专利名称：一种获取戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶基因的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中一种获取酶基因的方法，特别涉及生物工程领域中一种获取戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因的方法。
背景技术：
自青霉素问世以来的70年期间，抗生素为人类的健康事业做出了巨大的贡献，然而伴随着青霉素和其它一些抗生素的过度使用，导致细菌对抗生素的抗药性越来越严重。半合成抗生素是指在原有抗生素的基础之上，加上各种人工合成的侧链，赋予其新的性能，以减少细菌的抗药性。由于半合成抗生素具有较少副反应、较小毒性、较大抗病原专一性、较宽抗菌谱和较好的药理学性能，已成为解决病菌抗药性的一种有效手段，正主导着目前的世界抗生素市场。在半合成抗生素中，半合成头孢菌素的比例占70％。半合成头孢菌素的生产过程基本上分为三步第一步，通过顶头孢霉发酵生产头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)；第二步，裂解头孢菌素C，脱去其侧链，得到母核-7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)；第三步，再将7-ACA和新合成的D-氨基酸类的各种具有新的抗菌活性和抗菌谱的侧链，生成半合成头孢菌素。
半合成头孢菌素的重要中间体-7-ACA的生产日益受到重视，其中，头孢菌素C脱去其侧链生产7-ACA的方法有化学法和酶法。
化学法生产7-ACA需要经过多个步骤的反应，且反应条件苛刻(-60～-40℃)，需要用纯化的头孢菌素C的固体粉末作为反应原料，致使生产成本居高不下，反应过程中还要用到多种有毒试剂，因此，产品的质量控制和环境污染的问题比较突出。
近些年来，对酶法生产半合成抗生素的研究和开发投入了大量资金和力量。并且已充分证明，酶法和传统的化学法相比具有工艺简单、高效、低成本、安全、无污染及质量稳定等优点，在经济和保护环境上具有很大的竞争力。对于用酶法裂解生产7-ACA，多采用两步酶法。首先，头孢菌素C在D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，DAAO)的作用下，产生一个含酮基的中间体，这个中间体较不稳定，很容易被同时产生的H2O2化学氧化脱羧，转变成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanic Acid，GL-7-ACA)；然后GL-7-ACA在GL-7-ACA酰化酶(GL-7-ACA Acylase)的作用下脱去其侧链，生成7-ACA(见图1)。因此，生产7-ACA的关键是要得到高酶活的D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶。
D-氨基酸氧化酶是一种典型的黄素蛋白，其辅酶为黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，广泛存在于动物内脏及微生物中。DAAO的底物专一性较低，可以作用于几乎所有的D-氨基酸，也可以作用于各种具有D-氨基的化合物(如头孢菌素C)。DAAO的主要来源有三角酵母、猪肾、腐皮镰孢霉、红酵母和曲霉等。除了直接利用各种微生物得到DAAO之外，还可将不同来源的DAAO基因在大肠杆菌中进行克隆和表达来获取DAAO。
已经发现了两类头孢菌素酰化酶(Cephalosporin Acylase)，分别为戊二酰-7氨基头孢烷酸酰化酶(Glutaryl-7-aminocephalosporanic Acid Acylase，GL-7-ACA酰化酶)和头孢菌素C酰化酶(Cephalosporin C Acylase，CPC酰化酶)，它们分别催化GL-7-ACA和CPC的水解反应。由于CPC酰化酶一步催化CPC生成7-ACA的活性很低，基本上没有实际应用价值。但CPC酰化酶除了能直接催化CPC，也能催化GL-7-ACA生产7-ACA，所以CPC酰化酶也能应用于两步酶法中生产7-ACA。根据前人的工作，大部分产生GL-7-ACA酰化酶的菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。可以把具有催化GL-7-ACA活性，生成7-ACA的酶分为5类，同一类酶的基因都有95％以上的同源性，且酶学性质几乎完全相同。
一般按如下思路对GL-7-ACA酰化酶进行研究筛选具有GL-7-ACA酰化酶活性的野生菌株；构建基因文库，筛选得到含完整GL-7-ACA酰化酶基因的重组子；对重组子进行DNA测序及确定GL-7-ACA酰化酶基因阅读框序列；将GL-7-ACA酰化酶基因克隆至大肠杆菌中进行表达；优化GL-7-ACA酰化酶的表达条件及用于催化。但是按照这条思路开展工作往往难度很大，而且耗时太长，通常需要几年的时间才能取得一定的进展。
筛选具有GL-7-ACA酰化酶的菌株通常需要经过大量的微生物培养及酶活检测的工作。因为在野生菌株中，GL-7-ACA酰化酶的活性较低，有些菌株需要在培养基中添加戊二酸和谷氨酸盐等物质来诱导酶活(Agric.Biol.Chem.1981，45(1)2225-2229)。许多野生菌株中还存在一些其它的酶(如β-内酰胺酶和脂酶)，使GL-7-ACA酰化酶活性的测定容易受到干扰，而导致菌株的漏筛。例如，Bingder等人，从5000株菌中才筛选出一株具有GL-7-ACA酰化酶活性的菌株Pseudomonas BL072(Appl.Environ.Microbiol.1993，59，3321-3326)。Aramori等人从十几万株菌中才筛选出4株具有GL-7-ACA酰化酶活性的菌株(J.Ferment.Bioeng.1991，72(4)227-231)。Khang等人从2000株菌中筛选出一株具有GL-7-ACA酰化酶活性的假单胞菌(Biotechnol.Lett.2000，22317-320)。Sonawane等人从4000株菌中筛出一株具有GL-7-ACA酰化酶活性的菌株(Biotechnol.Lett.1996，18965-968)。
由于野生菌株培养困难、其GL-7-ACA酰化酶酶活较低、还存在β-内酰胺酶和酯酶的干扰，因此需要将GL-7-ACA酰化酶进行基因克隆和表达，使其更适于工业应用。所以，在得到具有酶活性的野生菌株后，要通过构建基因文库及大量筛选重组菌的方法，来得到GL-7-ACA酰化酶基因(Biotechnol.Lett.2001，231067-1071)。
以前，所有具有GL-7-ACA酰化酶的菌株均是从土壤中筛选得到的，因此在土壤中应该存在这些微生物的遗传信息(DNA和RNA)。近些年来，已经使用分子生物学的技术来进行土壤生态学的研究。首先提取土壤中的DNA和RNA作为模板，设计与特定DNA序列互补的引物，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)来扩增目的DNA片段，以此来研究土壤中的微生物分布情况。因此，利用这种思路就有希望快速从土壤中得到所需的GL-7-ACA酰化酶基因。
但研究结果表明，直接从土壤中提取DNA和RNA作为PCR的模板存在许多问题。例如，土壤中的一些有机物如腐殖酸、腐殖质等在提取DNA和RNA的过程中很难去除，而且这些物质将会严重抑制PCR反应(Applied and EnvironmentalMicrobiology.1993，59，2657-2665)；此外，具有GL-7-ACA酰化酶活性的菌株在土壤总微生物群落中占的比例极低，如果用直接提取出来的DNA和RNA作为模板，可能会由于对应模板的比例太低而无法扩增得到所需的产物。因此，这种方法的成功率极低。
发明创造内容本发明的目的是提供一种快速获取戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因的方法。
本发明所提供的快速获取戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GL-7-ACA酰化酶)基因的方法，是从土壤微生物中获取戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的DNA或RNA，在提取土壤微生物的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的DNA或RNA之前，进行微生物选择性培养，然后提取选择性培养微生物的染色体DNA或RNA；设计引物，进行核酸扩增得到GL-7-ACA酰化酶基因。
可从灌木根部土壤、草地土壤或污泥中获取土壤样品。当从灌木根部土壤取样时，最好为土壤表层以下10cm的土壤。
所述选择性培养微生物可以为假单胞菌；其培养基为PSM培养基。
GL-7-ACA酰化酶基因可以序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2为引物通过PCR扩增得到。在PCR反应中，PCR反应的温度变化过程为先升温至92-96℃，保持1-15分钟，接着按以下的温度变化程序循环20-40次升温至92-96℃，保持1-2分钟，降温至50-70℃，保持1-5分钟，升温至70-76℃，保持1-5分钟，最后于70-76℃保持10-20分钟，结束扩增反应。
序列表中SEQ ID №1由29个核苷酸残基组成，SEQ ID №2由27个核苷酸残基组成。
本发明的方法还包括对核酸扩增得到的GL-7-ACA酰化酶基因进行检测的步骤；在检测过程中，核酸扩增得到的GL-7-ACA酰化酶基因DNA片段和质粒pGEM-T进行连接反应的温度是2-16℃，反应时间是8-20小时。
本发明提出了一种快速获取GL-7-ACA酰化酶基因的方法，即利用微生物学和分子生物学相结合的方法，从自然界中快速获取目的基因。本发明的方法，在提取土壤微生物的DNA或RNA之前，增加了微生物选择性培养的操作，使得土壤中需要选取的微生物得到富集，同时去除了土壤中绝大多数对PCR扩增有抑制作用的有机物，使提取目的基因DNA或RNA的质和量有大幅度提高，从而使需要选取的微生物染色体DNA的提取过程大大简化，且不需特别的纯化步骤；操作简单，能快速(整个获取过程可以在几天内完成)从自然界(主要是土壤)中得到所需的GL-7-ACA酰化酶基因；大大减少了筛选菌株所用的极大工作量，加快了GL-7-ACA酰化酶应用于实际工业生产的步伐。
图1为两步酶法生产7-ACA的示意图具体实施方式
实施例1、获取戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因(1)采集样品选取灌木根部土壤表层以下10cm左右的土样约10克，用纸袋装好，4℃冰箱保存备用。
(2)进行假单胞菌(Pseudomonas sp.)的选择性培养并提取混合菌体的染色体DNA称取土壤样品0.5g，用50mL无菌水重悬，取1mL重悬菌液接种于50mL液体培养基的三角瓶中。该培养基记为LB培养基，每升培养基的组成为酵母粉5g；蛋白胨10g；氯化钠10g，pH7.0。在温度为37℃的摇床中培养20小时。再转接1mL培养液于50mL液体培养基的三角瓶中。该培养基记为PSM培养基，每升培养基的组成为甘油10g，蛋白胨1g，十二烷基磺酸钠0.5g，蔗糖10g，NH4Cl 5g，Na2HPO42.3g，pH6.8。在30℃的摇床中培养50小时，10000rpm×5min离心收集菌体，10ml无菌水重悬，10000rpm×5min离心收集菌体，此时所得菌体主要为假单胞菌(Pseudomonassp.)。按照常规革兰氏阴性细菌DNA提取方法对所得细胞进行处理，用Promega公司的Wizard Genomic DNA Purification Kit提取和纯化染色体DNA，备用。
(3)运用PCR技术从染色体DNA上扩增目的GL-7-ACA酰化酶基因片段设计并合成GL-7-ACA酰化酶基因的上游与下游引物。所涉及到的四种核苷酸分别为三磷酸脱氧腺嘌呤核苷酸(记为A)、三磷酸脱氧鸟嘌呤三磷酸(记为G)、三磷酸脱氧胞嘧啶核苷酸(记为C)、三磷酸脱氧胸腺嘧啶核苷酸(记为T)，所合成的引物一，由29个核苷酸残基组成，依次为5’-磷酸-C-T-G-G-G-T-G-A-G-A-G-G-G-G-A-A-A-T-C-C-A-T-G-C-T-G-A-G-A-磷酸-3’；所合成的引物二，由27个核苷酸残基组成，依次为5’-磷酸-T-C-C-G-T-C-G-T-G-T-C-A-T-G-G-T-C-A-G-G-C-C-T-T-T-C-磷酸-3’。引物由北京赛百盛生物工程公司合成。引物合成后，用无菌水溶解至浓度为50μmol/L，备用。运用PCR技术从染色体DNA上扩增目的GL-7-ACA酰化酶基因DNA片段，所用聚合酶及相应扩增缓冲液、四种脱氧核苷酸溶液均由宝生物工程(大连)有限公司购得。在一已灭菌的0.2mL PCR薄壁管中，依次加入5μL无菌水、10μL的扩增缓冲液、1μL的四种脱氧核苷酸、1μL的步骤(3)合成的引物一、1μL的步骤(3)合成的引物二、2μL的步骤(2)制备的染色体DNA溶液、0.2μL的LA Taq DNA聚合酶，用无菌水补足至总体积为20μL；将离心管置于变温系统中，升温至94℃，保持5分钟，接着按升温至94℃并保持1分钟、降温至65℃并保持2分钟、升温至72℃并保持3分钟的变化顺序循环30次，最后于72℃保持10分钟，结束扩增反应。
(4)将上一步扩增得到的GL-7-ACA酰化酶基因DNA片段和质粒pGEM-T进行连接所用质粒pGEM-T及相应缓冲液和T4 DNA连接酶由Promega公司购得。连接样品组成为GL-7-ACA酰化酶基因DNA片段 7μlliagtion buffer 10μlpGEM-T(50ng/μl) 1μlT4ligase(3U/μl) 2μl总体积20μl连接样品在4℃下反应16小时。备用。
(5)采用分子克隆操作制备大肠杆菌的感受态细胞(氯化钙法)采用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞，所用大肠杆菌TOP-10F’由Invitrogen公司购得。从菌体的固体平板上挑取单菌落，接种于装有5mL液体培养基中。该培养基为LB培养基。在37℃下于200转/分的摇床上培养细菌10小时，接着取0.5mL培养液接种于50mL LB液体培养基中，在37℃下于200转/分的摇床上培养至培养液在600nm处的吸光值为0.4；将培养液转入预冷的已灭菌离心管中，冰浴冷却10分钟后，于4℃的离心机上以4000转/分离心10分钟；倒出上清液，在无菌条件下将管倒置1分钟，以使残留的上清液流尽；向沉淀中加10毫升用冰预冷的0.1mmol/L CaCl2溶液，冰浴放置10分钟；在4℃的离心机上以4000转/分离心10分钟，弃上清；用2mL用冰预冷过的0.1mmol/L CaCl2溶液再次重悬沉淀，在冰上放置片刻即可得到感受态细胞。
(6)GL-7-ACA酰化酶基因DNA片段的基因克隆GL-7-ACA酰化酶基因DNA片段的基因克隆所用试剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(简称IPTG)及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(简称X-gal)由宝生物工程(大连)有限公司购得。取200μL感受态大肠杆菌TOP-10F’细胞，加入5μL步骤(5)所得连接反应物，在冰上放置30分钟，立即将管转移至42℃的循环水浴中，放置90秒，立即将管转移至冰浴中，放置2分钟，每管加入0.8mL的LB液体培养基，在37℃下放置45分钟，室温下以4000转/分的速度离心2分钟，弃上清，留约100μL，摇匀后涂布于含40μg/mL IPTG、40μg/mL X-gal和15g/L琼脂粉的LB固体培养基上，筛选无α-互补能力的白色菌落，按照常规方法制备重组质粒DNA。
(7)采用限制性核酸内切酶对步骤(6)得到的重组质粒DNA进行切割限制性核酸内切酶及相应缓冲液由宝生物工程(大连)有限公司购得。取4μl第(6)步所得质粒DNA，酶切pUCA时反应液的组成为重组质粒 4μlNotI(10U/μl)1μl酶切缓冲液(10×Buffer H) 2μlBSA 2μlTriton X-100 2μl无菌水 9μl总体积 20μl在37℃下反应3小时，采用常规0.7％琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的重组质粒长度是否为5180bp左右，如果确认得到正确的重组质粒，则该质粒即为重组有GL-7-ACA酰化酶基因的质粒，备用。
(8)将重组质粒(或菌液)进行DNA测序，由测序结果可知，所得基因即为本发明的目标产物——GL-7-ACA酰化酶基因。
实施例2、获取戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因同实施例1中步骤，只是将实施例1中步骤(1)的样品改为草地土壤，步骤(3)中的降温至65℃改为降温至66℃，和实施例1中步骤(4)连接样品的反应，改为在16℃下反应12小时。获得本发明的目标产物——GL-7-ACA酰化酶基因。
实施例3、获取戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因同实施例1中步骤，只是将实施例1中步骤(1)的样品改为污泥，步骤(3)中的降温至65℃改为降温至67℃，和实施例1中步骤(4)连接样品的反应，改为在4℃下反应20小时。获得本发明的目标产物——GL-7-ACA酰化酶基因。
序列表<160>2<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ctgggtgaga ggggaaatcc atgctgaga 29<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2tccgtcgtgt catggtcagg cctttca 2权利要求
1.一种获取戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因的方法，是从土壤微生物中获取戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的DNA或RNA，其特征在于在提取土壤微生物的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的DNA或RNA之前，进行微生物选择性培养，然后提取选择性培养微生物的染色体DNA或RNA；设计引物，进行核酸扩增得到GL-7-ACA酰化酶基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述土壤为灌木根部土壤、草地土壤或污泥。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述灌木根部土壤为土壤表层以下10cm的土壤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述选择性培养微生物为假单胞菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述选择性培养微生物的培养基为PSM培养基。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述核酸扩增通过聚合酶链式反应实现。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于所述引物为序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述聚合酶链式反应中，PCR反应的温度变化过程为先升温至92-96℃，保持1-15分钟，接着按以下的温度变化程序循环20-40次升温至92-96℃，保持1-2分钟，降温至50-70℃，保持1-5分钟，升温至70-76℃，保持1-5分钟，最后于70-76℃保持10-20分钟，结束扩增反应。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括对核酸扩增得到的GL-7-ACA酰化酶基因进行检测的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述检测的步骤中，核酸扩增得到的GL-7-ACA酰化酶基因DNA片段和质粒pGEM-T进行连接反应的温度是2-16℃，反应时间是8-20小时。
全文摘要
本发明公开了一种获取戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶基因的方法，目的是提供一种快速从土壤中获取戊二酰－7－氨基头孢烷酸(GL－7－ACA)酰化酶基因的方法。本发明所提供的方法是在提取土壤微生物的戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶的DNA或RNA之前，进行微生物选择性培养，然后提取选择性培养微生物的染色体DNA或RNA；设计引物，进行核酸扩增得到GL－7－ACA酰化酶基因。本发明的方法与传统的菌种筛选和基因克隆工作相比，可以大大减少筛选野生菌株及克隆目的基因的工作量，并能将所得基因直接构建基因工程菌，实现GL－7－ACA酰化酶的快速表达，用于7－ACA的生产。
文档编号C12P19/34GK1566353SQ03143198
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月9日 优先权日2003年6月9日
发明者沈忠耀, 罗晖, 李强, 于慧敏 申请人:清华大学