用于活化和缀合生物分子的方法
【专利说明】用于活化和缀合生物分子的方法
[0001] 本申请是基于申请日为2011年2月21日，优先权日为2010年2月21日，申请号为 201180020149.0,发明名称为："用于活化和缀合生物分子的方法"的专利申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明设及用于生成生物分子缀合物的方法，其中将该方法整合入单一单元操作 (single unit operation)中。
[0003] 发明背景
[0004] 随着生物技术的进展，已经开发出生物药物来满足未满足的医学需要。然而，其短 的体内半衰期需要患者服用频繁和/或大剂量的运些生物药物来实现祀标治疗或预防目 的。长的静脉内疗法或频繁的注射可W影响患者的生命质量。多种聚合物诸如聚乙二醇 (PEG)可W与生物分子（例如，蛋白质）缀合W提高许多生物分子的半衰期和生物活性 (Reddy ,Ann.Pharmacother .34:915-923,2000)。聚合物缀合物的其它益处包括(a)在制造 过程期间改善的产品稳定性；（b)降低的肾清除(Fung等，Polym.Pr邱r. 38:565-566，1997); 改善的肿瘤勒!向（Yowell等，(^incer IYeat .Rev. 28Su卵1 .A: 3-6,2002);降低的抗原性和免 疫原性（Muller 等，Br. J.化 ematol. 110:379-384,2000; AbsMre 等，Blood96:1709-1715, 2000);和更大的可耐受性（Safra 等，Ann.Oncol . 11: 1029-1033,2000;化 dson 等， Eur. J. Cancer 37:870-877,2001KPEG 化已经应用于人生长因子化 im 等，Biomaterials 23 : 2311-2317，2002 ; Wu等，Protein E邱r .Purif. 48 : 24-27，2006)、生长激素释放因子 (Piquet等，J. Qiromatogr. 944:141-148,2002)、腺病毒载体化to等，Int. J.Pharm. 354:3-8,2008)和质粒DNA化osseinldiani等 J.Control Release ,97:157-171,2004)。由于PEG化 的益处，已经开发出许多缀合反应化学（RobertS等.，Adv.Drug Deliv.Rev. 54:459-476, 2002)和聚合物衍生物(欧洲专利No. 1578841)。随着生物分子-聚合物缀合物的应用增加， 有必要开发简单的、可再现的、且可缩放的（scalable)单元操作来满足制造需要。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明设及一种用于生成生物分子缀合物的方法，包括下列步骤:通过与活化剂 接触活化生物分子;除去所述活化剂;并通过将所述生物分子与活化的聚合物起反应缀合 所述生物分子;其中将该方法的步骤整合入单一单元操作中。该方法可W进一步包括分开 所述生物分子缀合物与未缀合的生物分子的步骤。在一个实施方案中，通过大小排阻层析 或离子交换层析分开所述生物分子缀合物与未缀合的生物分子。
[0007] 在一个实施方案中，单一单元操作是集成的切向流过滤系统。在另一个实施方案 中，活化剂选自缓冲液更换、抑调节、或还原剂。在又一个实施方案中，还原剂是二硫苏糖醇 或S2-簇乙基麟（tris 2-ca;rboxyethyl phosphine)。在其它实施方案中，聚合物是聚乙二 醇，且生物分子选自：蛋白质、多糖和核酸。在又一个实施方案中，所述蛋白质选自凝固因 子、抗体、激素、生长因子和酶。
[000引附图简述
[0009]图1:PEG化对照运行的阳离子交换层析洗脱谱(profile)。
[0010] 图2:来自阳G化对照运行的阳离子交换层析洗脱峰的SDS-PAGE。
[0011] 图3:来自PEG化对照的阳离子交换层析洗脱峰的大小排阻层析。
[0012] 图4: WTFF模式实施的阳G化的阳离子交换层析洗脱谱。
[0013] 图5:实验室规模TFF运行的阳离子交换层析洗脱谱。
[0014] 图6:由实验室规模TFF运行生成的PEG化巧VIII的SEC谱。
[0015] 图7:试验(pilot)规模TFF运行的阳离子交换层析洗脱谱。
[0016] 发明详述
[0017] 应当理解，本发明不限于所描述的具体装置或部分，并且因此可W有所变化。还应 当理解，本文中所使用的术语仅为了描述具体的实施方案，而并不意图限制本发明的范围， 其仅由所附权利要求书限制。
[0018] 必须注意到，如本文中和所附权利要求书中所使用的，单数形式"一个"、"一种"和 "该/所述"包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。如此，例如，提及"药剂"指提及一种 或多种药剂(agent),并且包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。除非另有定义，本文 中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的 意义。
[0019] 生物分子的缀合，诸如PEG化可W是随机缀合或位点特异性缀合物。在运两种情况 中，通常活化生物分子W容许聚合物，诸如PEG的有效偶联。在随机PEG化中，PEG可W与随机 活化的氨基酸残基共价缀合。它通常导致单-PEG化的和多-PEG化的生物分子的混合物。对 于位点特异性PEG化，生物分子可W遗传修饰为使得PEG分子可W与生物分子的表面上的特 定位点缀合。此方法使副产物形成最小化，并且减轻分开产物与副产物的随后的纯化步骤 的负担。
[0020] 可W通过调节溶液的抑或者通过使用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或S2-簇乙基 麟(TCEP)活化生物分子上溶剂暴露的残基。还原后，可W经由共价连接将阳G分子附接于活 化的残基。若使用还原剂，则可能有必要在缀合反应前除去还原剂。大小排阻层析(SEC)是 一种用于实验室规模还原剂除去的常见技术。
[0021 ]有效的现有技术生物分子缀合一般要求多单元操作，例如，
[0022] -经由与还原剂一起溫育/受控混合活化，其通常在混合式容器诸如揽拌式活化罐 中实施；
[0023] -除去活化剂，其通常通过大小排阻层析或其它层析法进行；
[0024] -经由与活化的聚合物(诸如PEG) -起溫育/受控混合来缀合，其通常在揽拌式缀 合罐中实施;并
[0025] -通过层析诸如离子交换层析分开缀合的生物分子与未反应的分子和副产物。
[0026] 此类方法需要多个系统和(在商业规模上)相当大的空间和单元操作间手工处理/ 转移。另外，SEC难W在商业规模制造中执行，并且要求设置为独立单元操作。
[0027] 本发明的方法通过利用集成切向流过滤来接触/混合及随后除去反应物将活化、 除去活化剂、和缀合步骤整合入一个单一单元操作中。虽然通过利用合适的分子量截留膜 保留祀生物分子，但是可W在活化/缀合之前、期间、或之后改变物理化学条件诸如浓度、 pH、电导率、和缓冲液种类。系统中水动力学的调节容许调节最佳的浓度，及任选地实现膜 表面上局部更高的接触浓度W进一步优化活化和缀合过程。此方法是操作简单的、可再现 的、可缩放的、且可用于商业规模药物生产。
[0028] 可W在本发明的方法中使用的聚合物的例子包括但不限于聚烧撑氧 (polya化ylene oxide)诸如聚乙二醇、右旋糖巧、多聚乙酷神经氨酸、或其它基于碳水化合 物的聚合物、氨基酸的聚合物、生物素衍生物、聚乙締醇(PVA)、聚簇酸醋、聚乙締化咯烧酬、 聚乙締-马来酸酸酢共聚物、聚苯乙締-苹果酸酸酢共聚物、聚口恶挫嘟、聚丙締酷吗嘟、肝 素、清蛋白、纤维素、壳聚糖的水解产物、糖原、琼脂糖及其衍生物、瓜尔胶、普鲁分支葡聚糖 (pullulan)、菊粉、黄原胶(xanthan gum)、角叉藻聚糖karrageenan)、果胶、褐藻酸水解产 物及其任何等同物。聚乙二醇的例子是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。其它有用的聚烧撑二醇化 合物是聚丙二醇(PPG)、聚下二醇(PBG)、PEG-缩水甘油基酸化POX-PEG)、PEG-氧幾基咪挫 (COl-PEG)、分支的聚乙二醇、线性聚乙二醇、叉状的聚乙二醇和多臂的或超分支的聚乙二 醇（星-阳G)。
[0029] 聚乙二醇（PEG)包括任何水溶性聚（环氧乙烧）。通常，PEG包含下列结构 (OC出C此)一"，其中（n)是2至4000。如本文中所使用的，PEG还包括"--C此C此一0(C此C出0)-C出C出和(OC出C出)0--"，运取决于末端氧是否已经被置换。
[0030] 聚乙二醇还包括具有各种末端或末端加帽基团，诸如但不限于径基或C120烷氧基 基团的结构。聚乙二醇还意指含有大部分，也就是说，大于50%的--0CH2CH2--重复亚单元 的聚合物。就特定形式而言，PEG可W采用众多分子量，W及构建或几何学诸如分支的、线性 的、叉状的、和多功能的。
[0031] 生物分子的例子包括例如任何蛋白质、多糖或核酸。蛋白质包括但不限于凝固因 子、抗体、激素、生长因子和酶。
[0032] 本文中所描述的方法和材料意图是本发明的代表性例子，并且应当理解，本发明 的范围不限于例子的范围。本领域技术人员会认可，本发明可W用公开的方法和材料的变 型实施，并且认为此类变型在本发明的范围内。 实施例
[0033] 为了使本发明可W得到更好的理解，列出W下实施例。运些实施例仅为了例示目 的，而不应W任何方式解释为限制本发明的范围。通过提及而完整收录本文中提及的所有 出版物。
[0034] 实施例1: PEG化
[0035] 在对照中，将S2-簇乙基麟(TCEP)储备溶液