防止病毒组分聚集的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及防止和/或减少病毒组分聚集的方法。因此本发明设及生物制药的生 产和配制领域，W及疫苗学领域。
【背景技术】
[0002] 聚集是生产(生物)药品(尤其是蛋白质例如单克隆抗体和病毒）中的常见问题。有 关蛋白质聚集的更多背景可参考下述综述(Wei Wang,2005)。聚集可与较高的生产/制造损 失、不稳定性、保质期减少、给药后副作用、不同免疫原性反应，直至疾病的形成本身（例如 阿尔茨海默病、帕金森病(Taylor et al.2002)、航病毒脑病和亨廷顿病)相关。可通过仔细 选择生产过程中所用的缓冲液或培养基来防止聚集（Gu et al.，2003，Cromwell et al.2006)。已知添加化合物例如尿素或脈可稳定蛋白质。然而，运些试剂也影响蛋白质结构 和功效。抑制或防止聚集并非总是成功，不得不进行妥协，运可能导致生产、储存期间（相 对)较高的产物损失或随时间的功效损失。
[0003] 还已知在生产病毒组分(例如基于Sabin的灭活脊髓灰质炎病毒)期间发生不希望 的聚集，运可能导致病毒(组分)生产中纯化产物回收(产量)的大幅变化。因此需要生产病 毒组分的改良方法。
[0004] 病毒是感染剂，其仅能在活细胞内部复制，根据病毒不同，其可感染不同类型生物 体例如动物、植物、细菌和古生菌化oonin EV et al.2006)。病毒由两种或=种不同部分组 成:遗传材料和病毒蛋白包被，有时补充有脂双层膜或包膜。病毒包被由多种蛋白质组成， 其形成高度复杂的四级结构，螺旋、二十面体或甚至更复杂的结构。有关病毒的更多背景参 见下述参考文件(Fields Virology,2007)。
[000引研究中我们关注脊髓灰质炎病毒和流感病毒分别作为未包膜和包膜病毒的模型。 通常，脊髓灰质炎病毒常用作病毒去除验证研究中未包膜RNA病毒的模型，作为小核糖核酸 病毒的代表（MiIlipore技术手册：AN1650EN00 ,WWW.bioreliance. com/libraiT/"?id = 90, http://www.criver.com/files/pdfs/bps/bp_r_viral_tse-clearance_studies.aspx)。 此外，脊髓灰质炎病毒已被良好研究，可获得有关其的大量科技文献，运使得其成为合适的 候选。使用不同株系的流感病毒作为包膜病毒的代表。由于变异性(抗原漂移），流感病毒每 年都引起广泛关注。全球都在研究流感病毒，同时病毒负荷使其成为任何疫苗改良的可靠 目标。高度变异性使流感病毒成为快速检测本发明针对许多变异进行减少和防止聚集的合 适代表，显示出本技术可用于广泛的范围。
[0006]脊髓灰质炎还称为脊灰或小儿麻搏，其是由=种相关病毒血清型:脊髓灰质病毒1 型、2型和3型引起的感染型病毒疾病。脊髓灰质炎病毒属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒 属。人类中，脊髓灰质炎病毒主要通过粪-口或口-口传播获得。感染后，脊髓灰质炎病毒在 胃肠道繁殖，并从该处进入中枢神经系统。此类感染可引起擁痕。脊髓灰质炎无法治愈。然 而，其可通过疫苗预防。现在，市售可得两种安全且有效的脊髓灰质炎疫苗：〇ral Polio 化CCine(OPV)和Inactivated Polio化CCine(IPV) eOPV基于脊髓灰质炎病毒的减毒株（所 谓Sabin株，W首次开发OPV的AAed Sabin命名），该疫苗通过口腔途径给予。相反，IPV基 于使用纯化的野生型脊髓灰质炎病毒株，其经化学杀伤并通过肌肉内注射给予。IPV由 Jonas Salk首次开发[关于脊髓灰质炎和脊髓灰质炎疫苗可得到数篇综述：Koch and Koch,1985;Duchene et al.,1990;Kew et al.2005;Heinsb;roek and Ruitenbe;rg,2010]。
[0007] 两种可得的脊髓灰质炎疫苗(OPV和IPV)均提供高水平的针对麻搏型脊髓灰质炎 的保护。因此OPV是全球脊髓灰质炎根除的优秀疫苗选择，因为其具有容易给药和较廉价的 优势。然而，一些情况中OPV可引起疫苗相关的麻搏型脊髓灰质炎(VAPP)或可能产生源自疫 苗的脊髓灰质炎病毒（VDPV)，一旦成功根除就应优选停止比ew et al.，2005;化ymann et al.,2005&2006;Quimakov et al.,2007;化thanson&Kew,2010;Aylward and Tangermann, 2011] 。运还没有算上OPV可能回复为野生型变体化ee et al 2012)。因此，越来越需要新 型、安全和有效的脊髓灰质炎疫苗。全球根除后脊髓灰质炎接种政策的方向依赖于但不限 于IPV的可用性和价格IiHeinsbroek and Ruitenberg,2010;Thompson and Tet)bens, 2012] 。
[0008] 为了在脊髓灰质炎根除后停止使用OPV, W及降低每剂量IPV的成本，采用了许多 不同方法。运些方法包括但不限于:a)基于减毒Sabin脊髓灰质炎病毒株的IPV(Sabin-IPV) [Bakker et al. ,2011;化midi&Bakker,2012] ;b)基于新设计的其他脊髓灰质炎病毒种株 的IPV[化umakov et al.，2008;Robinson HL 2008;化midi&Bakker，2012];c)产自有效支 持脊髓灰质炎病毒复制的其他哺乳动物细胞的IPV阳amidi&Bakker，2012; Sanders et al.，2012;化ucelI，US0027317，2011 ]。在所有此类开发中，可通过在上游和下游过程优化 (例如更有效地使用生物反应器的生产量）中实施已知方法，W及全面的现代化(例如使用 无动物组分的细胞和病毒培养基、一次性滤器等)来实现成本价格降低。
[0009] 现在，IPV最通常是基于使用S种野生型高毒力株:MahoneyQ型脊髓灰质炎病 毒）、MEF-1(2型脊髓灰质炎病毒)和Saukett(3型脊髓灰质炎病毒）。脊髓灰质炎病毒在哺乳 动物细胞培养物中分别生长。随后，数个纯化步骤后，用福尔马林（甲醒)灭活脊髓灰质炎病 毒，之后其可与最终所需的制剂混合并填充。
[0010] 流感病毒引起急性呼吸道感染，具有显著的患病率和死亡率。流行性最广的是学 龄儿童。小孩、年长者和患有肺和屯、脏疾病、糖尿病或严重哮喘的人有患严重流感的风险。 临床上，流感包括伴随肌痛、头疼和咳嗽的急性发热性疾病。
[0011] 虽然已知流感达数个世纪，仍长期不知晓其致病剂。首例人类流感病毒于1933年 分离。
[0012] 该病毒可在含胚蛋上增殖(仍为常见实践方法，之后补充了在细胞培养物中生长 病毒的能力），显著方便了对病毒的研究能力。
[0013] 流感病毒是正粘病毒科(Odhomyxoviridae)的RNA病毒，其由脂质包膜围绕的八 区段RNA组成。包膜上存在两种主要蛋白质（抗原）：神经氨酸酶(NA/N)和血凝素化A/H)。血 凝素是蛋白质，其将病毒与呼吸道上皮的细胞结合，随后将病毒膜和上皮细胞膜融合，允许 细胞进入。神经氨酸酶是病毒酶，其促进新产生的病毒颗粒从感染细胞中释放。
[0014] 除了人之外，流感病毒还可感染广范围的动物种类，与人最相关的为鸟和猪，运是 因为运些物种的病毒通常也可感染人类。流感病毒的显著特征是变异性。变异性由免疫选 择驱动，表明病毒会不断尝试躲避宿主的免疫。运可通过逐步突变其抗原(称为抗原漂移） 或通过与相关株系交换编码抗原的整个RNA区段(抗原转移)来实现。免疫选择设及针对表 面抗原的抗体应答，和设及较低程度的T细胞应答，其主要针对内部蛋白质。
[0015] 由于抗原漂移，针对季节性流感的新疫苗需要每年生产，其包括每个季度中循环 病毒株上表达的抗原。抗原转移或一系列的抗原漂移突变可能引起大流行。针对大流行爆 发保护需要使用新开发的含大流行病毒所表达抗原的有力疫苗。
[0016] 如本文所述，发明人鉴定到生产病毒组分和含所述病毒组分的改良组合物的改良 方法，其中聚集得到防止或减少。
【发明内容】
[0017] 本发明的第一方面设及生产包含肠道病毒颗粒组合物的方法，所述方法包括步 骤:a)制备含肠道病毒颗粒的培养基;b)从培养基中纯化所述肠道病毒颗粒，其中在纯化的 至少部分期间存在碱性氨基酸或其衍生物，其浓度足W防止或减少所述肠道病毒颗粒聚 集；和任选地下述步骤的至少一个：C)灭活所述肠道病毒颗粒；和d)配制所述肠道病毒颗 粒，其中所述碱性氨基酸或其衍生物选自：精氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸-HCl、赖氨酸-肥1、组氨酸-肥1、脈基下胺、二盐酸心精氨酸乙醋、氨甲环酸、N-E-甲酯基A-赖氨酸、Dk5-径赖氨酸盐酸盐、二盐酸心赖氨酸甲基醋、3-甲基-L-组氨酸、二盐酸a-甲基-Dk组氨酸、其 盐及其组合。
[0018] 优选在所述方法中，在步骤C)的至少部分期间存在碱性氨基酸或其衍生物，其浓 度足W防止或减少所述肠道病毒颗粒聚集，且其中任选地，在步骤d)期间也存在浓度足W 防止或减少所述肠道病毒颗粒聚集的碱性氨基酸或其衍生物W配制药物组合物，所述药物 组合物含所述肠道颗粒和任选的足W防止或减少所述肠道病毒颗粒聚集的浓度的碱性氨 基酸或其衍生物。
[0019] 更优选地，所述方法中优选的在步骤b)、c)和d)的至少一个的整个期间维持所述 碱性氨基酸或其衍生物的浓度，所述浓度足W防止或减少所述肠道病毒颗粒聚集。
[0020] 根据本发明的方法中，碱性氨基酸或其衍生物的浓度优选为至少O.OlmM、优选为 0.0 l-1000 mM 的范围。
[0021] 根据本发明的方法中，肠道病毒颗粒优选为选自脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A病毒、 柯萨奇B病毒、埃可病毒和肠道病毒68、69、70、71和73的肠道病毒的肠道病毒颗粒。更优选 地，肠道病毒颗粒包含脊髓灰质炎病毒血清型1、2和3。在一个实施方式中，肠道病毒颗粒优 选为肠道病毒的病毒样颗粒。
[0022] 本发明方法中，包含肠道病毒颗粒的组合物优选为疫苗。更优选地，所述疫苗是灭 活脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)。
[0023] 本发明还设及使用选自下组的碱性氨基酸或其衍生物:精氨酸、赖氨酸、组氨酸、 精氨酸-HC1、赖氨酸-HC1、组氨酸-HC1、脈基下胺、二盐酸心精氨酸乙醋、氨甲环酸、N-E-甲 酷基-L-赖氨酸、〇心5-径赖氨酸盐酸盐、二盐酸心赖氨酸甲基醋、3-甲基-L-组氨酸、二盐酸 a-甲基-Dk组氨酸、其盐及其组合，用于防止或减少肠道病毒颗粒的聚集，其中优选地所述 肠道病毒颗粒为选自脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A病毒、柯萨奇B病毒、埃可病毒、鼻病毒和肠 道病毒68、69、70、71和73的肠道病毒的肠道病毒颗粒，更优选地，所述肠道病毒颗粒是血清 型1、2和3中至少一种的脊髓灰质炎病毒，最优选地，所述肠道病毒颗粒是灭活脊髓灰质炎 病毒疫苗(IPV)。
[0024] 本发明另一方面设及包含病毒的病毒颗粒和碱性氨基酸或其衍生物的组合物，所 述病毒属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)或正粘病毒科((Irthomyxoviridae)，所述碱性 氨基酸或其衍生物选自：精氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸-肥1、赖氨酸-肥1、组氨酸-肥1、脈 基下胺、二盐酸心精氨酸乙醋、氨甲环酸、N-E-甲酯基A-赖氨酸、〇心5-径赖氨酸盐酸盐、二 盐酸心赖氨酸甲基醋、3-甲基-k组氨酸、二盐酸a-甲基-Dk组氨酸、其盐及其组合，其中： a)组合物中碱性氨基酸或其衍生物的总浓度高于培养基中存在的碱性氨基酸或其衍生物 的总浓度;b)所述组合物不含缓冲液，且优选不含酪红;和/或，C)所述组合物基本由病毒颗 粒、碱性氨基酸或其衍生物和任选地，水或其他液体运载体组成，所述碱性氨基酸或其衍生 物的总浓度为至少O.OlmM。优选在组合物中，相比不含所述碱性氨基酸或其衍生物的对应 组合物中病毒聚集体的形成，所述组合物中病毒聚集体的形成减少。
[0025] 本发明另一方面设及上述组合物用作药物。
[0026] 发明详述
[0027] 我们惊奇地发现碱性氨基酸(例如精氨酸)和其数种衍生物可用于在疫苗生产的 不同病毒(包膜（即流感病毒)和未包膜（即脊髓灰质炎病毒））过程中W及（中间）病毒产物 储存期间防止聚集形成，并用于溶解(分散/分解)已经形成的聚集体。运些病毒源自不同培 养系统(流感病毒的含胚蛋和脊髓灰质炎病毒的细胞培养基）。因此，已实现显著更高的病 毒生产回收率和/或更好地移除污染物而保持生物活性产物。运种更高的病毒产量是无法 预见的，其提供了超出已知病毒纯化方法的显著经济优势。
[0028] 先前显示将碱性氨基酸防止聚集用于单克隆抗体（Arakawa T，et日1，2004; US2012264918)and proteins(Baynes BM，2004 and 2005)。然而其未在高度复杂的四级蛋 白质结构例如病毒中得到佐证。Clostridium ToxoicKUS 2011/0045025)的案子中，精氨酸 甚至促进聚集。
[0029] 此外，还显示碱性氨基酸例如精氨酸具有杀病毒活性(Yamasaki H，et日1，2008; Utsunimoya H，et al，2009;Arakawa T，et al,2009)，使其不可能作为用于病毒和病毒组 分加工期间的物质。
[0030] 使用碱性氨基酸抑制正常蛋白质聚集的方法已被鉴定。本发明中，我们发现可针 对由数种不同蛋白质"嵌段"组成（多蛋白质/多亚基结构)并形成稳定四级结构(本案中为 病毒疫苗或生物复合物）的高度复杂结构的聚集进行抑制、减少和/或防止。本领域技术人 员理解一些蛋白质单独形成=级结构，一些情况中可通过碱性氨基酸稳定化。然而，病毒由 多种运些（不同）四级结构一起组成并键合/集合W形成具有螺旋、二十面体或甚至更复杂 结构的（临时)/稳定产物（四级结构）。本发明测试的病毒之一具有此类复杂结构，因其由膜 包封组成。病毒与正常复杂（生物）四级蛋白质结构不同，其能通过利用宿主细胞而复制并 繁殖/再生自身并可通过自然选择进行进化化Oles EC 2007;Taylor DJ，et al 2013)。此 外一些病毒具有形成用于转运基因组材料至宿主细胞中的特定结构的能力（Sun L，et al 2014)或被其他病毒（所谓隧菌体）寄生的能力（Pearson H,2008;and Desnues,C,et al 2010)。
[0031] 包膜和未包膜病毒进入细胞都需要细胞受体和病毒包被或包膜之间的相互作用。 其对某些宿主细胞特异，类似钥匙和锁。该病毒四级结构需要维持在正确的构型/结构（部 分形成所述病毒包被），因其初始功能是在细胞间传递中保护基因组（例如免受热、pH、UV 等）W及结合至易感宿主细胞，在实体内部或从外部环境进入完全新的个体/宿主实体。
[0032] 考虑病毒组分的结构的复杂性、工作量和复杂度，本领域技术人员无法预见使用 碱性氨基酸能防止或减少聚集同时病毒结构保持完整并且感染型、特异性和免疫原性得到 保留。
[0033] 因此，在第一方面，本发明设及防止和/或减少病毒组分聚集的方法，包括使用碱 性氨基酸或其衍生物或其混合物。防止和/或减少病毒组分聚集的方法优选用于生产含病 毒组分的组合物的方法或其部分中。
[0034] 碱性氨基酸或其衍生物
[0035] 碱性氨基酸可为药学上可接受的任何〇-或心氨基酸。碱性氨基酸可为氯化物的形 式(例如结合一个或多个盐酸盐)或其他偶联化学形式。该氨基酸包括3个标准"蛋白性"或 "天然"氨基酸:组氨酸、精氨酸、赖氨酸及其衍生物。组氨酸、精氨酸和/或赖氨酸可为光学 〇-或心异构体或其混合物，虽然优选氨基酸为心异构体。
[0036] 碱性氨基酸的衍生物可为本领域技术人员可W合成的任何衍生物形式：参见例 如：
[0037] http://www.sigmaaldrich.com/chemistry/chemistryproducts.html7TablePag e = 1625523或Sigma Al化ich的"氨基酸衍生物"产品目录或其他任何商业来源。
[0038] 碱性氨基酸的衍生物可为组氨酸、精氨酸或赖氨酸的手性或异构形式。碱性氨基 酸的衍生物可为组氨酸、精氨酸或赖氨酸的代谢产物。优选的赖氨酸衍生物选自：氨甲环 酸、N-E-甲酯基-L-赖氨酸和赖氨酸的单或二盐酸盐例如化-5-?赖氨酸盐酸盐、二盐酸心 赖氨酸甲基醋。优选的精氨酸衍生物选自：N-a-乙酷基A-精氨酸、脈基下胺、脈基下胺硫酸 盐和精氨酸的单或二盐酸盐例如二盐酸k精氨酸乙基醋。优选的组氨酸衍生物选自：3-甲 基-1^-组氨酸和组氨酸的单或二盐酸盐例如二盐酸a-甲基-〇心组氨酸。
[0039] 在优选的实施方式中，碱性氨基酸或其衍生物选自精氨酸、D-精氨酸a-赖氨 酸、k组氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸的手性/异构/外消旋形式、精氨酸-肥1、赖氨酸-肥1、 组氨酸-肥1、精氨酸、赖氨酸、组氨酸的代谢产物、N-乙酷k精氨酸、脈基下胺、脈基下胺硫 酸盐、二盐酸心精氨酸乙醋、氨甲环酸、N-E-甲酯基A-赖氨酸、赖氨酸单盐酸盐、组氨酸单 盐酸盐、精氨酸单盐酸盐、赖氨酸二盐酸盐、组氨酸二盐酸盐、精氨酸二盐酸盐、〇心5-径赖 氨酸盐酸盐、二盐酸盐心赖氨酸甲基醋、3-甲基-L-组氨酸和二盐酸a-甲基-Dk组氨酸、精 氨酸-谷氨酸、精氨酸-乙酸、精氨酸-天冬氨酸盐、精氨酸-硫酸盐、赖氨酸-谷氨酸盐、赖氨 酸-乙酸盐、组氨酸-乙酸盐、下酷基-心精氨酸、Na-挪油酷精氨酸乙基醋、盐酸N-[3-烧 基（12,14)氧-2-径丙基]A-精氨酸精氨酸挪酸醋。还涵盖碱性氨基酸或其衍生物可与 盐形式组合，所述盐形式例如精氨酸-谷氨酸，精氨酸-乙酸，精氨酸-天冬氨酸等。
[0040] 碱性氨基酸或其衍生物可加入含病毒组分和其聚集体的组合物或溶液中，获得范 围为 0.0 l-1000 mM 或 0.015-1000mM 的终浓度，或至少 0.01、0.015、0.05、0.10、0.15、0.20、 0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、81、90、 100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、 290、300、310、320、330、：340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、 480、490、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000111]\1和/或少于1000111]\1、950、 900、850、800、750、700、650、600、550、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、 390、380、370、360、350、：340、330、320、310、300、290、280、27