br>[0050]2.2 MTT法检测肿瘤耐药细胞活力
[0051 ] 取对数生长期的HCT-8/5-Fu耐药细胞，用含EDTA-0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，然后进行细胞计数并用不含5-Fu的RPM1-1640完全培养基调整细胞密度为I X 105个/mL，种于96孔培养板，10yL/孔，置37°C含5 % C02培养箱培养，至细胞贴壁生长覆盖率达60% 时，
[0052 ]实验①:在不同孔中分别加入 0.5mg/ml、I mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml浓度的白莲芪芽复方提取物I OOyL (相当于分别加入50yg、10yg、200yg、300yg、400yg、500μg)。对照组不加白莲芪芽复方提取物，直接加入培养基100yL。分别在干预24h和48h时吸取各孔溶液;每孔加入10yL的0.5mg/mL MTT溶液，37°C培养4h。处后，小心吸去孔内液体。往每孔内加入10yL DMSO，振荡后，在570nm处测OD值(光密度)。
[0053]实验②:在不同孔中分别加入浓度为lmg/mL的白莲芪芽复方提取物(10yg/孔)、浓度为0.25mg/ mL 的 5-Fu (25yg/孔)和浓度为0.25mg/mL 的 5_Fu (25yg/孔)+ 浓度为 lmg/mL 的白莲芪芽复方提取物(10yg/孔)的混合物。对照组不加白莲芪芽复方提取物，直接加细胞培养液。干预24h后吸取各孔溶液，每孔加入10yL的0.5mg/mL MTT溶液，37°C培养4Κ41ι后，吸去孔内液体。往每孔内加入10yL DMSO，振荡后，在570nm处测OD值。
[0054]计算细胞活力(％ )=(实验组OD值/对照组OD值)X 100%。
[0055]2.3 RT-PCR检测耐药相关基因ABCG2的mRNA表达
[0056]对数生长期的HCT-8/5-Fu耐药细胞胰酶消化后，取2乂105个细胞/孔，接种于6孔板。2411后进行药物干预，在不同孔中分别加入浓度为0.51^/1111、11^/1111、21^/1111的白莲芪芽复方提取物，每孔21^(相当于分别加入0.51^、11^、21^)。对照组不加白莲芪芽复方提取物，直接加细胞培养液2mL。继续培养24h后，采用Trizol法提取总RNA，逆转录为cDNA，进行PCR扩增，琼脂糖电泳及凝胶成像，观察白莲芪芽复方提取物对ABCG2表达的影响。
[0057]2.4裸小鼠移植瘤动物模型的建立
[0058]取对数生长期的HCT-8/5-Fu耐药细胞制成细胞悬液，与基质胶1:1混匀后用Iml —次性注射器吸取悬液接种于裸小鼠右皮下腋窝，每只注射0.lml。整个操作在SPF条件下进行。待肿瘤平均体积长到10mm3时，将裸小鼠均分为4组:对照组给予生理盐水，5_Fu组给予5-氟尿嘧啶(20mg/kg)，复方组给予白莲芪芽复方提取物(lg/kg，即相当于原生药量12g/kg)，联合组同时给予5-Fu(20mg/kg)和白莲芪芽复方提取物(lg/kg^-氟尿嘧啶采用腹腔注射给药，生理盐水和白莲芪芽复方提取物采用口服灌胃给药。一周连续给药6天后，停药I天。给药4周后，测量瘤体大小及瘤体重量。
[0059]2.5统计学处理
[0060]实验数据用SPSS22.0软件进行统计学分析，以x±s表示，P<0.05为差异具有统计学意义。
[0061]3.结果:
[0062]3.1本发明中药组合物对细胞活力的影响
[0063]由图1可见，与未加任何药物的对照组相比，白莲芪芽复方提取物对HCT-8/5-Fu耐药细胞的活力具有显著的抑制作用，且呈现明显的剂量和时间依赖作用:白莲芪芽复方提取物5mg/mL干预24、48h后HCT-8/5-Fu耐药细胞活力分别降低至26.49%、22.48% (注:与对照相比*P<0.05)。
[0064]由图2可见，与未加白莲芪芽复方提取物和5-Fu的对照组相比，白莲芪芽复方提取物对HCT-8/5-Fu耐药细胞抑制作用比5-Fu效果明显，白莲芪芽复方联合5-Fu时抑制作用更显著，抑制率达到53.04%，说明白莲芪芽复方提取物对5-Fu有增效作用(注:与对照组相比 *P<0.05)。
[0065]3.2本发明中药组合物对ABCG2mRNA表达的影响
[0066]癌症耐药性的产生主要是由于癌细胞高表达ABC转运蛋白，其中ABCG2是ABC转运蛋白超家族的重要成员之一 ABCG2在癌症中的高表达，能将细胞内的5-Fu栗出胞外，降低化疗药物在细胞内的蓄积而导致化疗的失败。
[0067]由图3可见，与未加任何药物的对照组比较，白莲芪芽复方提取物能明显地抑制HCT-8/5-Fu耐药细胞ABCG2的mRNA表达，且随剂量增加表达量下降。以上实验结果表明，白莲芪芽复方提取物具有明显抑制结肠癌5-Fu耐药细胞ABCG2表达的作用，通过抑制耐药基因的表达起到逆转耐药性的作用。
[0068]3.3本发明中药组合物对瘤体的影响
[0069]由图4可见，与对照组相比，其它三组瘤体体积均减小;联合组瘤体体积较5-Fu组、复方组减小明显，抑制瘤体生长作用最显著(注:与对照组相比*P<0.05)。
[0070]由图5可见，与对照组相比，其它三组瘤体体重均减小;联合组瘤体重量较5-Fu组、复方组减小明显(注:与对照组相比*P<0.05)。
[0071]以上结果表明，白莲芪芽复方提取物联合5-Fu能有效的增强5-Fu抑制瘤体生长的作用。
【主权项】
1.一种防治癌症的中药组合物，其特征是:它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂:白花蛇舌草10份?20份、半枝莲10份?20份、炙黄芪10份?20份、炒麦芽10份?20份。2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征是:它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂:白花蛇舌草I份、半枝莲I份、炙黄芪I份、炒麦芽I份。3.如权利要求1或2所述的中药组合物，其特征是:它是由各重量配比原料药的原生药粉、水或有机溶剂提取物，加上药学上可接受的辅料或辅助性成份制备而成的制剂。4.如权利要求3所述的中药组合物，其特征是:所述的制剂为口服制剂或注射制剂。5.—种权利要求1?4任意一项所述中药组合物的制备方法，其特征是:包括如下步骤:取各重量配比的原料药，水提，过滤，收集滤液，浓缩，即得。6.权利要求1?4任意一项所述中药组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。7.如权利要求6所述的用途，其特征是:所述的药物是治疗和/或预防耐药癌症的药物。8.如权利要求7所述的用途，其特征是:所述的药物是治疗和/或预防对5-氟尿嘧啶耐药癌症的药物。9.如权利要求6?8任意一项所述的用途，其特征是:所述的药物是治疗和/或预防大肠癌的药物。10.—种防治癌症的联合用药物，其特征是:它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的权利要求1?4任意一项所述的中药组合物和5-氟尿嘧啶，以及药学上可接受的载体。11.如权利要求11所述的联合用药物，其特征是:所述中药组合物中各原料药和5-氟尿嘧啶的重量配比为:白花蛇舌草I份、半枝莲I份、炙黄芪I份、炒麦芽I份、5-氟尿嘧啶I份。
【专利摘要】本发明公开了一种防治癌症的中药组合物，它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：白花蛇舌草10份～20份、半枝莲10份～20份、炙黄芪10份～20份、炒麦芽10份～20份。药效实验证明，本发明中药组合物对大肠癌HCT-8/5-Fu耐药细胞活力具有明显的抑制作用，其抑制作用甚至比目前临床治疗癌症的一线用药5-Fu的效果更加显著。当本发明中药组合物联合5-Fu使用时，抑制率可达53.04％，说明其对5-Fu有增效作用。进一步的抑瘤实验表明，该组合物可显著抑制瘤体的体积和重量，尤其与5-Fu联合使用时抑制瘤体生长作用最显著。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/8998, A61K31/513
【公开号】CN105535701
【申请号】CN201610033808
【发明人】林久茂, 彭军, 林珊, 魏丽慧, 褚剑锋, 赖子君, 严兆坤
【申请人】福建中医药大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月19日