10-11)相比时，所述XRD和FTIR谱显示良好描绘的峰，没有扩展，且无与除ZS-9之外的 晶型相关的峰(例如，ZS-Il峰）。所述实施例说明反应器内挡板样结构的存在如何彻底且出 乎意料地改善由此得到的晶体的质量。尽管不希望受理论束缚，本发明人理解:当反应进行 时，挡板提供附加的紊流，该紊流提升固体物（即晶体），并在反应器内产生更均匀的晶体混 悬液。所述改善的混悬液保证向所需晶型的更完全反应，并减少终产物中不需要ZS晶型的 存在。
[0210] 实施例15
[0211]根据下述方案，测定ZS(ZS_9)的KEC。
[0212]所述测试方法使用能引入梯度溶剂和阳离子交换检测的HPLC。柱子是IonPac CS12A，分析型（2x 250mm)。流速是0.5mL/分钟，运行时间大约8分钟。将柱温设为35°C。进样 体积是IOyU且针洗涤是250yL。栗以等度方式运行，且溶剂是DI水。
[0213] 通过精确称量并记录大约383mg重量的氯化钾(ACS级），制备标准贮备液，将其转 移至100-mL塑料容量瓶中。将物质溶解，并用稀释剂稀释至体积，随后混合。标准贮备液具 有2000ppm( 2mg/mL)的K+浓度。通过精确称量、记录，并向20mL塑料瓶中转移大约112mg ZS-9，制备样品。将20.0 mL 2000ppm的钾标准贮备溶液用移液管转移至小瓶中，并将容器密封。 将样品瓶置于手腕式振荡器上，并振荡至少2小时，但不多于4小时。将样品制备液经0.45pm PTFE过滤器过滤至塑料容器中。将750pL样品溶液转移至100-mL塑料容量瓶中。将样品用DI 水稀释至容积并混合。起始K+浓度是15ppm( ISpgImL)。
[0214] 将样品进样到HPLC中。图14显示空白溶液的色谱图示例。图15显示测试标准溶液 色谱图的示例。图16显示示例性样品色谱图。利用下式，计算钾交换能力。
[0216] KEC是以mEq/g表示的钾交换能力。钾的起始浓度(ppm)是1C。钾的最终浓度(ppm) 是FC。当量重量(原子量/化合价)是Eq wt。样品制备的标准体积(L)是V。用于样品制备的 ZS-9的重量(mg)是Wtspi。水含量的百分比（％ ) (LOD)是％水。
[0217]根据上述方法，测试根据实施例12的方法即在无挡板(例如内部冷却盘管结构)反 应器中产生的三种ZS-9样品的钾交换能力(KEC)。类似地，根据所述方法，测试根据实施例 14在具有冷却盘管作为挡板的反应器产生的三种ZS-9样品。下表3中的结果显示实施例14 的方法和结晶容器内挡板的存在导致钾交换能力的显著增加。
[0219] -旦利用实施例13的技术质子化，