小猪将更快找到可触及的乳，而不需要再次访问任何不可触 及乳碗。当小猪再次访问任何不可触及乳的位置时，则记录为错误。通过直接观察来记录小 猪在测试区域中的行为，并用录像带记录W用于进一步分析。所有测试由训练有素的工作 人员进行。
[0134] 当小猪进入测试区，然后首先访问在前次试验中发现可触及乳碗的位置（图4B) 时，记录位置记忆。测试了两种类型的位置记忆:短期记忆(STM)和长期记忆化TM)。在本研 究中，我们将STM定义为对间隔时间为5分钟或更短的2次连续试验的记忆。将所有持续时长 超过5分钟的位置记忆视为LTM。本研究中有S种类型的LTM: (1)30分钟LTM(早上）；（2)4小 时LTM(下午第一次试验）；（3) 16小时LTM(次日早上第一次试验）。位置记忆测试的计划表如 图5所示。
[0。引 2.2.结果
[0136]各组间位置记忆的整体差异如表2所示。中等剂量组和高剂量组具有比对照组更 好的位置记忆，但差异未达到统计显著性(P〉〇. 05)。然而，当我们基于成功率分析数据时， 中等剂量组和高剂量组取得的成功比对照组多30%，其中成功率为小猪取得的实际成功数 比总理论成功数的比值(表2)。
[0。7] 表2位置记忆成功率
[0139] *1.成功率=(实际成功数/理论成功数）X 100%
[0140] 9次位置记忆试验的平均成功数如图8所示。虽然乳铁蛋白处理组在位置记忆方面 的表现比对照组好，但统计分析结果未达到显著性(P〉〇.05)。
[0141] 我们还发现，当我们把前5次试验视为习得阶段学习，而把后5次视为提取阶段学 习时，乳铁蛋白处理组在位置记忆方面的表现比对照组好(图9)。
[0142] 将任何时间间隔不超过5分钟的位置记忆定义为短期位置记忆。将时间间隔超过5 分钟的记忆定义为长期位置巧区。短期位置记忆和长期位置记忆的总成功数汇总于表3中。 [01创表3短期记忆和长期记忆成功率
[0145] *1.成功率=(实际成功数/理论成功数）X 100%
[0146] P = O.026
[0147] 运些结果表明，用乳铁蛋白处理的组在短期记忆测试和长期记忆测试中均表现得 更好。具体地讲，高剂量组比对照组表现出明显更好的30分钟长期记忆(P = O.046)(图10)。 [014引此外，除了试验5和试验6 W外，用乳铁蛋白处理的组在位置记忆试验中比对照组 表现得更好（图11)。具体地讲，在试验7中，处理组明显比对照组表现得更好(P = O.026,双 因素方差分析）。
[0149] 实例3:乳铁蛋白对小猪学习速度和记忆的影响
[0150] 3.1.学习和记忆测试
[0151] 使用八臂迷宫法[引测试学习和记忆能力的认知功能。将小猪逐一引入八臂迷宫 中。进行了两种测试："简单任务"（任务1)和更"困难的任务"（任务2)(图12)。两种测试均在 一个臂中放有可触及的乳，而在其余7个臂中放有不可触及的乳，从而所有臂都具有相同的 气味，防止嗅觉学习（图12)。在两种测试中，将由3个黑点组成的视觉提示随机放置在臂中 有可触及的乳(与该组的乳相对应）的口上。在简单任务中，将一个黑点的视觉提示放置在 具有不可触及乳（与可触及乳的量和类型相同）的其余7个口上。在困难任务中，将有2个黑 点的视觉提示放置在其余7个口上。3个黑点的视觉提示的位置在不同试验之间按预定的随 机顺序变化。从第22天(22日龄的小猪)起，在为期10天的周期里对任务1和任务2各进行了 四十次试验。
[0152] 根据成功学会识别视觉提示所用的试验次数来确定对学习能力的评估。使用在各 次试验中寻找可触及乳臂时的错误数和成功数来量化学习。每当小猪进入错误的口或者将 其整个头部穿过错误的口时，即记录为错误。当小猪进入正确的口时则记录为成功。学会识 别视觉提示的标准是：（A)3次连续试验中最多出现1次错误，（B)3次连续试验中未出现错 误，（C)4次连续试验中最多出现1次错误，（D)4次连续试验中未出现错误，化)5次连续试验 中最多出现1次错误，（F)在5次连续试验中未出现错误。在学习和记忆测试期间，头顶摄像 机连续进行记录，同时，训练有素的观察者手动记录结果。由训练有素的工作人员进行所有 测试，运些工作人员对乳铁蛋白摄入水平不知情。通过对视频资料进行独立分析来证实结 果。为了减轻压力并使小猪熟悉测试规程，我们允许来自同一窝的两只小猪进入迷宫，W在 学习巧聯前学习如何开口和关口（ 8次试验）。
[0153] 每天早上4次试验，下午4次试验。对一只小猪进行两次连续试验。两次试验的意向 间隔时间（改变视觉提示并放置新鲜乳)为5分钟巧分钟短期记忆），在运5分钟内，小猪位于 等待区（在测试区外）。40分钟后(40分钟长期记忆），再次将小猪引入八臂迷宫，进行另外2 次连续试验。下午，对小猪重复进行上午的测试。早上和下午测试之间的意向间隔时间为3 小时（3小时长期记忆）。16小时后的第二天，我们重复了与前一天测试相同的任务（16小时 长期记忆）。简单任务和困难任务的试验总次数为40次。完成简单和困难试验四十八小时 后，让已达到学会标准的小猪再次进行相同模式的任务，作为"48小时长期记忆"。将寻找可 触及乳时的错误数记录为记忆指标。简单和困难任务安排的过程如图13所示。
[0154] 在图14所示的简单学习任务中，当我们将前20次试验(学习习得阶段)的错误总数 视为协变量kovariaes)用于分析时，乳铁蛋白补充剂显著提高了学习速度(P<0.05)。在困 难学习任务中，当我们将所有40次试验(强化)的总成功数视为共变量(covaries)用于分析 时，bLF补充剂显著提高了学习速度。
[01巧]3.2结果
[0156]与高剂量组和对照组相比，中等剂量组的学习速度(基于学会识别视觉提示所用 的试验次数)是最快的。当把每天的错误数用作学习的度量时，结果表明，对照组的小猪在 困难任务测试中出错更多。第4天的组间差异显著(P<0.05,一般线性模型），运天可视为学 习过程的提取阶段。在保留间隔时间为5分钟、40分钟和3小时时，用乳铁蛋白处理的组存在 记忆改善的趋势。显著的记忆改善出现在间隔时间为40分钟和3小时时，但未出现在间隔时 间为16小时和48小时时。结果说明，对于38日龄的小猪而言，回忆起视觉提示的最大保留间 隔时间（记忆能力）为3小时。然而，不同保留间隔时长下的记忆测试中没有剂量响应。
[0157] 实例4:海马体中抓NF基因表达
[015引对38日龄小猪的海马体组织进行定量逆转录PCR分析(qRT-PCR)，来测定脑源性神 经营养因子(抓N巧的基因表达。
[0159] 如图15所示，乳铁蛋白补充剂显著提高了海马体中抓NF的相对mRNA水平。此外，中 等剂量乳铁蛋白补充剂显著提高了海马体中的抓NF蛋白水平(图16)。
[0160] 由此发现了行为数据和抓NF基因表达结果之间的相关性，运种相关性暗示，乳铁 蛋白膳食可能通过提高抓NF的表达来起作用。
[0161] 实例5:抓NF信号通路中关键基因的表达
[0162] 通过对38日龄小猪的海马体组织进行Affymetrix基因微阵列分析，来测定抓NF信 号通路中关键基因的表达。分析的关键基因在表4中列出。
[0163] 从表4所示的结果可W看出，乳铁蛋白补充剂提高了海马体中抓NF、GRB2、IRS1、 Tr k3、RAPGEF1 (C3G )、CAMK、MAPK11、MAPK12、CREB1、SP1、MYC 和 ESR1 的表达。运些都是抓 NF 信 号通路中的关键基因。BDNF信号通路如图17所示。
[0164] 如上所述，可W确定抓NF信号通路的激活会加强CR邸的憐酸化和核转位。还可W 确定，CREB在133位丝氨酸处的憐酸化(pCREB)诱导基因转录，并在开始学习和记忆的过程 中起关键作用。
[0165] 由乳铁蛋白膳食补充剂上调或下调的抓N巧申经营养因子信号通路的有关基因汇 总
[0166]
[0167]塾
[01側 实例6:海马体中pCREB水平
[0169] 对38日龄小猪的海马体组织进行蛋白质印迹分析，W此测定pCR邸水平。
[0170] 如图18所示，乳铁蛋白补充剂显著提高了海马体中pCR邸的水平。
[0171] 基于实例4至实例6的结果推测，乳铁蛋白补充剂对认知和记忆的影响可至少部分 地来自其对BDNF水平的正面影响，W及BDNF对BDNF信号转导级联和pCR邸水平的后续影响。 [01。] 实例7:海马体和前额叶皮层中的化IySia-NCAM水平。
[0173] 对38日龄小猪的海马体和前额叶皮层组织进行蛋白质印迹分析，W此测定 PolySia-NCAM 水平。
[0174] 如图19所示，乳铁蛋白补充剂提高了海马体和前额叶皮层中PolySia-NCAM的水 平。
[0175] 由此发现了行为数据和PolySia-NCAM水平之间的相关性，运种相关性暗示，乳铁 蛋白膳食可能，至少部分地通过提高POlySia-NCAM水平来起作用。运表明，乳铁蛋白的唾液 酸部分可能在提高神经可塑性和LTM中起关键作用。
[0176] 对由乳铁蛋白补充剂提高的总polySia-NCAM水平进行定量评估的潜在缺陷在于， 运种多糖能够与其他神经营养因子形成络合物，因此可能难W用标准的SDS-PAGE电泳进行 定量。因此，本文所公开的有关海马体和前额叶皮层中poly-Sia-NCAM水平升高的结果，很 可能表示该多糖的较低水平，运一水平实际上已被乳铁蛋白上调。
[0177] 参考文献
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