br>[0145] 通过加入HCl溶液和以1:1比例混合的K3PO4与Na 2HPCk调节最终制剂的pH为约7.0。
[0146] 实施例2、角叉菜胶对体外HIV感染的作用
[0147] 角叉菜胶已经由包括PI15-19实验室的几个实验室证实阻止HIV和其他包膜病毒。 这些研究中采用了几种不同类型的HIV靶细胞和菌株。通常地，以几微克/毫升即可观察到 50%的阻断作用。该结果与其他硫酸聚多糖(诸如肝素与硫酸葡聚糖)相似。
[0148] 实施例3、阴道内病毒感染研究-HSV-2/小鼠
[0149] HSV-2/小鼠（Balb/C)系统被大多数从事杀菌剂开发的研究群体广泛地利用。 Phillips20-22建立的系统和其他系统最主要的区别在于病毒剂量范围对照的利用。其他 系统用于评估抗菌剂所使用的为标准病毒攻击剂量(即100%感染剂量或I(Mpfu)是限速性 的。大多数正在开发中的杀菌剂，以及许多非处方(OTC)杀精剂一样，在这种病毒攻击剂量 下，在对抗HSV-2感染的保护方面显示出显著的效率。然而，Phillips利用一种能够在105、 106及1000 X 100%感染剂量的病毒攻击剂量下进行评估的病毒浓度方法。
[0150] 利用这种病毒攻击剂量系统进行了对比研究，以评估一些开发中杀菌剂、OTC杀精 剂和润滑剂，以及在临床试验中用作安慰剂的可能制剂的对比保护比率，以评价杀菌剂的 有效性。除了含有所述κ-11/λ型角叉菜胶混合物的本发明的组合物(本文也称为"κ-ΙΙ/λ型 角叉菜胶组合物"）外，对照试验制剂为：诸如BufferGelTM和No Fertil的开发中杀菌剂， OTC杀精剂（K-YPlus?GynolII?,和Advantage STM;0TC阴道润滑剂：Replem?和K-YMly?; 以及可能的安慰剂制剂:2.5 %的Carbopol?和2.5 %的甲基纤维素。
[0151] 根据在保护小鼠免受阴道HSV-2感染的有效性，试验制剂被分为三类。在104pfu的 病毒攻击剂量，除K-Y jelly、聚羧乙烯和甲基纤维素，所有制剂都提供了保护免受HSV感染 的显著水平。然而，在105pfu的病毒攻击剂量，除所述κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物，所有制剂 只提供最小水平的保护。在l〇6pfu病毒攻击剂量时，κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物是唯一对病 毒感染仍提供一定水平保护的制剂 2()。通过病毒剂量范围比较系统中对各种制剂进行评价， 所得到的数据第一次展示了所述对病毒感染意料不到的高水平保护作用。
[0152] 因此，可以确定HSV-2/小鼠系统可用作在同样的条件下可检测评估并比较候选杀 菌剂的手段的手段，以识别潜在有效的杀菌剂。
[0153] 实施例4、活性持续时间-HSV-2/小鼠
[0154] 一种由UNAIDS(世界健康组织AID部门）为理想杀菌剂制定的标准规定"它应当在 插入后具有活性并能持续较长的一段时间"，给予女性在产品使用方面更多的灵活性。另 外，由无细胞或与细胞相关HIV引起的感染的时间段可能不是即时的。可以采用HSV-2/小鼠 系统评价杀菌剂可保持活性的时间段。这可以通过在阴道内施用检测制剂，等待设定时段 的时间，然后用已知剂量的病毒攻击小鼠而完成。采用GynoIII? (2 %含有OTC杀精剂的N -9)、:BUfferGer? (开发中低pH杀菌剂)和κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物，在施用制剂后5分钟以及 1.5、3、6及18小时进行"活性期间"试验。在1.5小时的时间点，GynolII?不再提供任何对抗 感染的保护且BufiferGel?降至仅30%有效。BufferGel的有效性随时间延长而持续下降且 在6小时后不再提供任何保护。形成鲜明对比的是，所述κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物在保护免 受HSV-2感染方面保持85-100 %有效长达6小时，且保持72 %有效长达18小时。所述κ-ΙΙ/λ 型角叉菜胶组合物持续保持一定水平的活性长达24小时。参见图1。只有角叉菜胶唯一延长 了保护免受病毒感染的时间段，特别是κ-11/λ型角叉菜胶组合物。
[0155] 实施例5、直肠内病毒感染研究-HSV/小鼠
[0156] 理想地，在保护免受HIV引起感染有效的杀菌剂可以用于直肠途径以及阴道途径。 采用直肠内病毒攻击改良的HSV-2/小鼠系统探索对杀菌剂有效性和安全性的评价。
[0157] 与用PBS或甲基纤维素(惰性安慰剂)23的预处理相比，用κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物 对直肠进行预处理显著地降低了用HSV-2攻击直肠后而感染的动物数量。
[0158] 实施例6、κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物对阴道菌群的作用
[0159] 杀菌剂的使用不扰乱自然阴道菌群的平衡是重要的。体外研究表明角叉菜胶不增 加也不抑制嗜酸乳杆菌的生长速度，嗜酸乳杆菌是存在于阴道菌群中最常见的细菌。一项 根据35名女性参加的针对κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物的阴道安全性的I期临床试验而进行的 研究显示，通过检测细菌性阴道炎是否存在，阴道菌群没有显著变化 13。
[0160] 实施例7、HIV/小鼠病毒运输系统
[0161]尽管小鼠不会感染HIV，当将活性的或非活性的病毒缓慢灌输至小鼠的阴道内时， 继而可通过利用逆转录酶-聚合酶的链反应(RT-PCR)在淋巴结中检测到病毒24。证据表明树 突状细胞在摄取病毒和运输至淋巴结方面发挥了作用。该结论与暗示树突状细胞在HIV25 性转播的初始阶段的作用相一致 25。
[0162] 结果表明κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物在阻止HIV到达淋巴结方面是有效的，据推测 可能是通过阻断HIV从阴道经由树突状细胞的运输。
[0163] 采用了利用小鼠系统和AldritholTM-2失活病毒的HIV运输。这是一种不改变病毒 包膜而使HIV失活的标准方法。为检测HIV而对脾脏和淋巴结进行了分析，以确立脾脏为HIV 的替代贮存点。脾脏（与淋巴结相反）允许获取相对较多数量的RNA以进行检测HIV的RT-PCR。另外，与取出淋巴结相比，脾脏的提取费时较少，从而RNA降解的可能性降低。
[0164] 为确定κ-11/λ型角叉菜胶组合物在防止HIV跨越宫颈/阴道屏障的有效性，小鼠被 随机分为三组：1)非治疗的PBS对照小鼠；2)用甲基纤维素(惰性安慰剂)预处理的小鼠；3) 用κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物预处理的小鼠。结果如图2中的Southern印迹及下表所示。
[0166] 来自以PBS(对照)和甲基纤维素处理的与用κ-11/λ型角叉菜胶组合物处理的小鼠 的数据显示，κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物显著降低阳性（即被感染的）动物数量，相比于PBS (对照）甲基纤维素没有作用。该数据还表明κ-11/λ型角叉菜胶组合物在防止HIV离开阴道 穹窿方面是有效的。
[0167] 实施例8、细胞运送/小鼠系统
[0168] 以前所指出的HIV性传染可被跨生殖道上皮细胞的精液中感染HIV的淋巴细胞或 巨噬细胞所调控26、 27。为了检验单核血细胞从阴道穹窿通过完整上皮细胞运送的假设，将双 重染色的活性单核血细胞(小鼠）放置在小鼠的阴道中。四小时后，处死动物，摘取回肠与腹 股沟处的淋巴结和脾脏，分离细胞并通过荧光显微镜计数。在回肠与腹股沟的淋巴结和脾 脏中观察得到许多带有双标记的细胞28、xx。为评价κ-11/λ型角叉菜胶组合物在阻断这个过 程中的作用，在灌注经标记细胞前，用检测试剂对动物进行预处理。
[0170]在回肠与腹股沟的淋巴结和脾脏内都存在供体细胞。当小鼠只接受阴道接种巨噬 细胞时，在从受体动物淋巴结内具有平均55个标记供体细胞，脾脏内具有平均558个标记供 体细胞。在接受κ-11/λ型角叉菜胶组合物的阴道预接种的小鼠中（上表中标示为"κ-ΙΙ/λ型 角叉菜胶"），引流淋巴结中只计有平均4个细胞，脾脏中只发现平均28个。未处理的和经K- π/λ型角叉菜胶组合物处理过的动物之间的区别是显著的。当用甲基纤维素对受体进行预 接种时，到达淋巴结和脾脏的供体细胞的数量为淋巴结中平均26个，脾脏中153个。K-11/λ 型角叉菜胶组合物处理过的小鼠和甲基纤维素处理过的小鼠之间的区别是显著的，然而未 处理的小鼠和甲基纤维素预接种的小鼠之间的区别并不明显。在接种了冷冻-解冻CMTMR染 色巨噬细胞的对照小鼠中没有观察到荧光细胞。
[0171] 实施例9、对乳头瘤病毒的杀菌作用
[0172] κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物还被证实在阻断体外牛乳头瘤病毒病灶形成方面是有 效的（数据未示出）Α-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物在防止人乳头瘤病毒(HPV)在异种移植系统 中转变为人阴道外植体的方面是有效的。SKID小鼠异种移植系统采用对N0D/SKID(免疫缺 陷）小鼠皮下移植而卷入柱形管的人阴道组织的外植体 29。允许对移植物治疗两周，届时打 开管的一端，灌输测试化学物然后以HPV进行攻击。在评估κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物的实验 中，14个用生理盐水处理的对照外植体中全部转变。相比之下，用κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物 处理的17个外植体中只有一个被转变(数据未示出）。
[0173] 实施例10、κ/λ型角叉菜胶混合物在稀释测定中的作用
[0174] 高度稀释的κ/λ型角叉菜胶混合物如在HSV-2小鼠系统中所显示也是有效的。3% 的κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物在PBS中稀释以制成1:1、1:5、1:25、1:50、1:100及1:200的稀释 液。对小鼠阴道给药稀释溶液，随后用104(100%感染剂量)的HSV-2进行攻击。这些试验的 结果是出乎意料的。1:50的κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物(及稀释较少溶液)保持大部分的对抗 病毒保护率，却没有观察到抗病毒保护率剂量依赖性降低。此外，即使在1:200的溶液中仍 保持了显著的活性。參见图11。
[0175] 实施例11、基于κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物的制剂对抗HIV的作用
[0176] 当把组合物加入到或连接至至本发明角叉菜胶群组中或与其结合时，化合物已被 确定可显著地增加在阻断体外PBMC的HIV感染方面的有效性。锌-角叉菜胶和LSA-角叉菜胶 在阻断PBMC的HIV感染的有效性的研究显示了低浓度的两种制剂都比只包含角叉菜胶组的 组合物更有效。检测结果如图3所示。
[0177] 实施例12、LSA-角叉菜胶抗HSV-2的作用
[0178]结果表明LSA-角叉菜胶在阻断HIV感染方面比角叉菜胶群组更有效(參见图4)。起 初，因为LSA的棕色颜色的事实，其似乎并不是理想的用于杀菌剂的候选化合物。然而，已经 发现0.25%浓度的LSA是高度有效的，且配制时颜色是微不足道。为了确保LSA是不着色的， 将白色棉织物在3%的LSA中浸泡过夜，然后用自来水冲冼;结果显示织物的颜色没有改变。 在HSV-2/小鼠系统中比较LSA-角叉菜胶与角叉菜胶，以确定在阻断体内病毒感染方面的有 效性。初歩结果显示，LSA-角叉菜胶在阻断病毒感染方面比角叉菜胶更有效。
[0179]除了以上呈现的结果以外，在三个独立的试验中，为，在106pfu的病毒攻击剂量下 对LSA-角叉菜胶与只有κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶的组合物进行比较。在所有的试验中，LSA-角叉 菜胶都比只有κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶的组合物更显著地有效。在κ-ΙΙ/λ角叉菜胶组合物中加入 其他的硫酸化聚合物没有增加制剂的有效性。例如，向κ-11/λ型角叉菜胶组合物中加入5 % 的硫酸葡聚糖或5 %的肝素对小鼠对抗HSV-2感染的有效性没有作用。
[0180]具有或没有LSA的κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物（下面三个表中标示为"角叉菜胶"）的 制剂的评价
[0181] HSV-2的106pfu病毒剂量相当于会感染所有未保护小鼠的病毒剂量的100倍。应用 这种高剂量的病毒是必需的，因为角叉菜胶在抑制病毒感染方面是极其有效的。
[0182] 对每种制剂最初都用总数为20只的小鼠进行试验。显示阻断作用的化合物或制剂 相对另外的20只小鼠进行测定。感染小鼠的数量是平均值。
[0184] 病毒剂量为100%感染率的100倍，在如此高的病毒剂量下，除了3%角叉菜胶极小 的作用外，没有化合物具有任何作用。
[0185] 随后，对没有角叉菜胶的LSA进行测定，以更好地评估其抑制性能。将LSA加入惰性 增稠剂和甲基纤维素，以维持阴道产品（润滑剂、杀精剂及杀菌剂)通常具有的相同粘度。 (以下示出数据。）
[0186] 没有角叉菜胶的LSA的评价
[0188] 经证明LSA比角叉菜胶更有效，显示出比角叉菜胶更好地阻断HSV-2感染。然而，这 两种成分的组合比单独的任何一种都更有效。
[0189] 实施例13、LSA在杀菌剂中的应用
[0190]与角叉菜胶结合或不与角叉菜胶结合，LSA作为抗HSV-2感染、HIV及其他STI的杀 菌剂都是有效的。硫酸化聚合物LSA在保护体外上皮细胞抗HI V感染和在保护小鼠不受HSV-2感染方面是有效的。可以在对其他包膜病毒(诸如人类病原体、人类T细胞白血病病毒)上 发现该抑制作用。此外，保护上皮细胞抗非包膜病毒的人乳头瘤病毒。因此LSA的抑制有效 性可延伸至STI的更广泛范围。测试结果如图5所示。
[0191] 实施例14、锌-角叉菜胶抗HSV-2的作用
[0192] 在体内和体外都已进行了锌-角叉菜胶抗HSV-2感染的有效性研究。体外研究测定 了单独的锌盐在HSV-2噬菌斑试验中防止菌斑形成的作用 41。已发现锌盐在降低菌斑形成中 在50mM的浓度下具有IC50。已发现锌-角叉菜胶比单独的角叉菜胶或锌盐在防止菌斑形成 方面更显著地有效，IC50〈10mg/mL或<25mM。检测结果如图6所示。
[0193] 还在HSV-2/小鼠系统中对锌-角叉菜胶进行了评估(参见图7)。为比较锌-角叉菜 胶与OTC杀精剂K-Y Plus及κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物，还采用范围在从l〇3pfu或50%感染 剂量至l〇7pfu或1000\100%感染剂量的批￥-2病毒攻击剂量。申请人已确定1〇-11八型角叉 菜胶组合物能够以106pfu或100 X 100%感染剂量的病毒攻击剂量保护一些动物。所检测的 其他候选杀菌剂不能在该病毒剂量下提供保护。在初歩的研究中，已经观察到锌-角叉菜胶 在该剂量下对l〇7pfu或1000 X 100%感染剂量的病毒攻击剂量显著地保护小鼠抗HSV-2感 染。将Zn添加至κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物（以形成复合物)增加了抗病毒保护水平的事实是 最无法预测的。
[0194] 实施例15、锌-角叉菜胶的活性持续时间
[0195] κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物在小鼠阴道内保持很长一段时间的活性。进行类似的试 验以比较锌-角叉菜胶与两种OTC杀精剂(Advantage S和Conceptrol)的活性持续时间。已 发现，锌-角叉菜胶在6个小时内没有丧失任何水平的活性，而Advantage S和Conceptrol在 1.5小时显示出活性降低了 50%且在3小时后不能再提供保护作用(參见图8)。
[0196] 实施例16、病毒攻击后锌-角叉菜胶的有效性
[0197] 即使在暴露于病毒后给药仍能有效的杀菌剂可扩大产品的用途以包括那些在性 交发生后才能够使用该产品时妇女，如那些称为强奸牺牲者的妇女。先前，研究者无法确定 能提供这种保护的杀菌剂。锌-角叉菜胶可在病毒攻击后的小鼠提供抗HSV-2感染的保护。 如以下数据表明，锌-角叉菜胶在其显示出暴露于病毒后长达4小时的活性方面是非同一般 的（参见图9)。申请人所观察到κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物无法阻止病毒攻击后感染除非在 HSV-2攻击后立即给药方面是卓越的。
[0198] 实施例17、双重保护的避孕杀菌剂
[0199] 所述κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物可在阴道中保持高达24小时，使每日一次使用该组 合物用于抗HIV的保护，且其可作为用于避孕激素的阴道递送系统。随着近期避孕避孕环的 发展已经充分研究了阴道内递送各种类固醇的可行性 43。已表明，直接施用只阴道粘膜的类 固醇被快速地吸收，且只要很小的剂量即达到所期望的避孕效果48%。另外，阴道递送通常 伴随着减弱的不被期望的与口服避孕药有关的副作用。
[0200] 本发明的阴道制剂提供如杀菌剂/避孕药组合的双重保护，其具有增强使用者依 从积极性的进一步优势。避孕激素 NES是优选的避孕药。这种合成孕酮已被证明是特别有效 的分子。采用测量黄体酮效力的经典生物检测，，NES被证实比黄体酮的活性强100倍，抑制 黄体活性只需要非常少量的NES。另外，已经进行了广泛的NES毒理学研究。
[0201 ]实施例18、NES从κ/λ型角叉菜胶混合物中的扩散
[0202]为使含由κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物和NES(以下为"CARRA/NES"）的制剂为有效的 避孕药，有必要将NES从角叉菜胶中释放出来并通过阴道吸收NES。我们已进行了体外测定 以确定NES是否从CARRA/NES中释放出来。
[0203] 我们检测了NES通过截留分子量为1000的透析膜的扩散。NES的分子量为370。以 HPLC测量出，NES以恒定速率从透析袋中扩散出来。结果如图10所示。这些结果表明NES没有 与角叉菜胶结合。然而，观察到通过透析膜的扩散速率只依赖于透析袋的表面积，而不能与 可在人类阴道中观察到的扩散速率相联系。阴道内的条件可以是不同的。
[0204] 我们还进行了一种试验，其包含:在2000g下通过Ultrafree-15离心过滤器和管组 件对CARRA/NES离心99分钟，以计算所释放的NES的百分比。所述离心过滤器是安装在离心 管内的一种装置。该装置在底部具有槽形过滤器，其允许分子量小于500的分子通过。利用 这种装置，超过98 %的所添加 NES被回收在滤液中。该试验证实NES没有与角叉菜胶结合。
[0205] 实施例19、CARRA/NES(释放速率）
[0206] CARRA/NES
[0207] 将增加浓度的NEC溶液配制成κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物以确立两种化合物的兼容 性。通过测量pH、粘度、均匀度和眼部外观，κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物中500yg/mL浓度的NES 保持了流变性能，并且通过测定HSV-2/小鼠，κ-ΙΙ/λ型角叉菜胶组合物中500yg/mL浓度的 NES表现了强度的保持。NES的这种浓度比100pg/mL的高剂量制剂所需的预期浓度高40倍。 [0208] 用膜透析和Ultrafree-15离心两种不同方法研究NES从CARRA/NES中的扩散。在膜 透析实验中，膜的截留分子量为1000,利用HPLC测量NES的扩散。结果显示NES没有与带负电 的角叉菜胶结合，尽管通过透析膜的扩散速率与体内全身性吸收的速度是不同的，扩散是 以时间依赖的方式发生的。在U Itrafree-15离心实验中，采用了 Millipore公司的 Ultrafree-15离心过滤器和管组件，这允许分子量〈500的分子通过;NES的分子量为370。该 技术的使用揭示出回收了 98.6 %的NES。
[0209] 实施例20、锌/角叉菜胶/MIV-150
[0210]本发明最优选的角叉菜胶群组与如所述水溶性金属的乙酸锌和如NNPTI的MIV-150的结合与锌/角叉菜胶（PC-707 )、MIV-150/角叉菜胶（PC-815)及角叉菜胶 (CarraguatxUO的结合进行了比较。特别地，在最后一次剂量的各个这些凝胶后8小时或24 小时以SHIV-PT对动物进行攻击，PC-707和PC-815在与Camiguard?大约相同水平下分别阻 止阴道SHIV-RT感染(P值大于0.05)，同时，PC-1005在这两个时间点阻断阴道SHIV-RT感染 的作用优于这些化合物(P值小于0.03)。因此，尽管PC-707和PC-815确实阻断阴道SHIV-RT 感染至一定程度长达24小时，无法预测乙酸锌、角叉菜胶和MIV-150的结合可完全阻断阴道 SHIV-RT感染长达24小时。
[0211]实验步骤如下进行：
[0212]将1.5克的乙酸锌二水合物、15.0克的角叉菜胶群组(本例中为95%的λ型角叉菜 胶和5 %的κ型角叉菜胶)和300.3克的无菌纯净水装入700mL的玻璃混合罐。用高架搅拌器 在300rpm和环境室温下对内容物进行混合三小时。另外地，将1.0克的羟基苯甲酸甲酯和 150.9克的无菌纯净水装入250ml的锥形瓶。将该锥形瓶在搅拌下加热至60°C以得到澄清溶 液，将该锥形瓶内的内容物立即加入容纳于700mL混合罐的锌-角叉菜胶水混合物。在环境 温度下对混合物进行2小时的搅拌，此时向700mL混合罐的内容物中加入5ml的MIV-150/ DMSO储存液，该MIV-150/DMS0储存液是通过在IOml的二甲亚砜中溶解18.5mg的MIV-150制 备的。然后在环境温度下以300rpm的转速对得到的混合物进行35分钟的搅拌，然后向混合 罐内加入26克无菌纯净水，并在环境温度下对其内容物进行30分钟的搅拌。
[0213]在施用最后一次凝胶后的指定时间用1000TC1D50的SHIV-RT进行攻击前，给弥猴 注射射甲孕酮三周后的两周中约每天给予2ml按照上述方法制备的凝胶。下表1中所示出的 感染动物的数量反映了具有典型病毒血症(血浆内SIV RNA复制）的数量。
[0214] 实施例21
[0215] 使用具有相同尺寸的两半的传统黄铜腔模具制造半尺寸的猕猴IVR(20毫米X2毫 米）。将黄铜平板相对于所述模具的一半进行放置。因而，该黄铜平板通过注射成型提供了 半猕猴IVR，而不是制造一个全尺寸的IVR(20毫米X4毫米），其中所述两个空腔模具连结在 一起并对聚合物进行注射成型。所使用的聚合物是EVA28(科学聚合物产品Scientific Polymer Products)，其是在127°C时注射成型的。
[0216] 随后，将48毫米长的黄铜线（1.62毫米厚）（R.J.Leahy，轨距14)成形为17.3毫米外 径的环。将其放置于半环的平坦表面上并在约110°c进行加热。通过利用黄铜平板轻轻施加 压力而使压线嵌入聚合物基质中。然后在加热后除去嵌入式黄铜弹簧，由此在半环的上表 面形成凹槽。
[0217] 然后，将约SOmg角叉菜胶混合物手工填入于所述半环的平坦表面上形成的凹槽或 通道。然后通过将相同的黄铜线放置在该表面上并利用黄铜板压紧角叉菜胶粉末，由此将 角