用于治疗的免疫原性组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及葡萄球菌免疫原性组合物和疫苗、它们的制备和运样的组合物在药物 中的用途的领域。更具体地，它设及与载体蛋白缀合的、得自金黄色葡萄球菌(S. aureus) 的芙膜糖制备的缀合物的用途。运样的缀合物可W与选定的葡萄球菌蛋白抗原组合W形成 多价组合物。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Sta地ylococcus aureus, S. aureus)是寄居在约30%的人受试 者的鼻孔、蔽、咽W及其它粘膜表面和皮肤表面的共生性革兰氏阳性细菌。据估计，金黄色 葡萄球菌引起所有健康护理相关感染的20-25%(Wisplin曲off等人Clin Infect. Dis . 2004; 39; 309-317)，导致受感染的患者与不具有运样的感染的患者相比3倍的住院期持 续时间和高5倍的住院死亡风险（Noskin等人Arch. Intern. Med. 2005; 165; 1756-1761)。金黄色葡萄球菌感染可W与高达25%的住院死亡率相关。在历史上，金黄色葡萄球菌 已经主要与医院感染相关。运样的感染的严重性已经随着与抗生素抗性有关的金黄色葡萄 球菌感染的最近急剧增加而增加。金黄色葡萄球菌是具有显著发病率和死亡率的医院感染 的最常见原因（Romero-Vivas等人1995，Infect. Dis. 21; 1417)。它是骨髓炎、屯、内膜 炎、脈毒性关节炎、肺炎、脈肿和中毒性休克综合征的一些病例的原因。
[0003] 已经研究了包括施用针对葡萄球菌抗原的多克隆抗血清的被动免疫疗法(WO 00/ 15238, WO 00/12132)W及使用针对脂憐壁酸的单克隆抗体的免疫疗法(WO 98/57994)。但 是，迄今都没有被许可使用。几种免疫疗法候选物在人类中没有表现出效力。运些包括： Altastaph (Nabi Biopharmaceuticals),其含有从接种了StaphVAX ? (由Nabi Biopharmaceuticals, Rockville, MD, USA开发和注册商标的研究疫苗）的受试者纯化出 的CP5和CP8抗体;Veronate (InMbitex)，祀向金黄色葡萄球菌聚集因子A (ClfA)和表皮 葡萄球菌（S.邱idermidis)粘附S化G的多克隆抗体;Aurexis (替非珠单抗，Inhibitex), 革己向ClfA的单克隆抗体;Aurograb (NeuTec Pharma)，针对ATP-结合盒转运蛋白的单链抗 体；和帕昔单抗（Biosynexus)，单克隆抗-脂憐壁酸抗体（De jonge等人J. Paediatrics 2007; 151; 260-265, Ru卵等人Antimicrob. Agents Qiemother . 2007; 51; 4249-4254)。
[0004] -种替代方案是使用主动疫苗接种来产生针对葡萄球菌的多克隆免疫应答。在WO 03/61558中报道的一个方案使用与假单胞菌属(Pseudomonas)胞外蛋白A缀合的金黄色葡 萄球菌5型和8型芙膜多糖的缀合物(S化地VAX - Nabi Biopharmaceuticals)。另一个方案 使用金黄色葡萄球菌Is地蛋白（V710 - Merck & Co),但是没有表现出效力(Fowler等人 2013; JAMA 309; 1368-1378)。
[000引存在许多与针对金黄色葡萄球菌感染的疫苗的开发有关的问题。依赖于单一组分 (芙膜多糖或Is地蛋白）的疫苗的失败提示，可能需要含有多种组分的更复杂的疫苗来诱导 保护性免疫。但是，在免疫原性组合物中组合不同抗原可W导致在所述组合物中发生的干 扰（Skurn化等人（2010) J. Clin. Invest. 120; 3220-3233)。因此，要在多价组合物中组 合的组分的鉴别不是直接的。仍然存在开发针对葡萄球菌感染的有效疫苗的需要，特别是 考虑到多药抗性菌株的逐渐增加的频率。
[0006] 在针对医院葡萄球菌感染进行免疫的情况下，免疫经常可W仅在住院治疗或外科 手术或留置导管安置之前短时间进行。因此，将其有利的用单次免疫达到高免疫水平。较低 剂量的缀合物的应用还具有疫苗生产的相对效率和有关经济效益的优点。
[0007] 因此，提供了一种针对金黄色葡萄球菌感染进行免疫的方法，所述方法包括W下 步骤:给人患者施用单次剂量的包含金黄色葡萄球菌5型芙膜糖的免疫原性组合物，所述金 黄色葡萄球菌5型芙膜糖与载体蛋白缀合W形成金黄色葡萄球菌5型芙膜糖缀合物，其中所 述金黄色葡萄球菌5型芙膜糖缀合物W3-50 yg、5-25 yg、3-20 yg、3-12 yg、5-10 yg、7-20 yg、7-15 iig或8-12 iig的糖剂量施用。
[0008] 在本发明的第二方面，提供了一种包含金黄色葡萄球菌5型芙膜糖的免疫原性组 合物，所述金黄色葡萄球菌5型芙膜糖与载体蛋白缀合W形成金黄色葡萄球菌5型芙膜糖缀 合物，其中所述金黄色葡萄球菌5型芙膜糖缀合物W3-50 yg、5-25 yg、3-20 yg、3-12蛇、 5-10 yg、7-20 yg、7-15 iig或8-12 iig的糖剂量施用，其用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感 染，其中给人患者施用单次剂量的免疫原性组合物。
[0009] 在本发明的第=方面，提供了一种免疫原性组合物，其包含与载体蛋白缀合的金 黄色葡萄球菌5型芙膜糖、与载体蛋白缀合的金黄色葡萄球菌8型芙膜糖、ClfA蛋白或其片 段和a类毒素。
[0010] 在本发明的第四方面，提供了一种疫苗，其包含与载体蛋白缀合的金黄色葡萄球 菌5型芙膜糖、与载体蛋白缀合的金黄色葡萄球菌8型芙膜糖、ClfA蛋白或其片段和a类毒素 和药学上可接受的赋形剂。
[0011] 在本发明的第五方面，提供了一种用于制备本发明的免疫原性组合物或疫苗的方 法，所述方法包括下述步骤:a)将金黄色葡萄球菌5型芙膜糖缀合至载体蛋白W形成金黄色 葡萄球菌5型芙膜糖缀合物，b)将金黄色葡萄球菌8型芙膜糖缀合至载体蛋白W形成金黄色 葡萄球菌8型芙膜糖缀合物，和C)将金黄色葡萄球菌5型芙膜糖缀合物、金黄色葡萄球菌8型 芙膜糖缀合物、ClfA蛋白或其片段和a类毒素组合W形成免疫原性组合物。
【附图说明】
[0012] 图1 -在1或2剂量的4C疫苗W后经历疼痛的受试者的百分比。在每个制剂分组中， 前3列提供了在单次剂量W后经历疼痛的受试者的百分比，其中第一列代表所有疼痛报告， 第二列代表超过或等于2级的疼痛，和第=列代表3级疼痛。第4列、第5列和第6列显示了第 二剂量W后的相同信息。
[0013] 图2 -在1或2剂量的4C疫苗W后经历发红的受试者的百分比。在每个制剂分组中， 前3列提供了单次剂量W后经历发红的受试者的百分比，其中第一列代表所有发红报告，第 二列代表超过50mm的发红，且第=列代表超过IOOmm的发红。第4列、第5列和第6列显示了第 二剂量W后的相同信息。
[0014] 图3-在1或2剂量的4C疫苗W后经历肿胀的受试者的百分比。在每个制剂分组中， 前3列提供了单次剂量W后经历肿胀的受试者的百分比，其中第一列代表所有肿胀报告，第 二列代表超过50mm的肿胀，且第=列代表超过IOOmm的肿胀。第4列、第5列和第6列显示了第 二剂量W后的相同信息。
[001引图4-针对金黄色葡萄球菌5型芙膜多糖产生的抗体的免疫原性结果。显示了 Luminex测定的GMC结果，所述Luminex测定在第一次和第二次免疫W后的不同时间点检测 针对5型芙膜多糖的抗体。选择的时间点是免疫之前第0天、一次免疫之后第7天、一次免疫 之后第14天、一次免疫之后第30天、两次免疫之后第7天(对应于图上的第37天）、第14天两 次免疫之后(对应于图上的第44天)和两次免疫之后第30天(对应于图上的第60天）。对于每 个时间点，^5/10、5/1045、10/30、10/3045和盐水的次序(左到右)呈现结果。
[0016] 图5 -针对金黄色葡萄球菌8型芙膜多糖产生的抗体的免疫原性结果。显示了 Luminex测定的GMC结果，所述Luminex测定在第一次和第二次免疫W后的不同时间点检测 针对8型芙膜多糖的抗体。选择的时间点是免疫之前第0天、一次免疫之后第7天、一次免疫 之后第14天、一次免疫之后第30天、两次免疫之后第7天(对应于图上的第37天）、第14天两 次免疫之后(对应于图上的第44天)和两次免疫之后第30天(对应于图上的第60天）。对于每 个时间点，^5/10、5/1045、10/30、10/3045和盐水的次序(左到右)呈现结果。
[0017] 图6 -针对金黄色葡萄球菌a类毒素产生的抗体的免疫原性结果。显示了Luminex 测定的GMC结果，所述Luminex测定在第一次和第二次免疫W后的不同时间点检测针对a类 毒素的抗体。选择的时间点是免疫之前第0天、一次免疫之后第7天、一次免疫之后第14天、 一次免疫之后第30天、两次免疫之后第7天(对应于图上的第37天）、第14天两次免疫之后 (对应于图上的第44天)和两次免疫之后第30天(对应于图上的第60天）。对于每个时间点， W5/10、5/10AS、10/30、10/30AS和盐水的次序(左到右)呈现结果。
[0018] 图7 -针对金黄色葡萄球菌ClfA产生的抗体的免疫原性结果。显示了化ISA的GMC 结果，所述ELISA在第一次和第二次免疫W后的不同时间点检测针对ClfA的抗体。选择的时 间点是免疫之前第0天、一次免疫之后第7天、一次免疫之后第14天、一次免疫之后第30天、 两次免疫之后第7天(对应于图上的第37天）、第14天两次免疫之后(对应于图上的第44天） 和两次免疫之后第30天(对应于图上的第60天）。对于每个时间点，W5/10、5/10AS、10/30、 10/30AS和盐水的次序(左到右)呈现结果。
[0019]图8-金黄色葡萄球菌5型芙膜多糖(小图A)、金黄色葡萄球菌8型芙膜糖(小图B)、a 类毒素(小图C)和ClfA (小图D)在1、2或3次免疫后第0天至第540天的较长时间段的免疫原 性结果。
[0020] 详细描述 本发明公开了一种针对金黄色葡萄球菌感染进行免疫的方法，所述方法包括:给人患 者施用单次剂量的包含金黄色葡萄球菌5型芙膜糖的免疫原性组合物的步骤，所述金黄色 葡萄球菌5型芙膜糖与载体蛋白缀合W形成金黄色葡萄球菌5型芙膜糖缀合物，其中所述金 黄色葡萄球菌5型芙膜糖缀合物W3-50蛇、3-25蛇、3-20蛇、3-12蛇、5-50蛇、5-25蛇、 5-20 yg、5-12 yg、5-10 yg、7-20 yg、7-15 yg或8-12 yg的糖剂量施用。
[0021] 在一个实施方案中，所述免疫原性组合物进一步包含与载体蛋白缀合W形成金黄 色葡萄球菌8型芙膜糖缀合物的金黄色葡萄球菌8型芙膜糖，其中所述金黄色葡萄球菌8型 芙膜糖缀合物W3-50 yg、3-25 yg、3-20 yg、3-12 yg、5-50 yg、5-25 yg、5-20 yg、5-12 y g、5-10 yg、7-20 yg、7-15 iig或8-12 iig的糖剂量施用。
[0022] 在一个实施方案中，相同糖剂量的金黄色葡萄球菌5型芙膜糖缀合物和金黄色葡 萄球菌8型芙膜糖缀合物存在于免疫原性组合物中；例如，4、5、6、7、8、9或10 iig糖剂量的5 型和8型缀合物。
[0023] 大多数在人类中造成感染的金黄色葡萄球菌菌株含有5型或8型多糖。大约60%的 人菌株是8型，且大约30%是5型。Jones Carbohy化ate Research ：340，1097-1106 (2005) 使用NMR光谱法鉴别芙膜多糖的结构为： 5型 一4)-P-D-ManNAcA-(1一4)-a-L-FucNAc(30Ac)-(1一3)-P-D-FucNAc-(1一 8型 一3)-P-D-ManNAcA(40Ac)-(1一3)-a-L-FucNAc(1一3)-a-D-FucNAc(1一。
[0024] 使用技术人员众所周知的方法，例如如在US6294177、W0 11/41003、W0 11/51917 或Infection and Immunity (1990) 58(7); 2367中所述，可W从适当的金黄色葡萄球菌 菌株提取多糖。例如，ATCC 12902是5型金黄色葡萄球菌菌株，且ATCC 12605是8型金黄色葡 萄球菌菌株。
[0025] 多糖具有天然大小，或可选地可W减小尺寸，例如通过微流态化、超声福照或通过 化学处理诸如暴露于pH 5.0-3.0。本发明也涵盖从得自金黄色葡萄球菌的5型和8型多糖衍 生出的寡糖。在一个实施方案中，所述金黄色葡萄球菌5型芙膜糖具有超过25kDa、30kDa、 4040曰、501^)曰、6040曰、7040曰、8040曰或901^)曰或在25-12540曰、90-12540曰、30-10040曰、35-75邸a或40-70W)a之间的分子量。在一个实施方案中，所述金黄色葡萄球菌8型芙膜糖具有 超过 25403、301^)3、401^)3、501^)3、601^)3、701^)3、801^)3或901