抑制内源性代谢物亚牛磺酸生物合成的试剂在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学领域，具体地，本发明涉及抑制内源性代谢物亚牛磺酸 (hypotaurine)生物合成的试剂在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 脑胶质瘤（glioma)是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，其发病率约占颅内肿 瘤的一半，其中胶质母细胞瘤（glioblastoma)大约占恶性胶质瘤的60-70%。虽然胶质瘤 相对较低的年发病率（〇. 05%。），但致死率极高[1]。恶性胶质瘤的中位数生存期仅15个月 左右B^The Cancer Genome Atlas(TCGA)是国际间的协作组织，旨在通过大规模队列研究 系统揭示肿瘤发生过程中基因组层面的改变。该组织进行的第一项研究就是针对GBMs的 基因拷贝数、表达程度和DNA甲基化异常 [3]。研究发现了一些涉及ERBB2，NF1和TP53等基 因和途径的新的改变。Parsons等人对22例GBMs标本的20661个蛋白编码基因进行了测 序分析，发现了许多基因存在变异，其中最为重要的是异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)的点突变， 这种突变可见于60%以上的II、III级胶质瘤患者 [46]。
[0003] 最近，Xu等人[7]发现，胶质瘤IDH1突变可导致其不能正常催化异柠檬酸生成 α -酮戊二酸（2-KG)，而是大量生成α -羟基戊二酸（2-HG)，后者能与2-KG竞争结合脯 氨酸轻化酶PHD2。PHD2为α -酮戊二酸依赖的双加氧酶（a -Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases，2-KDDs)家族成员之一，其正常生理作用的发挥需要2-KG、氧分子和铁离子 的存在。有氧条件下PHD2可以羟基化缺氧诱导因子-1 a (HIF-1 α )特定位点的脯氨酸残 基，羟基化后的HIF-la可通过泛素-蛋白酶体途径被降解M。2-HG的竞争导致PHD2不 能有效使HIF-la被羟基化和降解，导致后者入核，促进多种与肿瘤细胞增殖有关基因的 表达，因而具有促使胶质瘤发生的作用。不仅如此，2-HG还能竞争性抑制许多其他2-KDDs， 包括组蛋白去甲基化酶、TET家族的5-甲基胞嘧啶羟化酶等，导致细胞组蛋白呈现高甲基 化状态和5-羟甲基胞嘧啶的减少等肿瘤细胞的典型表型特征。上述酶系已被证明在胶质 瘤的发生中具有重要作用，NATURE期刊曾在一期杂志上页码连续地发表3篇文章阐述IDH1 突变及2-HG在肿瘤发生中的作用 [9 11]。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是采用干预一种人体内天然存在的化合物的细胞内含量，达到干预 肿瘤细胞增殖的方法。
[0005] 本发明涉及医学领域，具体地，本发明涉及抑制内源性代谢物一一亚牛磺酸 (hypotaurine)生物合成的试剂在制备用于抑制受试者中肿瘤细胞增殖的药物中的应用。
[0006] 其中所述抑制内源性代谢物亚牛磺酸生物合成的试剂应该包括所有能够抑制内 源性代谢物亚牛磺酸生物合成的试剂，例如抑制酶EC1. 13. 11. 20的抑制剂（例如，DL-高 半胱氨酸、D-半胱氨酸、天冬氨酸、邻二氮杂菲、乙二胺四乙酸等）、抑制酶EC4. 1. 1.29的抑 制剂（例如，磺基丙氨酸、高半胱氨酸、L-半胱亚磺酸、L-天冬氨酸）、抑制酶EC1. 13. 11. 19 的抑制剂（例如，KCN、胱胺、邻二氮杂菲、8-羟基喹啉等）等（www.brenda-enzymes. info)。
[0007] 优选地，所述抑制内源性代谢物亚牛磺酸生物合成的试剂包括，但不限于，高半胱 氨酸或牛磺酸。
[0008] 其中所述受试者为哺乳动物，例如，人、小鼠，优选为人受试者。
[0009] 所述肿瘤细胞为胶质瘤细胞，例如，脑胶质瘤细胞。
[0010] 本发明还涉及通过干预竞争性抑制α -酮戊二酸依赖性双加氧酶 (a -Ketoglutarate-dependent dioxygenases)的内源性代谢物--亚牛横酸 (hypotaurine)的生物合成来抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括：给受试者施用有 效量的能够抑制内源性代谢物亚牛磺酸生物合成的试剂。
[0011] 其中所述能够抑制内源性代谢物亚牛磺酸生物合成的试剂可以选自，但不限于， 高半胱氨酸或牛磺酸。
[0012] 其中所述肿瘤细胞为胶质瘤细胞，例如，脑胶质瘤细胞。
[0013] 本发明人首次发现了通过干预"竞争性抑制α-酮戊二酸依赖性双加氧酶 (a -Ketoglutarate-dependent dioxygenases)的内源性代谢物--亚牛磺酸"生物合成 能够抑制肿瘤细胞生长，并在此基础上完成了本发明。内源性亚牛磺酸生物合成途径也成 为治疗肿瘤的靶标，通过抑制内源性亚牛磺酸的生物合成能够抑制肿瘤细胞的增殖，起到 治疗肿瘤的效果。并且，内源性亚牛磺酸生物合成途径也可以作为筛选新型肿瘤治疗药物 的靶标。
[0014] 综上所述，本发明提供下述技术方案：
[0015] 1.抑制内源性代谢物亚牛磺酸生物合成的试剂在制备用于抑制受试者肿瘤细胞 增殖的药物中的应用。
[0016] 2.根据第1项所述的应用，其中所述抑制内源性代谢物亚牛磺酸生物合成的试剂 为抑制酶EC1. 13. 11. 20的抑制剂、抑制酶EC4. 1. 1. 29的抑制剂或抑制酶EC1. 13. 11. 19的 抑制剂。
[0017] 3.根据第2项所述的应用，其中所述抑制酶EC1. 13. 11. 20的抑制剂选自DL-高半 胱氨酸、D-半胱氨酸、天冬氨酸、邻二氮杂菲或乙二胺四乙酸。
[0018] 4.根据第2项所述的应用，其中所述抑制酶EC4. 1. 1. 29的抑制剂选自磺基丙氨 酸、高半胱氨酸、L-半胱亚磺酸或L-天冬氨酸。 _9] 5.根据第2项所述的应用，其中所述抑制酶EC1. 13. 11. 19的抑制剂选自KCN、胱 胺、邻二氮杂菲或8-羟基喹啉。
[0020] 6.根据第1项所述的应用，其中所述抑制内源性代谢物亚牛磺酸生物合成的试剂 选自高半胱氨酸或牛磺酸。
[0021] 7.根据第1项所述的应用，其中所述受试者为哺乳动物。
[0022] 8.根据第7项所述的应用，其中所述受试者为人或小鼠。
[0023] 9.根据第1项所述的应用，其中所述肿瘤细胞为胶质瘤细胞。
[0024] 10.根据第9项所述的应用，其中所述胶质瘤细胞为脑胶质瘤细胞。
[0025] 11. -种抑制哺乳动物受试者中肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括给所述受试 者施用有效量的能够抑制内源性代谢物亚牛磺酸生物合成的试剂。
[0026] 12.根据第11项所述的方法，其中所述抑制内源性代谢物亚牛磺酸生物合成的试 剂为抑制酶EC1. 13. 11. 20的抑制剂、抑制酶EC4. 1. 1. 29的抑制剂或抑制酶EC1. 13. 11. 19 的抑制剂。
[0027] 13.根据第12项所述的方法，其中所述抑制酶EC1. 13. 11. 20的抑制剂选自DL-高 半胱氨酸、D-半胱氨酸、天冬氨酸、邻二氮杂菲或乙二胺四乙酸。
[0028] 14.根据第12项所述的方法，其中所述抑制酶EC4. 1. 1. 29的抑制剂选自磺基丙氨 酸、高半胱氨酸、L-半胱亚磺酸或L-天冬氨酸。
[0029] 15.根据第12项所述的方法，其中所述抑制酶EC1. 13. 11. 19的抑制剂选自KCN、 胱胺、邻二氮杂菲或8-羟基喹啉。
[0030] 16.根据第1项所述的方法，其中所述抑制内源性代谢物亚牛磺酸生物合成的试 剂选自高半胱氨酸或牛磺酸。
[0031] 17.根据第11项所述的方法，其中所述哺乳动物受试者为人或小鼠。
[0032] 18.根据第11项所述的应用，其中所述肿瘤细胞为胶质瘤细胞。
[0033] 19.根据第18项所述的应用，其中所述胶质瘤细胞为脑胶质瘤细胞。
【附图说明】
[0034] 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
[0035] 图1显示细胞内亚牛磺酸合成途径示意图（斜体字代表相应酶抑制剂）。HCA : homocysteic acid(高半脫氨酸）。
[0036] 图2显示在培养基中添加不同浓度高半胱氨酸对U251生长的抑制作用。实验数 据表明，培养基中添加不同浓度高半胱氨酸对U251生长的抑制源于降低细胞内亚牛磺酸 含量（均值土s.d.，n = 8,下同）。细胞量（cell mass)以WST-1染色后0D45。表示。细胞 内亚牛磺酸（hypotaurine)和牛磺酸（taurine)浓度以μg/ml/(g细胞干重）表示。
[0037] 图3显示在培养基中添加不同浓度的半胱胺（cysteamine)对U251的增殖促进作 用。实验数据表明，半胱胺对U251的增殖促进作用也源于升高细胞内亚牛磺酸含量。
[0038] 图4显示在培养基外加牛磺酸后U251细胞的细胞量（以WST-1染色后0D45。表 示）、细胞内亚牛磺酸和牛磺酸的浓度（以yg/mV(g细胞干重）表示）。实验数据表明， 在培养基中外加牛磺酸可降低细胞内亚牛磺酸量，抑制U251增殖。说明外源牛磺酸的摄入 可抑制内源牛磺酸经由亚牛磺酸合成，表现为反馈抑制。
[0039] 图5显示将各种化合物添加到U251细胞培养基后细胞蛋白提取物的Western Blot结果。实验数据表明，细胞内高浓度亚牛磺酸含量对提高U251细胞内HIF-la的含量 有促进作用。试验中牛磺酸、HCA和半胱胺培养基中添加量分别为45 μ M，250 μ Μ和200 μ M。
[0040] 图6显示分子模拟预测显示亚牛磺酸，2-KG与2-HG与PHD2能竞争结合同一位点。
[0041] 图7显示U251免疫细胞化学染色结果。细胞分别给予生理盐水（A)，半胱胺（B)， HCA(C)和牛磺酸（D)刺激，应用浓度与图5的实验浓度相同。可见升高细胞内亚牛磺酸量 使细胞内HIF-la量增加（图7B)，而且HIF-la有向核内分布倾向。降低细胞内亚牛磺酸 含量使HIF-1 a量减少，而且倾向于胞浆内分布（图7C，D)。
[0042] 图8显示荷瘤（U251)裸鼠肿瘤大小变化。Control表示生理盐水饮水对照组 (-*-)，taurine为1%牛磺酸饮水组 s A图显示雄性荷瘤（U251)裸鼠肿瘤大小变化， B图显示雄性荷瘤（U251)裸鼠肿瘤大小变化。
【具体实施方式】
[0043] 下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发 明并不限于这些具体的实施例。
[0044] 实施例1.高半胱氨酸抑制细胞内亚牛磺酸的生物合成，进而抑制肿瘤细胞增殖
[0045] 人体内亚牛磺酸的合成途径见图1。
[0046] 利用U251细胞系（购自凯基生物，目录号为KG050,为人源胶质瘤细胞）在含10% FBS (购自杭州四季青和哈尔滨赛拓公司）的DMEM高糖培养基（购自HYCL0NE公司）中， 37°C，5%二氧化碳环境中培养。培养基中添加250-500 μΜ的高半胱氨酸（HCA)(购自上海 SIGMA)。HCA能够抑制细胞内亚牛磺酸的合成。24小时后，利用WST-1 (北京ROCHE)染色 法检测细胞量即可发现，细胞的增殖受到抑制（图2)。该种增殖抑制伴随着细胞内亚牛磺 酸量的减少。
[0047] 图2中可见随着培养基中的HCA添加量不断增加，细胞增殖的数量在不断减少，具 有统计学差异。这种细胞数目的变化与细胞内亚牛磺酸的含量呈一致性的变化趋势，具有 统计学差异。其中HCA加入量在0-250 μ Μ之间时，由于其抑制了细胞内亚牛磺酸合成，因 此也导致没有足够的亚牛磺酸可供合成牛磺酸，因此牛磺酸浓度也随之降低。但是当加入 HCA到500 μ Μ时，这种影响与加入250 μ Μ几乎相当。这说明细胞内牛磺酸浓度不仅受亚牛 磺酸浓度影响，可能还有其他诸如分泌机制等