专利名称：鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法
技术领域：
本发明是关于一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，具体是将鼠疫菌体经溶菌酶处理先制备粗提Pla蛋白然后采用羟基磷灰石层析柱进行层析纯化制备纯化Pla蛋白的方法，本发明还涉及该方法提取纯化得到的Pla蛋白制品及其在杂交瘤株建立与筛选中的应用。
背景技术：
鼠疫菌纤溶酶原激活因子(Plasminogen activator,Pla)是鼠疫菌特有的pPCPl 质粒编码的细胞膜表面蛋白酶，研究表明，鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla蛋白是鼠疫菌从皮下感染扩散到循环系统的重要毒力因子(Sodeinde OA, Subrahmanyam YV, Stark K，et al. A surface protease and the invasive character of plague[J]. Science,1992, 258(6) :1004-1007 ；Goguen JD, Hoe NP, Subrahmanyam YVBK. Proteases and bacterial virulence :a view from the trenches [J]. Infect Agents Dis，1995，4 (1) :47-54)，在鼠疫菌致病过程中发挥重要作用。提取鼠疫菌Pla蛋白并进行纯化，可以用于鼠疫的辅助免疫学检测、鼠疫菌的毒力等相关研究。Pla蛋白有三种形式α-Pla、β _Pla、Y_Pla，相对分子质量(Mr)分别为37000、35000、31000。Pla蛋白提取物常常混杂有其它蛋白，对其进行纯化是很有必要的。常用的对细胞膜蛋白进行提取的方法有超声破碎法、弗氏细胞压碎法、盐洗脱法、 表面活性剂提取法、尿素法等等。石丽媛等人对Pla的分离纯化进行了研究(SDS-PAGE制备凝胶纯化鼠疫菌Pla蛋白，医学动物防制，2008年12月第M卷第12期；鼠疫菌纤溶酶原激活因子的分离纯化，中国地方病学杂志，2009年第观卷第4期)，分别用超声破碎、尿素提取与硫酸铵盐析相结合的方法(简称超声法、尿素法)提取Pla，并分别用离子交换、凝胶过滤两步层析相结合的高效液相色谱和制备电泳纯化Pla，对提取、纯化的Pla进行纤溶酶原激活剂活性检测。其中超声法和尿素法可以提取到Pla，后者经高效液相色谱和制备电泳可以达到基本纯化。然而，采用尿素抽提法提取Pla蛋白时，采用透析方法难以将尿素清除干净，而其存在会对后续的提取与纯化产生影响；该方法得到的粗提物中目的蛋白所占比例不够高， 这使得本来就较少表达的Pla蛋白，经纯化后难以得到足够的收获量。采用制备电泳纯化Pla蛋白存在以下不足1)该方法通过预实验获得数据，采用距离测量的方法来定位切胶位置，存在误差；幻在制备电泳和洗脱蛋白的过程中，表面活性剂、还原剂、加热处理、电场作用等条件，对蛋白质量产生较大影响；幻该法获得的目的蛋白所在位置背景较深，说明有一些其它蛋白存在；4)该方法因采用电泳后切胶再洗脱获取目的蛋白，回收率低，难以满足需要，操作繁琐。且得到的样品不具有酶活性，仅从相对分子质量说明其为Pla蛋白。采用高效液相色谱分离纯化Pla蛋白存在以下不足采用离子交换纯化，大部分目的蛋白流穿，仅小部分余留；如与凝胶过滤结合进行两步层析，可实现对Pla的纯化，但收获量极低，需进行浓缩才能检出蛋白含量，且操作繁琐。同时，虽然三条带可占蛋白总量 80%，仅从相对分子质量及酶活性说明其是Pla，未得到进一步证实(本案发明人在研究中曾对按该方法纯化的蛋白进行质谱分析证实，此3条带并非全为Pla蛋白)。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，利用简单易行的操作提取纯化得到Pla蛋白。本发明的另一目的在于提供按照所述方法提取纯化得到的Pla蛋白。本发明的另一目的在于提供所述纯化得到的Pla蛋白制品在杂交瘤株建立与筛选中的应用。本发明提供了一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，该方法包括将鼠疫菌体经溶菌酶处理，然后经超声破碎，再进行硫酸铵盐析，得到粗提Pla蛋白；粗提Pla蛋白采用羟基磷灰石层析柱(CHT纯化层析柱)进行层析纯化，其中在上样缓冲液中加入Ca离子，洗脱时先采用磷酸盐缓冲液梯度洗脱，以去除非目的蛋白，再用 IN NaOH洗脱目的蛋白，收集样品后用Tris-Cl缓冲液(pH8. 5 9. 0)透析，去除NaOH，得到纯化Pla蛋白。根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述鼠疫菌体为鼠疫菌EV76。根据本发明的具体实施方案，所述鼠疫菌体可以为菌粉，该菌粉可以按照常规方法培养制备。例如，在本发明的一优选具体实施方案中，所述菌粉的制备方法包括将鼠疫菌接种于营养琼脂，28°C孵育48h 72h,用PBS (0. 01M, ρΗ7· 2 7. 4) 7000 8000r/min离心20 30min，洗涤菌体两 三次，加入4倍体积_40°C -60°C预先低温的丙酮，充分混勻，置-40°C _60°C过夜后，4000r/min，10 20min离心，弃上清，再用预冷丙酮以相同方法洗涤菌体3次，弃尽丙酮，37°C温箱过夜制成菌粉。根据本发明的具体实施方案，是按照以下操作进行Pla蛋白的提取与纯化称取鼠疫菌粉，每1. 5g菌粉，加入PBS (0. 01M, ρΗ7· 2 7. 4) 60ml及溶菌酶3mg, 4°C条件下，磁力搅拌(120 180转/分)，3 4h后，菌悬液进行超声破碎，50%功率，每次IOs,间歇10s，共20min ； 10000 12000r/min离心20min,收集上清，加入PBS将溶液总量补足至90ml 100ml。该过程中各试剂用量可按比例增减。上述离心后上清进行硫酸铵沉淀按照每IOOml液体总量加入固体硫酸铵5. 6g， 提取饱和度在0 10 %的沉淀，并用TBS (pH8. 5 9. 0)充分透析至无硫酸铵，得到粗提Pla蛋白。根据本发明的具体实施方案，粗提Pla蛋白可进一步经10000 12000r/min、 20min离心，取上清过0. 45 μ m滤膜，然后进行层析纯化。根据本发明的具体实施方案，在进行层析纯化时，所述上样缓冲液为5 IOmMNaH2PO4, 20mM Tris-Cl, 0. 25mM CaCl2, pH8· 5 9· 0 ；所述洗脱缓冲液为=5OOmM KH2PO4, pH6. 8。优选地，上样流速0. 5 1. Oml/min,洗脱流速2. O 3. Oml/min。具体地，所述层析纯化步骤包括以10倍床体积的上样缓冲液平衡层析柱一上样缓冲液对倍稀释预处理后样品上柱进行结合一以5倍床体积上样缓冲液平衡层析柱一以20倍床体积洗脱缓冲液进行梯度洗脱一以5倍床体积上样缓冲液平衡层析柱一以5倍床体积的IN NaOH洗脱，收集NaOH洗脱峰样品并立即以Tris-Cl缓冲液(pH8. 5 9. 0)进行充分透析，得纯化Pla蛋白。本发明还提供了按照本发明所述方法提取纯化得到的Pla蛋白制品。本发明还提供了所述的Pla蛋白制品在杂交瘤株建立与筛选中的应用。综上所述，本发明提供了一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法， 该方法的关键在于粗提时先将菌体经溶菌酶处理，再采用超声破碎法结合硫酸铵盐析；纯化时在上样缓冲液中加入Ca离子，洗脱时先采用磷酸盐缓冲液梯度洗脱，以去除非目的蛋白，再用IN NaOH洗脱目的蛋白，收集样品后尽快用Tris-Cl缓冲液(pH8. 5 9. 0)透析， 去除NaOH，以保证蛋白性状不受影响、提高目的蛋白的溶解性。用该方法初步提取的Pla蛋白，3条目的蛋白带傭jm細斤鄉少重，Pm·卜.·〒■辭
发明中发现3条这样的目的蛋白带)占蛋白总量33%，蛋白浓度为6.%ig/ml。经纯化后，3 条目的蛋白带占蛋白总量提高至80%，蛋白浓度为0.2(Mmg/ml。使用ABI 4700型飞行时间质谱仪采样分析鉴定，有两条带确认为Pla，占蛋白总量约20%。在应用中，Western blot 实验也表明，Pla单克隆抗体能与该两条带发生特异性结合。本发明的方法易于操作，所得蛋白丰度高、纯度高、回收率高。
图1为超声破碎后上清饱和硫酸铵分段沉淀样品的SDS-PAGE图形(考染)。图中， 从左至右各条带1 0 10% ；2 10 20% ；3 20 30% ；4 30 40% ；5 40 50% ； 6 50 60% ;7 :marker(各蛋白带分子量同图 3) ；8 50 60% ；9 40 50% ； 10 30 40% ；11 :20 30% ；12 :10 20% ；13 :0 10% ； (1 6为超声加溶菌酶处理样品，8 13为未加溶菌酶处理)，图中标注的37、35、31为Pla目的蛋白带。图2为CHT柱层析纯化Pla色谱图形(紫外)。图3为CHT柱层析纯化Pla收集样品的SDS-PAGE图形(考染)。图中，M :marker ； 1 粗提Pla ；2 图2中A峰；3 图2中B峰；4 图2中C峰；5 图2中D峰。图4为粗提和纯化Pla蛋白的SDS-PAGE图形(考染)及质谱分析取样图示。图中，M :marker ；1 纯化 Pla ；2 粗提 Pla。图5A、图5B、图5C分别为图4中蛋白点E4、E5、E9胰酶酶解肽段的MALDI-T0F肽指纹图谱。图6A、图6B、图6C分别为图4中蛋白点E4、E5、E9的Mascot搜库结果。图7显示利用本发明提取纯化的Pla蛋白进行Westernblot鉴定的实验结果。图中，M 预染marker ；1 :15 杂交瘤株；2 :19A4杂交瘤株；3 HH4杂交瘤株。
具体实施例方式为了更清楚地理解本发明的实质，下面通过具体实施例并配合附图进一步详细说明本发明，但本发明并不因此而受到任何限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件操作。
以下各实施例中，所用原始实验材料、仪器用具及试剂均可商购获得，以下提供主要实验材料、仪器用具及试剂的来源1实验菌株实验用鼠疫耶尔森氏菌株EV76由云南省地方病防治所菌种资源库提供。将保存的EV76菌株进行复苏，取单个菌落接种LB半固体培养基，扩大培养于营养琼脂培养基，每次传代同时进行鼠疫菌噬菌体裂解实验。2实验仪器及用具
权利要求
1.一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，该方法包括将鼠疫菌体经溶菌酶处理，然后超声破碎，再进行硫酸铵盐析，得到粗提Pla蛋白； 粗提Pla蛋白采用羟基磷灰石层析柱进行层析纯化，其中在上样缓冲液中加入Ca离子，洗脱时先采用磷酸盐缓冲液梯度洗脱，以去除非目的蛋白，再用IN NaOH洗脱目的蛋白， 收集样品后用Tris-Cl缓冲液透析，去除NaOH，得到纯化Pla蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述鼠疫菌体为鼠疫菌疫苗株EV76。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述鼠疫菌体为菌粉，该菌粉的制备方法包括将鼠疫菌接种于营养琼脂孵育48h 72h，用PBS(0. 01M, ρΗ7· 2 7. 4)7000 8000r/min离心20 30min，洗涤菌体两 三次，加入4倍体积_40°C -60°C预先低温的丙酮，充分混勻，置_40°C _60°C过夜后，4000r/min，10 20min离心，弃上清，再用预冷丙酮以相同方法洗涤菌体3次，弃尽丙酮，37°C温箱过夜制成菌粉。
4.根据权利要求1所述的方法，该方法包括称取鼠疫菌粉，每1. 5g菌粉，加入PBS (0. OlM ρΗ7· 2 7. 4) 60ml及溶菌酶3mg，4°C条件下，磁力搅拌(120 180转/分)3 4h后，菌悬液进行超声破碎，50%功率，每次10s， 间歇10s，共20min ； 10000 12000r/min离心20min,收集上清，加入PBS将溶液总量补足至 90ml IOOml ；上述离心后上清进行硫酸铵沉淀按照每IOOml液体总量加入固体硫酸铵5. 6g，提取饱和度在0 10%的沉淀，并用TBS (pH8. 5 9. 0)充分透析至无硫酸铵，得到粗提Pla蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，该方法包括将粗提Pla蛋白经10000 12000r/min、20min离心，取上清过0. 45 μ m滤膜，然后进行层析纯化。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其中，所述层析纯化时，上样缓冲液为5 IOmMNaH2PO4, 20mM Tris-Cl, 0. 25mM CaCl2, ρΗ8· 5 9· 0 ；所述洗脱缓冲液为500mM KH2PO4, ρΗ6· 8。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，上样流速0.5 1. Oml/min,洗脱流速2. O 3. Oml/min。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述层析纯化步骤包括以10倍床体积的上样缓冲液平衡层析柱一上样缓冲液对倍稀释预处理后样品上柱进行结合一以5倍床体积上样缓冲液平衡层析柱一以20倍床体积洗脱缓冲液进行梯度洗脱 —以5倍床体积上样缓冲液平衡层析柱一以5倍床体积的IN NaOH洗脱，收集NaOH洗脱峰样品并立即以Tris-Cl缓冲液(pH8. 5 9. 0)进行充分透析，得纯化Pla蛋白。
9.按照权利要求1 8任一项所述方法提取纯化得到的Pla蛋白制品。
10.权利要求9所述的Pla蛋白制品在杂交瘤株建立与筛选中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，该方法包括将鼠疫菌体经溶菌酶处理，然后经超声破碎，再进行硫酸铵盐析，得到粗提Pla蛋白；粗提Pla蛋白采用羟基磷灰石层析柱进行层析纯化，其中在上样缓冲液中加入Ca离子，洗脱时先采用磷酸盐缓冲液梯度洗脱，以去除非目的蛋白，再用1N NaOH洗脱目的蛋白，收集样品后用Tris-Cl缓冲液透析，去除NaOH，得到纯化Pla蛋白，并经质谱分析得以证实。本发明还提供了按照所述方法提取纯化得到的Pla蛋白制品。本发明的方法易于操作，所得蛋白丰度高、纯度高。
文档编号C12N5/20GK102286449SQ20111014170
公开日2011年12月21日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者宋志忠, 杜春红, 杨光璨, 王鹏, 石丽媛, 董珊珊, 钟佑宏 申请人:云南省地方病防治所