PC12)细胞株，来源于自ATCC细胞库。
[0097] 二、实验方法
[0098] 1.细胞培养与给药
[0099] 将PC12细胞按接种量2 X IO5个/孔接种于6孔板中培养24h后，对照组每24h换一次 新鲜培养液，共培养48h。样品组加实施例1中药提取物低剂量、中剂量、高剂量（1、3、IOug/ mL)24h后，换液，重新加入上述中药提取物，培养24小时。阳性药组:NGF( IOOyM)，按上述加 药方法培养48小时。
[0100] 2.实时定量巧光PCR仪测定神经营养因子转录水平表达
[0101] RNA提取:吸去细胞培养液，加入2mL的PBS冲洗，每盘细胞中加入50化L的TRIzol， 按TRIZOI RNA提取试剂盒所列步骤进行操作。所提取RNA于-80°C保存。
[0102] CDNA的制备：用化nodrop测试RNA的浓度和纯度，根据化KaRa逆转录试剂盒的说 明，总计取用化g的RNA来进行逆转录的操作。
[0103] 依照SYBR巧光实时定量试剂盒操作步骤，利用巧光实时定量PCR仪测定神经营养 因子的基因转录水平表达。所用引物序列如下：
[0105] 3.统计学处理
[0106] 所有实验数据均采用SPSS18.0统计处理软件进行统计学处理，结果表示， 组间差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
[0107] S、实验结果
[0108] PC12细胞常用于神经递质表达研究。将体外培养的PC12细胞，加 W本发明提供的 中药提取物培养后，如图5所示，中药提取物可W上调神经递质合成酶Tyrosine hydroxyIase、Aromatic acid decarboxylase、Dopamine-b-hydroxyIase，由图6戶/f示，可下 调神经递质降解酶Monoamine oxidase A、Monoamine oxidase B、Catechol-〇-methyltransferase的表达。与阳性药NGF作用趋势一致，提示本发明提供的中药提取物具 有促进神经递质合成，抑制神经递质降解的活性。
[0109] 实施例6中药提取物对神经营养因子表达的体外实验研究
[0110] -、实验材料与药物
[0111] 1.实验仪器
[0112] 二氧化碳培养箱（Forma series n water jacket C02 incubator Jhermo公 司），1300 series A2超净工作台（Thermo公司），Auto Vert Al倒置巧光显微镜（ZEISS公 司），恒溫水浴锅(Bluepard公司），多功能酶标仪化nspire，Perkin Elmer公司），细胞培养 器皿(CORNING公司）。
[011引2.试剂与药物
[0114] TRIzol RNA提取试剂盒（15596-026, Invitrogen) eRT-PCR反转录试剂盒 (PrimeScript? RT reagent Kit with 曲NA 化aser，RR047A，TAKARA);SY服巧光定量PCR 试剂（FastSta;rt Universal SYBR Green Master(ROX),04913914001 ,Roche)。化日壯ord 试 剂盒(T931OA，TAKARA)。NGF(Almone lab);受试药物:本发明实施例1制备得到的中药提取 物。
[011引 3.细胞株
[0116] 大鼠胶质瘤(C6)细胞株，来源于ATCC细胞库。
[0117] 二、实验方法
[011引1.细胞培养与给药
[0119] 将C6细胞按接种量2X IO5个/孔接种于6孔板中培养2地后，对照组每2地换一次新 鲜培养液，共培养4她。样品组加实施例1中药提取物低剂量、中剂量、高剂量（l、3、10ug/血） 24h后，换液，重新加入上述中药提取物，培养24小时。阳性药组:cAMP( IOOiiM)，按上述加药 方法培养48小时。
[0120] 2.实时定量巧光PCR仪测定神经营养因子转录水平表达
[0121] RNA提取:吸去细胞培养液，加入2mL的PBS冲洗，每盘细胞中加入50化L的TRIzol， 按TRIZO1 RNA提取试剂盒所列步骤进行操作。所提取RNA于-80°C保存。
[0122] CDNA的制备：用化nodrop测试RNA的浓度和纯度，根据化KaRa逆转录试剂盒的说 明，总计取用化g的RNA来进行逆转录的操作。
[0123] 依照SYBR巧光实时定量试剂盒操作步骤，利用巧光实时定量PCR仪测定神经营养 因子的基因转录水平表达。所用引物序列如下：
[0125] 3.统计学处理
[01 %]所有实验数据均采用SPSS18.0统计处理软件进行统计学处理，结果w* ±s表示， 组间差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
[0127] S、实验结果
[0128] C6细胞常用于神经递质表达研究。将体外培养的C6细胞，加 W实施例1中的中药提 取物培养后，如图7所示，本发明提供的中药提取物可W上调NGF、抓NF与GDNF的含量，与生 理盐水组相比有显著性差异(P<〇.05)。与之相比，作用趋势与阳性药CAMP相似。
[0129] W上实验结果表明，本发明提供的中药提取物具有显著的改善抑郁情绪、促进神 经递质与神经营养因子表达等功能，具有很好的对抗抑郁症的作用。与现有的最常用的抗 抑郁西药氣西汀相比，该组合物具有更多种类的神经递质调控作用祀点，还具有显著的促 进多种神经营养因子表达的效用，尤为氣西汀所不及，具有较高的药物开发价值。
[0130] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种具有抗抑郁作用的中药提取物，其特征在于，它由下列方法制备得到： 步骤1:选取如下原料药:人参300-600份、远志200-400份、石菖蒲200-400份、茯苓300-600份； 步骤2:取步骤1的原料药，加水提取，取提取液浓缩，得浓缩液； 步骤3:取步骤2的浓缩液，通过大孔树脂柱洗脱，得洗脱液，浓缩。2. 如权利要求1所述的具有抗抑郁作用的中药提取物，其特征在于，步骤1中原料药的 组成为： 人参300份、远志200份、石菖蒲200份、茯苓300份。3. 如权利要求1或2所述的具有抗抑郁作用的中药提取物，其特征在于，步骤2中，将原 料药用加水回流提取2-4次，每次提取1 -2小时。4. 如权利要求1或2所述的具有抗抑郁作用的中药提取物，其特征在于，将步骤2所得提 取物浓缩成浓度为〇. 5-1. Og/mL。5. 如权利要求1或2所述的具有抗抑郁作用的中药提取物，其特征在于，步骤3所述的大 孔树脂洗脱条件为:吸附流速为1.0-2. OmL/min，洗脱液依次用水和体积浓度为10-90 %的 乙醇，分别洗脱3-7倍树脂体积，洗脱流速为1.0-2. OmL/min，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减 压干燥，即得。6. 如权利要求1或2所述的具有抗抑郁作用的中药提取物，其特征在于，步骤3中所述的 大孔树脂洗脱条件为:860021型大孔吸附树脂，吸附流速为2. OmL/min，大孔树脂柱径高比 为1:10，水洗脱2倍树脂体积进行除杂，除杂流速为1. OmL/min;然后以10 %，30 %，50 %， 70%，90%体积浓度乙醇依次洗脱大孔树脂柱5倍柱体积，收集体积浓度为90%乙醇洗脱 液，减压干燥，即得。7. 权利要求1或2所述的具有抗抑郁作用的中药提取物在制备防治抑郁症药物中的应 用。8. 根据权利要求6所述的具有抗抑郁作用的中药提取物在制备防治抑郁症药物中的应 用，其特征在于，将中药提取物和药学上可接受的载体制成片剂、丸剂、散剂、汤剂、颗粒剂、 煎膏剂或浸膏剂。
【专利摘要】本发明公开了一种具有抗抑郁作用的中药提取物及其应用，本发明以人参300-600份、远志200-400份、石菖蒲200-400份、茯苓300-600份为原料药，加水提取，取提取液浓缩，得浓缩液；浓缩液通过大孔树脂柱纯化，先用水去杂，再采用优选体积的乙醇洗脱，得洗脱液，浓缩得到。经过小鼠悬尾与游泳抑郁模型与PC12细胞、C6细胞模型验证，本发明提供的中药提取物具有明显改善抑郁样情绪，抑制神经递质降解，促进神经营养因子表达的作用，疗效可靠，安全性好，不良反应低，可用于制备抗抑郁的药物。
【IPC分类】A61K36/888, A61P25/24
【公开号】CN105663506
【申请号】CN201610115772
【发明人】朱悦, 詹华强
【申请人】南京中医药大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月1日