组织纤溶酶原激活物抗体及其用图
【专利说明】
[0001 ]本发明利用美国政府的由美国国立卫生研究院基金授予的基金号化58496、 HL92750和NS073147(GR)的基金资助下形成。 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请是2014年1月22日提交的PCT国际申请PCT/US2014/012555的国家阶段申 请，其要求2013年1月22日提交的序列号为61/755,298的美国临时专利申请的优先权，通过 引用将其全文并入本文。
技术领域
[0003] 本申请提供一种组织纤溶酶原激活物抗体及其用途，特别是一种针对组织纤溶酶 原激活物的单克隆抗体及其在组织纤溶酶原激活物治疗后出现的脑出血和系统出血中的 用途。
【背景技术】
[0004] 组织纤溶酶原激活物(TPA或tPA)是对缺血性中风的唯一有效治疗手段，而且它也 能降低急性屯、肌梗死病人的死亡率（Do皿an GA，Davis SM，Parsons MW，Ma H，Dewery HM， 化wells DW.如何在急性缺血性中风中更好地使用溶栓治疗巧OW to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke)，自然神经学综述（Nat Rev 化urol)，2011; 7:400-409)。然而，TPA疗法会明显增加严重或致命性出血的风险。TPA治疗 后的烦内出血会造成严重后果，并且大约1%的接受TPA治疗的中风病人会严重致残或产生 致命性出血（Saver JL.中风溶栓疗法后的出血：临床相关病例数化emorrhage after thrombolytic therapy for stroke: the clinically relevant number needed to harm),卒中（Stroke) ,2007:38:2279-2283 D相似地，0.9-1.0% 的接受 TPA 治疗的屯、肌梗死 病人发生顾内出血且发生顾内出血的病人中超过50%死亡（Gurwitz JH，Gore JM， GoWberg RJ，等.急性屯、肌梗死组织纤溶酶原激活物治疗后的顾内出血的危险.国家屯、肌 梗死注册登i己2(民isk for intracranial hemorrhage after tissue plasminogen activator treatment for acute mycocardial infarction.Participants in the National Registry of Mycocardial infarction 2).美国内科年鉴（Ann Inter Med) .1998; 129:597-604) D尽管出血并发症常见于老年人，在儿童中同样存在由TPA导致的显著 性出血的危险(Gupta AA，Leaker M，An虹ew M，等?使用组织纤溶酶原激活物治疗儿童血管 内血栓的溶栓安全性和效果（Safety and outcomes of thrombolysis with tissue plasminogen activator for treatment of intravascular thrombosis in children). 儿科杂志(J Pediatr). 2001:139:682-688) D对出血并发症的担屯、减少了对病人的TPA治疗 用药，尽管这些病人可能会在某些方面受益（（Saver JL.中风溶栓疗法后的出血:临床相关 病例数（Hemorrhage after thrombolytic therapy for stroke: the clinically relevant number needed to harm) ?卒中（Stroke) .2007:38:2279-2283) O
[0005] -旦发生TPA诱发的出血，没有合适的特异性TPA抑制剂或解毒剂来治疗出血。为 了恢复凝血，病人被频繁施用冷凝蛋白质、新鲜冰冻血浆、W及血小板，而上述运些疗法的 有效性还没有取得决定性证据(Morgenstern LB,Hemphill JC,化(1,Anderson C等.自发性 烦内出血指南：美国屯、脏协会/美国中风协会医疗用指南（Guidelines for the m曰n曰gement of spontaneous intracerebral hemorrh曰ge:曰 guideline for he曰Ithc曰re professionals from the American Heart Association/American Stroke Association).中风(Shoke) .201041:2108-2129)。抗纤维蛋白溶解剂如凝血酸、e-氨基己 酸、抑肤酶及新型纤溶酶抑制剂已被使用，但也仅在有限的范围内。不幸地是，运些试剂不 仅抑制纤溶酶原(Pg)激活系统，也干扰其他分子途径。如，抑肤酶影响纤溶酶活性W及血管 舒缓素系统，并且诱发严重过敏(Munoz jj, Birkmeyer NJ, Birkmeyer JD, O'Connor GT, Dacey LJ.利用屯、脏手术元分析分析e-氨基己酸是否和抑肤酶一样有效地降低出血（Is epsilon-aminocaproic acid as effective as aprotinin in reducing bleeding with cardiac surgery 曰 met曰-曰n曰lysis).循环（Circul曰tion) .999;99:81-89)。
[0006] 对TPA诱发出血的机理仍知之甚少。相对于链激酶，TPA的纤溶酶原激活被纤维蛋 白显著地放大，而且TPA的运种显著特性预计会增强纤维蛋白溶解而不增加出血并发症。然 而，由TPA产生的过量纤溶酶可能会降解血液循环中的凝血因子，其影响凝血并且可能会加 剧体内出血。TPA是一种通过其催化和非催化作用而发挥功效的多结构域分子。实验证明 TPA的非催化活性(比如不引起纤溶酶原激活的）引起血脑屏障的分解并且是一些TPA诱发 的脑出血产生的原因。TPA诱发的脑出血是否与TPA的催化活性有关也同样不清楚。TPA疗法 对于缺血性中风和屯、肌梗死的治疗是有益的，但由于一些病人出现的严重或致命性脑部或 其他位的出血又使该疗法复杂化。对TPA诱发的出血的担屯、已经限制了 TPA的治疗应用。TPA 诱发的出血和预后不良在长期局部缺血后更加常见。相似地，在实验性脑中风中，长期局部 缺血后，TPA可反复地引起脑缺血、血脑屏障分解并加剧神经细胞死亡。
[0007] 在非血栓性中风模型中，证据表明TPA可通过机制产生毒性，比如PDGF-CC断裂等， 其不需要纤溶酶原激活或影响溶解纤维蛋白活性(Su EJ，Fre化化sson L，Geyer M等.缺血 性中风中被组织纤溶酶激活的PDGF-CC的活性损害血脑屏障的完整性（Activation Of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic shoke.).自然医学（化t Med).2008;14:731-737)。在如中风和屯、肌缺 血的病理条件下，治疗性TPA的溶解纤维蛋白活性被提高的循环纤维蛋白片段(例如D-二聚 体）水平所增强，其可W增强出血过程(Barber M,Lan曲orne P,Rumley A,Lowe GD,Stott DJ.D-二聚体预示缺血性中风的早期进展：常规临床检测确证(D-dimer predicts early clinical progression in ischemic stroke:conf irmation using routine clinical assays).卒中（Stroke). 2006; 37:1113-1115)0 发明概述
[0008] 本概述描述了本公开主题的多种实施方案，并且，在多种情况中，列出了运些实施 方案的变化和变换。本概述仅仅是多种变化的实施方案的示例。给定的实施方案所提及的 一或多个代表性特征同样是示例性的。运类实施方案中可W包含或不包含所提及的特征； 同样地，运些特征可W应用于本公开主题的其他实施方案中，无论是否在本概述中列出。为 避免过分重复，本概述不列出或示出运些特征的可能组合。
[0009] 本发明通过提供可尤其抑制TPA诱发的纤维蛋白溶解的抗体及其抗原结合片段满 足上述需求及其相关。本发明的部分基于发现，即发现组织纤溶酶原激活物通过一种纤维 蛋白依赖机制唯一地激活纤溶酶原，而纤溶酶原在缺血性中风中导致脑出血。协同单克隆 抗体通过减少TPA治疗后的脑出血、手术出血和脑部细胞死亡阻断运种行为。
[0010] 在一些实施方案中，本发明提供特异性地结合至人组织纤溶酶原(TPA)或TPA突变 体的分子。该分子具有亚纳摩尔级亲和力W抑制纤维蛋白依赖的纤溶酶原活性，1巧〇< 50nM。所述TPA突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2具有至少65%的一致性。 在一些实施方案中，该分子不抑制人纤维蛋白凝块的降解，不影响TPA酷胺解活性或者非纤 维蛋白依赖激活。
[0011] 在一些实施方案中，本发明进一步提供了一种用于TPA治疗后的病人所出现的系 统性出血、脑出血和/或中风的治疗方法。该方法包括给所述病人施用有效剂量的所述分 子，其中所述分子选择性地抑制上述病人的纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。在一些实施方 案中，所述分子可W是抗体或抗体结合片段。
[0012] 本发明的一些实施方案进一步提供一种提纯或分离的抗体，该抗体特异性结合至 组织纤溶酶原激活物(TPA)并且抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解。在一些实施方案中， 本发明公开了一种提纯或分离的单克隆抗体，该单克隆抗体特异性结合至TPA分子W抑制 TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解。更特定地，所述分离的单克隆抗体确定为可选择性地抑制 纤维蛋白放大的纤溶酶原激活的TPAi-14和/或TPAi-23。
[0013] 在本发明的一些实施方案中，提出一种由药物组合物和药物载体，该药物组合物 由有效剂量的可治疗TPA诱发的系统性出血和脑出血的抗体构成。
[0014] 本发明的一些实施方案进一步提供一种特异性结合至人组织纤溶酶原激活物 (TPA)或TPA突变体的提纯或分离的抗体。在一些实施方案中，TPA突变体的氨基酸序列与 SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2具有至少65%的一致性。在一些实施方案中，抗体具有亚纳摩 尔级亲和性W抑制纤维蛋白依赖的纤溶酶原激活，I巧〇<5nM。在一些实施方案中，抗体不抑 制人纤维蛋白凝块的降解，不影响TPA酷胺解活性或者非纤维蛋白依赖激活。
[0015] 本发明的一些实施方案更进一步提供一种能够在TPA治疗后的病人需要时治疗所 出现的系统性出血、脑出血和/中风的方法，包括给所述病人施用有效剂量的抗体，其中所 述抗体选择性地抑制病人的纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。
[0016] 本发明的一些实施方式提供了一种能够在TPA治疗后的病人需要时治疗所出现的 系统性出血的试剂盒。该试剂盒包括特异性结合至TPAW抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶 解的提纯或分离的抗体及其在治疗系统性出血、脑出血和/或中风中的说明。
[0017] 本发明的一些实施方案进一步提供一种能够在TPA治疗后的病人需要时治疗所出 现的系统性出血的方法。该方法包括给病人施用有效剂量的至少一种提纯或分离的抗体， 所述抗体能够结合至TPA表位。在一些实施方案中，该抗体在病人中特异性地抑制纤维蛋白 放大的纤溶酶原激活。本发明在一些进一步的实施方案中，提纯或分离的抗体中的至少一 种为W高亲和性结合至TPA不同表位的TPAi-14或TPAi-23或TPAi-14和TPAi-23。
[0018] 本发明公开的一些实施方案进一步提供一种鉴别可抑制TPA诱发的人纤维蛋白溶 解的分子的方法。该方法包括如下步骤:提供特异性地结合至TPA且抑制TPA诱发的人凝块 纤维蛋白溶解的单克隆抗体，固定所述单克隆抗体到一表面，提供TPA且引入一种阻断所述 TPA的非特异性结合区域的试剂，引入一种候选分子至所述TPA，引入所述TPA至所述单克隆 抗体，确定所述候选分子是否已结合至TPA表位，该表位是所述单克隆抗体结合至TPA的位 置，任何结合至所述表位的候选分子确定作为能够抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解的 分子。
[0019]