一种含重组细菌毒素蛋白复合物的抗肿瘤药物的制作方法

专利名称：一种含重组细菌毒素蛋白复合物的抗肿瘤药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗肿瘤的药物，特别是涉及一种治疗肿瘤的生物药物。
背景技术：
近年来科学研究发现，几乎所有的人类肿瘤细胞都过量表达尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)和尿激酶型纤溶酶原激活因子受体(uPAR)[Andreasen，P.A.等，Int.J.Cancer 1997；721-22]；而在正常组织中，uPA和uPAR的表达处于非常低的水平。uPA最初的分泌形式为活性很低的单链酶。uPA单链酶在纤溶酶的作用下转化为高活性的uPA双链酶，而高活性的uPA双链酶又激活纤溶酶原生成纤溶酶，继而促使更多的高活性的uPA双链酶产生。这构成了一个正反馈的循环通路，该纤溶酶原为循环通路的正向反馈调节剂，它和uPA前体，与细胞表面的受体结合后，通过不同的组装方式而调节整个反应通路。因此，uPA和uPAR的过量表达通常被作为肿瘤恶化的标志[Dano，K.等，Act Pathol.Microbiol.Immunol.Scand.1999；107120-127]。目前研究已证实，uPA和uPAR的过量表达可以作为下述肿瘤的恶化标志肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、头颈部肿瘤、皮肤癌、子宫癌、卵巢癌、脑部肿瘤、黑色素瘤、软组织肉瘤、单核细胞白血病等。
炭疽杆菌毒素蛋白为炭疽杆菌使人致死的主要致病因子，由保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)等蛋白组成[Dixon T.C.等，N.Engl.J.Med1999；341815-826]。但分离开来的这三种蛋白本身是无毒的。肿瘤内皮细胞标志蛋白8(TEM8)[Bradley，K.A.等，Nature 2001；414225-229]，是一种广泛存在细胞表面的受体，可以与PA相结合，TEM8在肿瘤细胞表面的表达尤其显著。PA与受体TEM8结合后，在Furin或Furin样的蛋白酶作用下，PA在“精氨酸赖氨酸赖氨酸精氨酸(RKKR)”序列处被剪切为20KD和63KD大小的两个多肽片段[Klimpel，K.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1992；8910277-10281]，剪切位点具有高度的特异性。其中PA的羧基端63KD大小的多肽片段(PA63)可以相互结合形成多聚体，并可结合三分子的LF和EF共同形成八聚体复合物，LF和EF可经由该八聚体复合物转运进入细胞胞浆，从而发挥细胞毒性作用。而完整的PA蛋白与受体结合后并没有这种功能，因此PA在RKKR位点的被剪切对毒素复合物的形成是至关重要的。在最近的研究中，科学家们就曾试图用某些特定的序列替换RKKR，以期在特定的位置激活毒素蛋白复合物来达到特定的目的[Liu，S.等，Cancer Res.2000；606061-6067]，如利用特定的MMPs剪切序列替换RKKR，以期达到治疗肿瘤的目的。
发明目的本发明目的在于提供一种重组细菌毒素蛋白；本发明目的还在于提供一种治疗肿瘤的药物及其制备方法。

发明内容
本发明利用特定的uPA剪切序列替换RKKR，产生突变的PA蛋白。突变的PA蛋白在uPA的作用下，在肿瘤细胞表面组装成八聚体复合物，携带水肿因子EF与细菌外毒素融合蛋白进入细胞内。在内质网的作用下[Bradley，K.A.等，Nature 001；414225-229；Cunningham，K.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002；997049-7053；Mogridge，J.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002；997045-7048]，EF与细菌外毒素融合蛋白进入胞浆后，发挥细胞毒性作用，从而杀死肿瘤细胞。
本发明通过基因克隆的方法融合水肿因子EF中保护性抗原PA结合片段和绿脓杆菌外毒素A(ETA)中二磷酸腺苷核糖基化片段，获得重组蛋白LP14；利用特定的尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)剪切序列应用重叠延伸拼接法替换保护性抗原(PA)中的RKKR氨基酸序列，获得突变的PA蛋白，即重组蛋白IP33。细菌毒素蛋白复合物(TPCB)，即重组蛋白LP14和IP33的1∶3摩尔数比混合物。重组蛋白IP33与肿瘤细胞表面富有的TEM8受体结合后，在肿瘤细胞表面高效表达的uPA作用下，被剪切为20KD和63KD的两个多肽片段，63KD大小的多肽片段能与LP14结合后被转运进肿瘤细胞，LP14在胞浆中发挥细胞毒性作用，从而杀死肿瘤细胞。
本发明是通过如下技术方案实现的一、炭疽杆菌保护性抗原PA编码基因的克隆本发明是从炭疽杆菌基因组中克隆得到保护性抗原编码基因。
本发明使用SDS(十二烷基硫酸钠)/CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法从大量培养的炭疽杆菌中提取基因组脱氧核糖核苷酸(DNA)，基因组DNA经酚/氯仿/异戊醇反复纯化后作为模板备用。根据已知炭疽杆菌保护性抗原基因序列(Genebank编号NC_001496)设计一对引物，上游引物由包含起始密码子的30个DNA组成(SEQ IDNO1)，下游引物由包含终止密码子的30个DNA组成(SEQ ID NO2)，经PCR克隆，80℃完全变性2分钟，95℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 2分钟，循环35次，最后68℃延伸5分钟，得到保护性抗原(PA)编码基因，并将PA编码基因片段经相应的KpnI、NotI限制性内切酶位点插入pcDNA3载体(购于Stratagen公司)中。
二、炭疽杆菌水肿因子EF编码基因的克隆本发明是从炭疽杆菌基因组中克隆得到水肿因子编码基因。
本发明使用上述技术方案中所得到的炭疽杆菌基因组DNA作为模板，根据已知炭疽杆菌水肿因子EF基因序列(Genebank编号NC001496)设计一对引物，上游引物由包含起始密码子的30个DNA组成(SEQ ID NO3)，下游引物由包含终止密码子的30个DNA组成(SEQ ID NO4)，经PCR克隆得到EF编码基因，并将EF编码基因片段经相应的KpnI、NotI限制性内切酶位点插入pCDNA3载体中。
三、绿脓杆菌外毒素A(ETA)编码基因的克隆本发明是从绿脓杆菌基因组中克隆得到外毒素A编码基因。
本发明使用SDS(十二烷基硫酸钠)/CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法从大量培养的绿脓杆菌中提取(详细过程见实施例3)基因组脱氧核糖核苷酸(DNA)，基因组DNA经酚/氯仿/异戊醇反复抽提，最后将上层液相用70％异丙醇沉淀后并溶于TE中作为模板备用。根据已知绿脓杆菌外毒素A基因序列(Genebank编号K01397)设计一对引物，上游引物由包含起始密码子的30个DNA碱基组成(SEQ ID NO5)，下游引物由包含终止密码子的30个DNA碱基组成(SEQ ID NO6)，经PCR克隆得到ETA编码基因，并将ETA编码基因片段经相应的HindIII、NotI限制性内切酶位点插入pcDNA3载体中。
四、重组融合蛋白LP14编码基因的构建本发明是应用基因工程的方法将水肿因子EF中保护性抗原结合功能域编码基因与绿脓杆菌外毒素A中二磷酸腺苷核糖基化功能域编码基因融合为重组蛋白LP14编码基因。
本发明使用PCR方法，80℃完全变性2分钟，95℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 1分钟，循环35次，最后68℃延伸5分钟分别得到水肿因子编码基因5’端1～735基因片段(L1)，和绿脓杆菌外毒素A编码基因3’端1092～1842基因片段(L2)，最后将(L1、L2)两个基因片段经HindIII限制性内切酶位点连接为重组编码基因，即LP14编码基因(SEQ ID NO14)。L1基因扩增以CDNA3/ef为模板，上游引物由包含起始密码子的30个DNA碱基组成(SEQ ID NO3)，下游引物由包含HindIII限制性内切酶碱基的30个DNA碱基组成(SEQ ID NO7)；L2基因扩增以pCDNA3/eta为模板，上游引物由包含HindIII限制性内切酶碱基的30个DNA碱基组成(SEQ ID NO8)，下游引物由包含终止密码子的30个DNA碱基组成(SEQ ID NO6)。
五、重组突变蛋白IP33编码基因的构建本发明是应用基因工程的方法将天然保护性抗原PA编码基因突变产生IP33重组蛋白编码基因。
本发明使用Overlap PCR方法将天然保护性抗原PA编码基因中“AGAAAAAAGC GA”’脱氧核糖核苷酸碱基突变为“CCAGGAAGTGGAAAATCAGCA”脱氧核糖核苷酸碱基，从而克隆(详细过程见实施例5)得到IP33编码基因(SEQ ID NO12)。在Overlap PCR的过程中，以pCDNA3/pa为模板，分别以氨基端和羧基端两对引物(SEQ ID NO1、9和SEQ ID NO10、2)首先扩增出两个有部分重叠的基因片段，然后再以这两个基因片段的混合物为模板，以包含起始密码子的引物为上游引物(SEQ ID NO1)，包含终止密码子的引物为下游引物(SEQ ID NO2)，经PCR得到IP33编码基因。
六、重组蛋白LP14和IP33的表达与纯化本发明是在体外大量制备有生物活性的重组蛋白LP14和IP33。
将LP14基因片段以KpnI、NotI限制性内切酶从pCNDA3重组质粒中切下，并亚克隆至(详细过程见实施例6)酵母表达载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)相应的多克隆位点，得到LP14的酵母表达载体。将IP33基因片段以KpnI、NotI限制性内切酶从pCNDA3重组质粒中切下，并亚克隆(详细过程见实施例6)至酵母表达载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)相应的多克隆位点，得到IP33的酵母表达载体。pPICZαA的分泌信号肽，能高效将重组蛋白以可溶形式转运至酵母培养液中，因此具有大量表达重组蛋白，并易于纯化的优点。重组表达质粒经SacI酶线性化后，转化至酵母GS115(购自Invitrogen公司)中，并在含有Zeocin(100ug/ml)上的平板上筛选生长。取一克隆在10ml条件培养基[1％酵母提取物(购于Gibco公司))、2％蛋白胨、2％葡萄糖、100ug/ml Zeocin]中28℃生长至OD595吸光度值为12，然后离心收集酵母，并重悬于10ml甲醇培养基中[1％酵母提取物、2％蛋白胨、100mM PH6.0磷酸钾缓冲液、0.5％甲醇、0.00001％生物素(购于Gibco公司)、1.3％酵母基本氮原]，并于28℃生长2天。酵母最后于1600g离心20分钟，取上清迅速贮存于-80℃，酵母沉淀重悬于新鲜培养基中备用。取20ul培养上清行15％SDS-PAGE电泳，分别得到LP14、IP33，见图10与图11。
七、LP14与IP33复合物(TPCB)的制备根据理论上IP33与LP14的结合特性，将上述制备好的重组LP14和IP33蛋白冻干粉未按照一定比例，最佳为1∶3摩尔比(相当于质量比为1∶3.8)均匀混合，2mg每支贮存于-80℃备用；临用前溶于PBS中，母液浓度为2mg/ml，并根据不同的试验目的稀释成不同的终浓度。
实验结果表明，本发明细菌毒素蛋白复合物(TPCB)能直接杀死肿瘤细胞，并在短期内达到根除肿瘤的目的。TPCB对肿瘤细胞的作用具有高度的特异性，对其它正常细胞无任何细胞毒性，对正常实验小鼠也无明显不良影响，是一种有效的治疗肿瘤药物。
重组细菌毒素蛋白复合物TCPB对肿瘤治疗的作用本研究通过重组细菌毒素蛋白复合物TCPB对纤维肉瘤生长的抑制实验，对黑色瘤B6F10生长的抑制实验，对肝细胞瘤生长的抑制实验，说明重组细菌毒素蛋白复合物TCPB能直接杀死肿瘤细胞，具有显著地抑制肿瘤生长的作用。而重组细菌毒素蛋白复合物对小鼠正常组织细胞及体外正常细胞的生长并无任何影响，说明重组细菌毒素蛋白复合物的细胞毒性作用具有高度的肿瘤组织特异性，对正常组织细胞是安全的。
下述实验例用于进一步说明本发明。
实验例1重组细菌毒素蛋白复合物TPCB对纤维肉瘤生长的抑制作用本实验的目的是研究TPCB对纤维肉瘤生长的抑制作用。
将纤维肉瘤细胞株-MM45T.Li细胞在37℃，5％CO2，60％湿度培养箱中培养，当细胞数量足够时，用胰酶消化成单个细胞，并计数，用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释成细胞悬浮液(1×106个/毫升)备用。选取雄性裸鼠25只(60克±5克)，每只于背部中线皮下注射制备的细胞悬液1ml。两周后，将肿瘤阳性小鼠随机分为两组，每组各10只，一组在腹腔注射1ml PBS，另一组在同一位置注射1ml重组细菌毒素蛋白混合物TPCB的PBS溶液(混合物中LP14与IP33比例为1∶3，总浓度为20ug/ml)，每周注射一次。每天同一时间用游标卡尺测量肿块的最长径与最短径，并按照公式肿瘤体积＝4/3Л(长径/2)(短径/2)(长径+短径)/4
计算肿瘤体积大小，当注射PBS组小鼠出现死亡时终止实验。结果发现，重组细菌毒素蛋白TPCB能强烈抑制纤维肉瘤在裸鼠中的生长(见表1及图1)。
实验例2重组细菌毒素蛋白复合物TPCB对肝细胞瘤生长的抑制作用本实验的目的是研究TPCB对肝细胞瘤生长的抑制作用。
将肝细胞瘤细胞株-Hepa 1-6细胞在37℃，5％CO2，60％湿度培养箱中培养，当细胞数量足够时，用胰酶消化成单个细胞，并计数，用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释成细胞悬浮液(1×106个/毫升)备用。选取雄性裸鼠25只(60克±5克)，每只于背部中线皮下注射制备的细胞悬液1ml。两周后，将肿瘤阳性小鼠随机分为两组，每组各10只，一组在腹腔注射1ml PBS，另一组在同一位置注射1ml重组细菌毒素蛋白混合物TPCB的PBS溶液(混合物中LP14与IP33比例为1∶3，总浓度为20ug/ml)，每周注射一次。每天同一时间用游标卡尺测量肿块的最长径与最短径，并按照公式肿瘤体积＝4/3Л(长径/2)(短径/2)(长径+短径)/4计算肿瘤体积大小，两星期后终止实验，观察肿瘤外形大小，结果见图12；并取肿瘤组织作切片分析，经TUNEL法染色，结果见图13。结果发现，重组细菌毒素蛋白TPCB能强烈抑制肝细胞瘤在裸鼠中的生长(见表1及图2)。
实施例3重组细菌毒素蛋白复合物TPCB对黑色素瘤生长的抑制作用本实验的目的是研究TPCB对黑色瘤生长的抑制作用。
将黑色素瘤细胞株-B6F12细胞在37℃，5％CO2，60％湿度培养箱中培养，当细胞数量足够时，用胰酶消化成单个细胞，并计数，用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释成细胞悬浮液(1×106个/毫升)备用。选取雄性裸鼠25只(60克±5克)，每只于背部中线皮下注射制备的细胞悬液1ml。两周后，将肿瘤阳性小鼠随机分为两组，每组各10只，一组在腹腔注射1ml PBS，另一组在同一位置注射1ml重组细菌毒素蛋白混合物TPCB的PBS溶液(混合物中LP14与IP33比例为1∶3，总浓度为20ug/ml)，每周注射一次。每天同一时间用游标卡尺测量肿块的最长径与最短径，并按照公式肿瘤体积＝4/3Л(长径/2)(短径/2)(长径+短径)/4计算肿瘤体积大小，当注射PBS组小鼠出现死亡时终止实验。结果发现，重组细菌毒素蛋白TPCB能强烈抑制黑色素瘤在裸鼠中的生长(见表1及图3)。
表1 各组小鼠的平均肿瘤体积(均数±标准差)

实验例4重组细菌毒素蛋白TPCB的急性毒性实验本实验的目的是研究重组细菌毒素蛋白TPCB的急性毒性。
将预先制备的重组细菌毒素蛋白TPCB溶解于PBS溶液中，终浓度为200ug/ml。健康Balb/C小鼠，随机分组，每组各10只，TPCB组腹腔注射大剂量TPCB(有效剂量的10倍，为2mg/Kg)，对照组腹腔注射PBS溶液，观察1周，统计各组出现症状小鼠数目。结果发现TPCB组小鼠并没有大量出现症状(结果见表2)，说明TPCB在有效剂量范围内是足够安全的。
表2 大剂量TPCB对小鼠生长的影响

实验例5重组细菌毒素蛋白TPCB对正常内皮细胞生长的影响本实验目的是研究重组细菌毒素蛋白TPCB对正常细胞生长的影响。
将预先制备的重组细菌毒素蛋白TPCB溶解于PBS溶液中，终浓度为200ug/ml。将牛脐静脉内皮细胞在37℃，5％CO2，60％湿度的培养箱中培养。待细胞有足够数量时，按1×106均匀接种于两个六孔板中培养过夜。第二天分别在两个不同的六孔板中加入不同浓度的重组细菌毒素TPCB溶液(浓度分别为0，25，50，100，200，400ug/ml)或PBS溶液。细胞继续在培养箱中培养3天，第四天经结晶紫染色，测定细胞存活率。结果发现药物处理组与对照组，细胞生存率一样，即TPCB对正常内皮细胞无明显细胞毒性作用。实验结果见图4。


图1TPCB对纤维肉瘤生长的影响图2TPCB对肝细胞瘤生长的影响图3TPCB对黑色素瘤生长的影响图4TPCB对体外培养的正常组织细胞生长的影响图5pcDNA3/pa在限制性内切酶KpnI、NotI消化后的琼脂糖凝胶电泳图片图6pcDNA3/ef在限制性内切酶KpnI、NotI消化后的琼脂糖凝胶电泳图片图7pcDNA3/eta在限制性内切酶HindIII、NotI消化后的琼脂糖凝胶电泳图片图8pBluescript/lp14在限制性内切酶KpnI、NotI消化后的琼脂糖凝胶电泳图片图9pcDNA3/ip33在限制性内切酶KpnI、NotI消化后的琼脂糖凝胶电泳图片图10IP33蛋白的SDS-PAGE照片图11LP14蛋白的SDS-PAGE照片图12TPCB对荷瘤小鼠肿瘤生长大小的影响图13肿瘤组织冰冻切片(TUNEL法染色)序列表当中的基因序列12是与蛋白质序列11相对应的基因序列；基因序列14是与蛋白质序列13相对应的基因序列。
氨基酸代码表如下A Ala丙氨酸；M Met蛋氨酸；C Cys半胱氨酸；N Asn天冬酰胺；D Asp天冬氨酸P Pro脯氨酸；E Glu谷氨酸；Q Gln谷氨酰胺；F Phe苯丙氨酸；R Arg精氨酸G Gly甘氨酸；S Ser丝氨酸；H His组氨酸；T Thr苏氨酸；I Ile异亮氨酸；V Val缬氨酸K Lys赖氨酸；W Trp色氨酸；L Leu亮氨酸；Y Tyr酪氨酸
具体实施例方式实施例1炭疽杆菌保护性抗原PA编码基因的克隆为从炭疽杆菌基因组中克隆得到保护性抗原编码基因，将炭疽杆菌在100ml SOC培养液(0.5％酵母菌提取物/2％胰化蛋白胨/10mM氯化钠/2.5mM氯化钾/10mM氯化镁/20mM硫酸镁/20mM葡萄糖)中培养至饱和状态，离心后将细菌沉淀重悬于9.5ml TE中，并加入0.5ml 10％的十二烷基硫酸钠(SDS)和50ul 20mg/ml的蛋白酶K(购于宝灵曼公司)，混合后于37℃温育1小时；加入1.8ml 5M氯化钠混合，在65℃温育1小时；然后加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1比例混合)抽提2次，并用0.6倍体积异丙醇沉淀，最后将沉淀溶于TE溶液中，得到炭疽杆菌基因组DNA备用。根据已知炭疽杆菌保护性抗原基因序列(Genebank编号NC001496)设计一对引物，上游引物由包含起始密码子的30个DNA组成(SEQ ID NO1)，下游引物由包含终止密码子的30个DNA组成(SEQ ID NO2)，经PCR克隆，80℃完全变性2分钟，95℃ 30秒，55℃30秒，68℃ 2分钟，循环35次，最后68℃延伸5分钟，得到保护性抗原编码基因cDNA。PA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳见图5。在克隆的PA编码基因的5’端和3’端分别引入KpnI、NotI酶切位点，经电泳后，回收相应片段，经KpnI、NotI酶切后回收相应片段，在T4DNA连接酶作用下20℃8小时亚克隆到pCDNA3载体(Stratagen公司)上相应的多克隆位点上，选取重组质粒进行测序分析，并由所得到的DNA序列推测基因所编码的氨基酸，结果与Genebank已公布的序列一致。
实施例2炭疽杆菌水肿因子EF编码基因的克隆为从炭疽杆菌基因组中克隆得到水肿因子编码基因，将炭疽杆菌在100ml SOC培养液(0.5％酵母菌提取物/2％胰化蛋白胨/10mM氯化钠/2.5mM氯化钾/10mM氯化镁/20mM硫酸镁/20mM葡萄糖)中培养至饱和状态，离心后将细菌沉淀重悬于9.5ml TE中，并加入0.5ml 10％的SDS和50ul 20mg/ml的蛋白酶K，混合后于37℃温育1小时；加入1.8ml5M氯化钠混合，在65℃温育1小时；然后加入等体积酚/氯仿/异戊醇抽提2次，并用0.6倍体积异丙醇沉淀，最后将沉淀溶于TE溶液中，得到炭疽杆菌基因组DNA备用。根据已知炭疽杆菌水肿因子基因序列(Genebank编号NC001496)设计一对引物，上游引物由包含起始密码子的30个DNA组成(SEQ ID NO3)，下游引物由包含终止密码子的30个DNA组成(SEQ ID NO4)，经PCR克隆，80℃完全变性2分钟，95℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 2分钟，循环35次，最后68℃延伸5分钟，得到保护性抗原编码基因cDNA。EF基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳见图6。在克隆的EF编码基因的5’端和3’端分别引入KpnI、NotI酶切位点，经电泳后，回收相应片段，经KpnI、NotI酶切后回收相应片段，在T4DNA连接酶作用下20℃8小时亚克隆到pCDNA3载体(Stratagen公司)上相应的多克隆位点上，选取重组质粒进行测序分析，并由所得到的DNA序列推测基因所编码的氨基酸，结果与Genebank已公布的序列一致。
实施例3绿脓杆菌外毒素A(ETA)编码基因的克隆为从绿脓杆菌基因组中克隆得到外毒素A编码基因，将绿脓杆菌在100ml SOC培养液(0.5％酵母菌提取物/2％胰化蛋白胨/10mM氯化钠/2.5mM氯化钾/10mM氯化镁/20mM硫酸镁/20mM葡萄糖)中培养至饱和状态，离心后将细菌沉淀重悬于9.5ml TE中，并加入0.5ml 10％的SDS和50ul 20mg/ml的蛋白酶K，混合后于37℃温育1小时；加入1.8ml5M氯化钠混合，在65℃温育1小时；然后加入等体积酚/氯仿/异戊醇抽提2次，并用0.6倍体积异丙醇沉淀，最后将沉淀溶于TE溶液中，得到绿脓杆菌基因组DNA备用。根据已知绿脓杆菌外毒素A基因序列(Genebank编号K01397)设计一对引物，上游引物由包含起始密码子的30个DNA组成(SEQ ID NO5)，下游引物由包含终止密码子的30个DNA组成(SEQ ID NO6)，经PCR克隆，80℃完全变性2分钟，95℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 2分钟，循环35次，最后68℃延伸5分钟，得到外毒素A编码基因cDNA。ETA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳见图7。在克隆的ETA编码基因的5’端和3’端分别引入HindIII、NotI酶切位点，经电泳后，回收相应片段，经HindIII、NotI酶切后回收相应片段，在T4DNA连接酶作用下20℃8小时亚克隆到pcDNA3载体(Stratagen公司)上相应的多克隆位点上，选取重组质粒进行测序分析，并由所得到的DNA序列推测基因所编码的氨基酸，结果与Genebank已公布的序列一致。
实施例4重组融合蛋白LP14编码基因的构建为构建重组蛋白LP14编码基因质粒，应用基因工程的方法将水肿因子EF中保护性抗原结合功能域编码基因与绿脓杆菌外毒素A中二磷酸腺苷核糖基化功能域编码基因连接而成。首先PCR克隆得到水肿因子编码基因5’端1～735基因片段L1，和绿脓杆菌外毒素A编码基因3’端1092～1842基因片段L2。L1基因扩增以pCDNA3/ef为模板，并在3’端引入HindIII限制性内切酶位点，80℃完全变性2分钟，95℃ 30秒，55℃30秒，68℃ 1分钟，循环35次，最后68℃延伸5分钟。上游引物由包含起始密码子的30个DNA碱基组成(SEQ ID NO3)，下游引物由包含HindIII限制性内切酶碱基的30个DNA碱基组成(SEQ ID NO7)。L2基因扩增以pCDNA3/eta为模板，并在5’端引入HindIII限制性内切酶位点，80℃完全变性1分钟，95℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 2分钟，循环35次，最后68℃延伸5分钟。上游引物由包含HindIII限制性内切酶碱基的30个DNA碱基组成(SEQ ID NO8)，下游引物由包含终止密码子的30个DNA碱基组成(SEQ ID NO6)。最后将L1、L2两个基因片段经HindIII限制性内切酶位点在T4DNA酶的作用得到重组编码基因，即LP14编码基因(SEQ ID NO13)，并将LP14编码基因片段再经T4DNA酶20℃连接8小时亚克隆至pBluescript载体中。见图8。
实施例5重组突变蛋白IP33编码基因的构建为构建IP33重组蛋白编码基因质粒，使用Overlap PCR方法将天然保护性抗原PA编码基因中“AGAAAAAAGCGA”脱氧核糖核苷酸碱基突变为“CCAGGAAGTGGAA AATCAGCA”而获得，与之对应的氨基酸由“RKKR”突变为“PGSGKSA”。在Overlap PCR中，以pCDNA3/pa为模板，分别以氨基端和羧基端两对引物(SEQ ID NO1、9和SEQ ID NO10、2)首先扩增出两个有部分重叠序列的基因片段M1和M2，PCR反应条件为，80℃完全变性2分钟，95℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 2.5分钟，循环35次，最后68℃延伸5分钟。PCR产物稀释于150ul PB溶液后(试剂盒购于Qiagen公司)，转移至微量离心柱中，经70％乙醇清洗后，溶于TE中。将M1、M2这两个基因片段混合后作为模板，80℃完全变性2分钟，95℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 3分钟，循环35次，最后68℃延伸5分钟，以包含起始密码子的引物为上游引物(SEQ ID NO1)，包含终止密码子的引物为下游引物(SEQ ID NO2)，经PCR得到IP33编码基因(SEQ ID NO11)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段溶于QG缓冲液中(纯化试剂购于Qiagen公司)，并转移至微量离心柱中，经70％乙醇清洗后，溶于TE得到目的基因片段；目的基因片段再经KpnI和NotI限制性内切酶37℃消化2小时后，经T4DNA酶20℃连接8小时，亚克隆至pcDNA3载体中。见图9。
实施例6重组蛋白LP14和IP33的表达与纯化pcDNA3/lp14在KpnI、NotI限制性内切酶的作用下37℃消化2小时，经琼酯糖凝胶电泳分离后，切下目的片段溶于QG缓冲液中(纯化试剂购于Qiagen公司)，并转移至微量离心柱中，经70％乙醇清洗后，溶于TE得到lp14目的基因片段；目的基因片段再经T4DNA连接酶20℃作用8小时亚克隆至酵母表达载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)相应的KpnI、NotI限制性内切酶位点，得到LP14的酵母表达载体。相同的方法将IP33基因片段以KpnI、NotI限制性内切酶从pcDNA3重组质粒中切下，并亚克隆至酵母表达载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)相应的KpnI、NotI限制性内切酶位点，得到IP33的酵母表达载体。重组表达质粒分别经SacI限制性内切酶37℃消化2小时，使其线性化后，转化至酵母GS115(购自Invitrogen公司)中，并在含有Zeocin(100ug/ml)上的平板上筛选生长。分别取一克隆在10ml条件培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、100ug/ml Zeocin)中28℃生长至OD595为12，然后离心收集酵母，并重悬于10ml甲醇培养基中(1％酵母提取物、2％蛋白胨、100mM PH6.0磷酸钾缓冲液、0.5％甲醇、0.00001％生物素、1.3％酵母基本氮原)，并于28℃生长2天。酵母最后于1600g离心20分钟，取上清迅速贮存于-80℃，酵母沉淀重悬于新鲜培养基中备用。取20ul培养上清行15％SDS-PAGE电泳，见图10和图11。
实施例7LP14与IP33复合物(TPCB)的制备根据理论上IP33与LP14的结合特性，将上述实施例6制备好的重组LP14和IP33蛋白冻干粉未按照1∶3摩尔比(相当于质量比为1∶3.8)均匀混合，2mg每支贮存于-80℃备用；临用前溶于PBS中，母液浓度为2mg/ml，并根据不同的试验目的稀释成不同的终浓度。
序列表SEQ ID NO1脱氧核糖核苷酸数30分子类型 DNA来源 重组SEQ ID NO1的序列描述ttt ggt acc atg aaa aaa cga aaa gtg ttaSEQ ID NO2脱氧核糖核苷酸数 30分子类型 DNA来源 重组SEQ ID NO2的序列描述ttt gcg gcc gct tat cct atc tca tag cctSEQ ID NO3脱氧核糖核苷酸数 30分子类型 DNA来源 重组SEQ ID NO3的序列描述ttt ggt acc atg aat gaa cat tac act gagSEQ ID NO4脱氧核糖核苷酸数 30分子类型 DNA来源 重组SEQ ID NO4的序列描述ttt gcg gcc gct tat ttt tca tca ata attSEQ ID NO5脱氧核糖核苷酸数 30分子类型 DNA
来源 重组SEQ ID NO5的序列描述ttt aag ctt atg cac ctg ata ccc cat tggSEQ ID NO6脱氧核糖核苷酸数 30分子类型 DNA来源 重组SEQ ID NO6的序列描述ttt gcg gcc gct tac ttc agg tcc tcg cgcSEQ ID NO7脱氧核糖核苷酸数 30分子类型 DNA来源 重组SEQ ID NO7的序列描述ttt aag ctt ttt ctc aaa tcc ccc ttt ttcSEQ ID NO8脱氧核糖核苷酸数 30分子类型 DNA来源 重组SEQ ID NO8的序列描述ttt aag ctt gcg gcc aac gcc gac gtg gtgSEQ ID NO9脱氧核糖核苷酸数 43分子类型 DNA来源 重组SEQ ID NO9的序列描述tgc tga tct tcc act tcc tgg tga gtt cga aga ttt ttg ttt t
SEQ ID NO10脱氧核糖核苷酸数 45分子类型 DNA来源 重组SEQ ID NO10的序列描述cca gga agt gga aga tca gca agt aca agt gct gga cct acg gttSEQ ID NO11氨基酸数 739分子类型 氨基酸来源 重组SEQ ID NO11的序列描述MEVKQENRLLNESESSSQGLLGYYFSDLNFQAPMVVTSSTTGDLSIPSSELENIPSENQYFQSAIWSGFIKVKKSDEYTFATSADNHVTMWVDDQEVINKASNSNKIRLEKGRLYQIKIQYQRENPTEKGLDFKLYWTDSQNKKEVISSDNLQLPELKQKSSNSPGSGRSASTSAGPTVPDRDNDGIPDSLEVEGYTVDVKNKRTFLSPWISNIHEKKGLTKYKSSPEKWSTASDPYSDFEKVTGRIDKNVSPEARHPLVAAYPIVHVDMENIILSKNEDQSTQNTDSQTRTISKNTSTSRTHTSEVHGNAEVHASFFDIGGSVSAGFSNSNSSTVAIDHSLSLAGERTWAETMGLNTADTARLNANIRYVNTGTAPIYNVLPTTSLVLGKNQTLATIKAKENQLSQILAPNNYYPSKNLAPIALNAQDDFSSTPITMNYNQFLELEKTKQLRLDTDQVYGNIATYNFENGRVRVDTGSNWSEVLPQIQETTARIIFNGKDLNLVERRIAAVNPSDPLETTKPDMTLKEALKIAFGFNEPNGNLQYQGKDITEFDFNFDQQTSQNIKNQLAELNATNIYTVLDKIKLNAKMNILIRDKRFHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIGSEQ ID NO12核苷酸数 2220分子类型 DNA来源 重组SEQ ID NO12的序列描述1 atg gaa gtt aaa cag gag aac cgg tta tta aat gaa tca gaa tca agt tcccag ggg ttaM E V K Q E N R L L N E S E S S S Q G L
61 cta gga tac tat ttt agt gat ttg aat ttt caa gca ccc atg gtg gtt acctct tct actL G Y Y F S D L N F Q A P M V V T S S T121 aca ggg gat tta tct att cct agt tct gag tta gaa aat att cca tcg gaaaac caa tatT G D L S I P S S E L E N I P S E N Q Y181 ttt caa tct gct att tgg tca gga ttt atc aaa gtt aag aag agt gat gaatat aca tttF Q S A I W S G F I K V K K S D E Y T F241 gct act tcc gct gat aat cat gta aca atg tgg gta gat gac caa gaa gtgatt aat aaaA T S A D N H V T M W V D D Q E V I N K301 gct tct aat tct aac aaa atc aga tta gaa aaa gga aga tta tat caa ataaaa att caaA S N S N K I R L E K G R L Y Q I K I Q361 tat caa cga gaa aat cct act gaa aaa gga ttg gat ttc aag ttg tac tggacc gat tctY Q R E N P T E K G L D F K L Y W T D S421 caa aat aaa aaa gaa gtg att tct agt gat aac tta caa ttg cca gaa ttaaaa caa aaaQ N K K E V I S S D N L Q L P E L K Q K481 tct tcg aac tca cca gga agt gga aga tca gca agt aca agt gct gga cctacg gtt ccaS S N S P G S G R S A S T S A G P T V P541 gac cgt gac aat gat gga atc cct gat tca tta gag gta gaa gga tat acggtt gat gtcD R D N D G I P D S L E V E G Y T V D V601 aaa aat aaa aga act ttt ctt tca cca tgg att tct aat att cat gaa aagaaa gga ttaK N K R T F L S P W I S N I H E K K G L661 acc aaa tat aaa tca tct cct gaa aaa tgg agc acg gct tct gat ccg tacagt gat ttc
T K Y K S S P E K W S T A S D P Y S D F721 gaa aag gtt aca gga cgg att gat aag aat gta tca cca gag gca aga cacccc ctt gtgE K V T G R I D K N V S P E A R H P L V781 gca gct tat ccg att gta cat gta gat atg gag aat att att ctc tca aaaaat gag gatA A Y P I V H V D M E N I I L S K N E D841 caa tcc aca cag aat act gat agt caa acg aga aca ata agt aaa aat acttct aca agtQ S T Q N T D S Q T R T I S K N T S T S901 agg aca cat act agt gaa gta cat gga aat gca gaa gtg cat gcg tcg ttcttt gat attR T H T S E V H G N A E V H A S F F D I961 ggt ggg agt gta tct gca gga ttt agt aat tcg aat tca agt acg gtc gcaatt gat catG G S V S A G F S N S N S S T V A I D H1021 tca cta tct cta gca ggg gaa aga act tgg gct gaa aca atg ggt tta aatacc gct gatS L S L A G E R T W A E T M G L N T A D1081 aca gca aga tta aat gcc aat att aga tat gta aat act ggg acg gct ccaatc tac aacT A R L N A N I R Y V N T G T A P I Y N1141 gtg tta cca acg act tcg tta gtg tta gga aaa aat caa aca ctc gcg acaatt aaa gctV L P T T S L V L G K N Q T L A T I K A1201 aag gaa aac caa tta agt caa ata ctt gca cct aat aat tat tat cct tctaaa aac ttgK E N Q L S Q I L A P N N Y Y P S K N L1261 gcg cca atc gca tta aat gca caa gac gat ttc agt tct act cca att acaatgaat tacA P I A L N A Q D D F S S T P I T M N Y
1321 aat caa ttt ctt gag tta gaa aaa acg aaa caa tta aga tta gat acg gatcaa gta tatN Q F L E L E K T K Q L R L D T D Q V Y1381 ggg aat ata gca aca tac aat ttt gaa aat gga aga gtg agg gtg gat acaggc tcg aacG N I A T Y N F E N G R V R V D T G S N1441 tgg agt gaa gtg tta ccg caa att caa gaa aca act gca cgt atc att tttaat gga aaaW S E V L P Q I Q E T T A R I I F N G K1501 gat tta aat ctg gta gaa agg cgg ata gcg gcg gtt aat cct agt gat ccatta gaa acgD L N L V E R R I A A V N P S D P L E T1561 act aaa ccg gat atg aca tta aaa gaa gcc ctt aaa ata gca ttt gga tttaac gaa ccgT K P D M T L K E A L K I A F G F N E P1621 aat gga aac tta caa tat caa ggg aaa gac ata acc gaa ttt gat ttt aatttc gat caaN G N L Q Y Q G K D I T E F D F N F D Q1681 caa aca tct caa aat atc aag aat cag tta gcg gaa tta aac gca act aacata tat actQ T S Q N I K N Q L A E L N A T N I Y T1741 gta tta gat aaa atc aaa tta aat gca aaa atg aat att tta ata aga gataaa cgt tttV L D K I K L N A K M N I L I R D K R F1801 cat tat gat aga aat aac ata gca gtt ggg gcg gat gag tca gta gtt aaggag gct catH Y D R N N I A V G A D E S V V K E A H1861 aga gaa gta att aat tcg tca aca gag gga tta ttg tta aat att gat aaggat ata agaR E V I N S S T E G L L L N I D K D I R1921 aaa ata tta tca ggt tat att gta gaa att gaa gat act gaa ggg ctt aaagaa gtt ata
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SEQ ID NO14的序列描述1 atgaatgaac attacactga gagtgatatt aaaagaaacc ataaaactga aaaaaataaa61 actgaaaaag aaaaatttaa agacagtatt aataacttag ttaaaacaga atttaccaat121 gaaactttag ataaaataca gcagacacaa gacttattaa aaaagatacc taaggatgta181 cttgaaattt atagtgaatt aggaggagaa atctatttta cagatataga tttagtagaa241 cataaggagt tacaagattt aagtgaagaa gagaaaaata gtatgaatag tagaggtgaa301 aaagttccgt ttgcatcccg ttttgtattt gaaaagaaaa gggaaacacc taaattaatt361 ataaatatca aagattatgc aattaatagt gaacaaagta aagaagtata ttatgaaatt421 ggaaagggga tttctcttga tattataagt aaggataaat ctctagatcc agagttttta481 aatttaatta agagtttaag cgatgatagt gatagtagcg accttttatt tagtcaaaaa541 tttaaagaga agctagaatt gaataataaa agtatagata taaattttat aaaagaaaat601 ttaactgaat ttcagcatgc gttttcttta gcgttttctt attattttgc acctgaccat661 agaacggtat tagagttata tgcccccgac atgtttgagt atatgaataa gttagaaaaa721 gggggatttg agaaaaagct tgcggccaac gccgacgtgg tgagcctgac ctgcccggtc781 gccgccggtg aatgcgcggg cccggcggac agcggcgacg ccctgctgga gcgcaactat841 cccactggcg cggagttcct cggcgacggc ggcgacgtca gcttcagcac ccgcggcacg901 cagaactgga cggtggagcg gctgctccag gcgcaccgcc aactggagga gcgcggctat961 gtgttcgtcg gctaccacgg caccttcctc gaagcggcgc aaagcatcgt cttcggcggg1021 gtgcgcgcgc gcagccagga cctcgacgcg atctggcgcg gtttctatat cgccggcgat1081 ccggcgctgg cctacggcta cgcccaggac caggaacccg acgcacgcgg ccggatccgc1141 aacggtgccc tgctgcgggt ctatgtgccg cgctcgagcc tgccgggctt ctaccgcacc1201 agcctgaccc tggccgcgcc ggaggcggcg ggcgaggtcg aacggctgat cggccatccg1261 ctgccgctgc gcctggacgc catcaccggc cccgaggagg aaggcgggcg cctggagacc1321 attctcggct ggccgctggc cgagcgcacc gtggtgattc cctcggcgat ccccaccgac1381 ccgcgcaacg tcggcggcga cctcgacccg tccagcatcc ccgacaagga acaggcgatc1441 agcgccctgc cggactacgc cagccagccc ggcaaaccgc cgcgcgagga cctgaagtaa
权利要求
1.一种重组生物基因蛋白，包含具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的活性成分。
2.如权利要求1的生物基因蛋白，其中的氨基酸序列SEQ ID NO11由SEQ ID NO12所代表的cDNA序列推断出来。
3.一种重组生物基因蛋白，包含具有SEQ ID NO13所示氨基酸序列的活性成分。
4.如权利要求3的生物基因蛋白，其中的氨基酸序列SEQ ID NO13由SEQ ID NO14所代表的cDNA序列推断出来。
5.如权利要求3的生物基因蛋白，由炭疽杆菌水肿因子中保护性抗原结合功能域和细菌外毒素功能域融合而成；其中，水肿因子保护性抗原结合功能域由水肿因子氨基端至少245个氨基酸，至多不多于完整水肿因子蛋白的氨基酸序列构成。
6.一种重组细菌毒素蛋白复合物，该复合物的核心成分包括具有SEQID NO11所示氨基酸序列的活性成分的重组生物基因蛋白和具有SEQ IDNO13所示氨基酸序列的活性成分的重组生物基因蛋白。
7.如权利要求6所述的重组细菌毒素蛋白复合物，其特征在于具有SEQID NO11所示氨基酸序列的活性成分的重组生物基因蛋白和具有SEQ IDNO13所示氨基酸序列的活性成分的重组生物基因蛋白冻干粉未按照1∶3摩尔比均匀混合。
8.一种药物组合物，其特征在于含有权利要求1或3的蛋白或者权利要求6的蛋白复合物作为活性成分。
9.如权利要求6或7所述的重组细菌毒素蛋白复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.如权利要求1或3所述的蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
重组细菌毒素蛋白复合物TPCB的核心成分包括重组蛋白IP33和LP14。TPCB能在由肿瘤细胞或肿瘤组织所分泌和形成的特定的酶的作用下，将本身无毒的蛋白质转变成毒素复合物，毒素复合物进入肿瘤细胞胞浆后，在内质网激活并杀死肿瘤细胞。TPCB能直接杀死肿瘤细胞，并在短期内达到根除肿瘤的目的。TPCB对肿瘤细胞的作用具有高度的特异性，对其它正常细胞无任何细胞毒性，对正常实验小鼠也无明显不良影响，是一种有特效的抗肿瘤药物。
文档编号C12N15/62GK1513878SQ0314314
公开日2004年7月21日 申请日期2003年6月13日 优先权日2003年6月13日
发明者糜军, 糜 军 申请人:糜军, 糜 军