恢复lox和nrage蛋白质正常共同表达和相互作用的物质的制作方法

恢复lox和nrage蛋白质正常共同表达和相互作用的物质的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种物质在恢复蛋白质LOX和NRAGE的正常共同表达和相互作用中的用途。具体而言，本发明涉及有效量的至少一种调节具有SEQ ID No.1序列的LOX表达和/或活性和/或调节具有SEQ ID No.2序列的NRAGE表达和/或活性的物质在制备用于调节LOX和NRAGE蛋白质之间的相互作用从而特别是在LOX和NRAGE之间的相互作用发生缺失或改变的情况下调节细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡的组合物中的用途。本发明特别是能够用于预防或治疗皮肤老化、扁平癣、移植物抗宿主疾病、湿疹、牛皮癣、癌症，特别是基底细胞型癌和棘细胞型上皮癌，特别是皮肤上皮癌。
【专利说明】恢复LOX和NRAGE蛋白质正常共同表达和相互作用的物质
[00011本申请是申请日为2006年10月26日、发明名称为"恢复LOX和NRAGE蛋白质正常共 同表达和相互作用的物质"的中国专利申请200680049264 . X(国际申请号PCT/FR2006/ 051117)的分案申请。
[0002] 本发明涉及一种物质在恢复LOX和NRAGE蛋白质正常共同表达和相互作用中的用 途。
【背景技术】
[0003] 1)概述
[0004] 在多细胞生物中，体内平衡是通过细胞增殖、细胞分化和细胞程序性死亡或非程 序性死亡来维持的。
[0005] 以皮肤为例，人们认为它是一个具有保护生物不受外界侵害的特殊功能器官。皮 肤对外界的防护作用通过一层高度角质化的死细胞所构成的角质层得以保障。因此，通过 导致细胞角质化和死亡的这种分化作用的连续进行赋予了表皮细胞（角质细胞)生命的节 律：（1)维持最初的细胞(表皮基底层的干细胞）；（2)不对称分裂(每个干细胞分裂为两个子 细胞）；（3)分化（由子细胞形成表皮基底层上层），（4)获得对凋亡型细胞死亡的抗性；（5)发 育成为角化细胞，以及(6)表皮上层细胞的程序性死亡。该平衡的任何改变都有可能是病理 性的改变。
[0006] 本领域技术人员已经获知了许多生物分子及其作用机理，使得人们能够理解细胞 增殖、细胞分化和细胞凋亡这些现象的某些方面。尽管如此，却没有任何关于将这三种生物 现象联系起来的机制的实质信息，而这三种生物现象也构成了人们要调节和控制的靶点。
[0007] 2)L0X(蛋白质)
[0008] LOX是赖氨酸氧化酶(LO)家族中的一员，它是一种铜依赖性的氨基氧化酶。到目前 为止，人们已经鉴定了该家族中的5个成员：LOX、LOXL、L0XL2、L0XL3和L0XL4。已知LOX在体 内和体外胶原的交联中起作用，而LOXL很明显与弹性纤维的体内平稳有关。其他同种型的 体内功能还不清楚。
[0009] 赖氨酸氧化酶可由各种细胞合成，如成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和角质细 胞。因此，这些酶可以存在于多种组织中，例如皮肤、肝、肾、脾和动脉，并且在细胞内和细胞 外均存在一定的浓度。
[0010] 2.1) LOX在细胞外基质中的稳定作用一在细胞外作用
[0011]已经知道，LOX在细胞外所起的作用在于稳定结缔组织中的细胞外基质(MEC)，事 实上，LOX具有使胶原纤维和弹性硬蛋白形成网状结构的功能。为此，它催化前胶原纤维分 子和原弹性蛋白质分子的赖氨酸残基和羟基赖氨酸残基进行氧化脱氨基作用，该反应伴随 着氢氧化铵和过氧化氢的释放。形成的醛残基与相邻的醛和胺官能度通过分子内键和分子 间键发生自发缩合。这种缩合源于胶原纤维和弹性硬蛋白纤维之间的连结。对LOX和LO家族 的生物医学功能进行了研究，发现它们与MEC的进化(老化、纤维化、癌症、愈合、骨关节和心 血管疾病、血管生成)有关。
[0012] 已经在体外试验中证实，有机腈是LOX的不可逆抑制剂。β-氨基丙腈(β-ΑΝΡ)可以 与底物烷基胺竞争性的与LOX的活性部位相结合。LOs以β-ΑΝΡ作为底物，形成席夫碱但是并 不释放产物乙醛，这以共价方式阻断了活性部位，但是对合成反应没有影响。基于此，发明 人发现了各种赖氨酸氧化酶抑制剂即β-ΑΝΡ在用于防止某些类型的细胞(如软骨细胞)进行 去分化作用的用途，这种去分化作用可以在细胞培养过程中系统性产生(Farjanel等，法国 专利申请〇1.10443，CNRS，赖氨酸氧化酶抑制剂在细胞培养和组织工程中的用途，于2001年 8月3日提交，公布号：2828206).但是，在该申请中，仅是笼统地提及赖氨酸氧化酶，而没有 涉及具体的LOX同种型；此外，虽然述及它能够特异性地抑制体外培养的细胞的去分化作 用，但是没有提供任何关于赖氨酸氧化酶在维持细胞增殖，分化和凋亡的平衡中的作用的 信息，就更不用说LOX了，更没有提供关于赖氨酸氧化酶的新配偶体或底物的信息，就更不 用说LOX 了。
[0013] 2.2)细胞内的作用
[0014] 总的来讲，人们对LOX以及LOs在细胞内的作用了解的还不是很多，但人们公知的 是，LOX参与了细胞发育、分化、迀移和衰亡的调节(Cs i zar，赖氨酸氧化酶:新的多功能胺氧 化酶家族，核酸研究和分子生物学(Nucleic Acid research and Moiecular Biology), 2001，70:2-28)，尽管如此，人们对它们的分子生物学机制现在还不是很清楚。
[0015] 2.2.1) LOX和细胞稳态
[0016] LOX可能参与了细胞稳态（维持细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡）的调 节是人们通常所接受的观点（Jeay等，赖氨酸氧化酶通过阻止NF-KB的活化来抑制Ras介导 的转化，Mol.Cell.Biol. ,2003,23:2251-2263)，然而对于它们的作用机制本领域技术人员 尚不得而知。
[0017]因此，一方面，本领域技术人员目前已有资料表明LOX与分化之间可能存在联系， 另一方面，LOX与细胞的增殖和转化之间有关系，但是，现有技术均未提及LOX可能和细胞凋 亡有关系。
[0018] 2.2.2) LOX和表皮分化
[0019]已经发现LOX存在于表皮组织中，并且根据角质细胞分化的水平调节其表达 (Noblesse等，赖氨酸氧化酶和赖氨酸氧化酶样物质存在于真皮和表皮的相当皮肤和人皮 肤中并与弹性纤维有关(Lysyl oxydase like and lysyl oxydase are present in the dermis and epidermis of a skin equivalent and in human skin and are associated to elastic fibers)，J.Invest.Dermatol. ,2004,122621-630)。然而，迄今为 止的研究都没有能明确LOX在角质细胞中的作用，也没能在细胞中发现其配偶体，没有发现 (或是含量很少)胶原和弹性硬蛋白。
[0020] 2.2.3) LOX与细胞转化
[0021] 显而易见，LOX基因与维持非肿瘤细胞的表型有关。
[0022]为了解释LOX的作用，人们提出了两个假设。第一个假设认为，MEC的网状形成诱导 产生了有利于维持细胞非肿瘤状态的三维环境。该假设得到这样一个事实的支持：当发生 癌症时，LOX和LOXL不再进行表达，尽管它们也存在于原位癌中（Peyrol等，赖氨酸氧化酶在 原位和侵入性导管乳腺癌的基质反应中的基因表达(Lysyl oxidase gSne expression in the stromal reaction to in situ and invasive ductal breast carcinoma)，Am J Pathol.Feb; 150(2) :497-5071997)。另一个假设是关于LOs在细胞内对底物的作用，本领域 技术人员还在对这些底物进行研究（Li等，赖氨酸氧化酶在纤维细胞核中的定位和活性 (Localization and activity of lysyl oxidase within nuclei of fibrogenic cells),Proc Natl Acad Sci USA.,1997Nov 25；94(24)；12817-22.)〇
[0023] LOX酶似乎是ras致癌基因的抑制剂，该基因中体细胞基因突变与各种癌症有关 (Contente等，rrg基因的表达与LTR-c-H-ras转化的NIH 3T3的恢复突变有关(Expression of gene rrg is associated with reversion of NIH3T3transformed by LTR-c-H-ras) ,Science，1990,249:796-798;Csiszar等，结直肠肿瘤5q23.1染色体上的赖氨酸氧化 酶基因的体细胞突变（Somatic mutations of the lysyl oxidase ggne on chromosome 5q23 · Iin colorectal tumors)，Int · J.Cancer，2002,97:636-642)。最新的研究表明，LOX 在ras转化的成纤维细胞中的低水平表达是由于自分泌生长因子FGF-2的活性所致，抗肿瘤 药苏拉明能够再诱导LOX酶的表达(Palamakumbura等，自分泌生长因子对赖氨酸氧化酶在 转化的成纤维细胞中表达的调节（Autocrine growth factor regulation of Iysyl oxidase expression in transformed fibroblasts),J Biol Chem.,2003,Aug 15；278 (33):30781-7;Epub 2003Jun4)。另一方面，有实验证明，LOX在成纤维细胞中的再表达能够 抑制它们在软琼脂中的生长，通过调节AKT蛋白质的定位而作用于NF-kB信号通路(Jeay等， 赖氨酸氧化酶通过阻止NF-B的活化从而抑制Ras介导的转化（Lysyl oxydase inhibits Ras-mediated transformation by preventing activation of NF-B),Mol.Cell.Biol., 23:2251-2263,2003).
[0024] 类似于其它的肿瘤抑制剂，LOX的作用可能是基于对底物和细胞配偶体的调节来 实现的，但本领域技术人员对此尚不得而知。
[0025] 2.2.4)细胞凋亡
[0026] 术语"细胞凋亡"用来描述细胞死亡的一种特殊形式，该种细胞与坏死细胞具有不 同的病理特征。
[0027] 细胞凋亡是一个需要获得胱天蛋白酶的细胞程序性死亡过程。在该过程中，细胞 获得了特别显著的病理特征，例如染色质的凝聚和核的断裂，导致细胞的自动销毁和从组 织中的清除，而同时不损害相邻细胞。
[0028] 细胞凋亡相应于细胞发育或稳态过程中的细胞自然死亡。
[0029] 现有技术的信息表明，多种物质和作用机制通过调节细胞凋亡和分化过程参与调 节了细胞周期。
[0030] 3)NRAGE(蛋白质)
[0031] 具体而言，人们已知，是一个蛋白质家族参与了细胞周期、细胞分化和细胞凋亡的 调节。已知该家族为MAGE(黑素瘤相关抗原)蛋白质家族，蛋白质NRAGE(也被称名为"与神经 营养蛋白受体相互作用的MAGE同源物（neurotrophin-receptor-interacting MAGE homolog)"）为该家族中的一员，该蛋白质由于其通过神经营养因子NGF的促细胞凋亡作用 而为人们所知。
[0032] 蛋白质NRAGE含有778个氨基酸，它在中心区域具有MAGE蛋白质的第一特征结构 域:MAGE同源结构域(MHD-1)，并且在N-末端区域具有第二结构域:MHD-2，该结构域仅存在 于某些同种型中。这两个结构域中都富含赖氨酸残基。在这两个结构域之间，存在一个被称 为IRD(散在重复结构域（Interpersed Repeat Domain))的区域，迄今为止还没有发现该区 域存在于任何其他已知的蛋白质中。
[0033] 蛋白质NRAGE对细胞凋亡的调控是通过下列不同的途径来完成的：
[0034] ?通过与p75NTR(嗜中性粒细胞因子(facteurs neutrophiles) (NGF)或TNF的低 亲和受体)相互作用，NRAGE能阻断细胞周期的进行，因此通过胱天蛋白酶途径促细胞凋亡。 [0035] · NRAGE还通过与IAP凋亡蛋白质的细胞质抑制剂相互作用而起到促细胞凋亡的 作用。
[0036] · NRAGE还能直接对核同源因子的活性产生作用，例如参与组织成形基因调节的 Msx和Dlx因子。
[0037] 虽然NRAGE的表达是很广泛的，但是现有技术均未能获知其在皮肤中存在的状态。
[0038] 而且，现有技术也没有描述LOX和细胞凋亡之间的联系，更没有描述LOX和NRAGE之 间的关联性。
[0039] 4)现有技术总结
[0040] 现有技术没有提供新的LOX配偶体或底物的鉴定方法，尤其是参与细胞增殖、细胞 分化和细胞凋亡之间平衡维持的那些，现有技术也没有提供上皮细胞(特别是角质细胞）中 的新配偶体和底物的鉴定方法，同样也没有提供任何细胞类型的相关信息。
[0041] 现有技术没有给出关于LOX可能由于老化、存在或不存在暴露于UV或其它类型的 侵害作用或影响皮肤的疾病(银肩病、移植物抗宿主疾病、癌症等)等因素的影响而发生在 表皮细胞中的表达(尤其是在角质细胞中的表达)改变的信息。
[0042] 现有技术也没有述及LOX与细胞凋亡有关。
[0043] 现有技术没有给出NRAGE是否在皮肤中存在的信息，包括健康皮肤、因老化或受到 紫外线照射发生改变的皮肤、遭受其它侵害的皮肤或发生疾病的皮肤。
[0044] 现有技术没有建立用于研究上皮细胞和表皮细胞中的NRAGE的模型。
[0045] 现有技术没有给出任何关于LOX和NRAGE之间相互作用的信息。
[0046] 现有技术没有提供可以用于鉴别能够调节LOX和/或NRAGE在角质细胞中表达的活 性成分的模型。
[0047] 另一方面，目前在欧洲，因为某些应用和人类试验遭受到伦理学的非议，所以动物 试验被禁止。人们不能接受发明人使用动物或人来实施筛选方法。
[0048] 在MIMESKIN?(Coletica，，法国）的三维模型中，LOX在表皮中表达，根据角 质细胞分化水平的不同，调节其表达(Noblesse等，2004)。在研究的过程中，没有发现NRAGE 的表达，也没有发现LOX与细胞凋亡之间存在可能的联系。因此，显而易见，对于所述技术领 域的技术人员而言，还没有一个能够用于调节LOX和/或NRAGE表达的方法，从而当细胞稳态 受到影响(年龄、压力、疾病)时，可以通过增殖、分化和细胞凋亡之间的平衡加以调节，这提 出了一个新技术问题。
[0049] 现有技术中没有提供能够调节LOX的细胞内配偶体(例如NRAGE)的表达的活性成 分，同时对目的在于细胞调节的LOX表达进行调节或者不调节。就此而言，很难获得对这些 活性成分的影响进行评价的客观标准。
[0050] 发明目的
[0051] 本发明的主要目的是为了解决以上所提到的技术问题，尤其是要解决提供一种在 LOX蛋白质和NRAGE蛋白质之间的相互作用发生缺失和改变的情况下，鉴别能够改善所述相 互作用的活性成分的方法的技术问题。
[0052]具体而言，本发明的目的在于调节细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的细胞平 衡，该平衡由于下列因素而受到干扰，如因为年龄、UV或受到其它因素的侵害导致皮肤发生 改变，和/或疾病状态，如银肩病、湿疹、移植物抗宿主疾病、扁平癣和/或癌症。
[0053] 本发明还涉及活性成分在调节LOX和/或NRAGE表达从而调节细胞增殖、细胞分化 和细胞凋亡之间的细胞平衡中的用途，特别是在该平衡由于下列因素而受到干扰的情况 下，如因为年龄或UV的影响或是其它一些有害因素的侵害导致皮肤发生改变，和/或是疾病 状态，如银肩病、湿疹、移植物抗宿主疾病、扁平癣和/或癌症。更具体而言，本发明还涉及在 LOX和NRAGE蛋白质之间的相互作用发生缺失或改变的情况下用于改善LOX和NRAGE蛋白质 之间相互作用的活性成分。
[0054] 本发明解决了下列技术问题:提供了确定和监测NRAGE表达的方法，特别是在皮肤 细胞模型中。本发明还解决了下列技术问题:提供了诊断与LOX和NRAGE之间的相互作用的 调节发生异常有关的疾病的方法。
[0055] 发明描述
[0056] 总体上而言，本发明中使用的术语具有下列定义：
[0057] L0X:赖氨酸氧化酶LOX的人类蛋白质同种型，特别是SEQ ID No. 1氨基酸序列定义 的同种型；
[0058] NRAGE:NRAGE人类蛋白质，特别是SEQ ID No.2氨基酸序列所定义的NRAGE人类蛋 白质；
[0059] LOX表达的调节:编码LOX的基因的调节，尤其是对编码LOX的信使RNA表达的调节， 但同时也包括对从信使RNA到LOX合成的调节，从而对LOX的活性进行调节；
[0060] NRAGE表达的调节：编码NRAGE的基因的调节，尤其是对编码NRAGE的信使RNA表达 的调节，但同时也包括对从信使RNA到NRAGE合成的调节，从而对NRAGE的生物作用进行调 -K- To
[0061] 这些调节在细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡受到干扰的情况下应该能 够重新诱导该平衡。
[0062] 优选在下列情况下认为活性成分对LOX有效:相对于对照模型(通常情况下不与活 性成分接触），在与活性成分接触后，在包括至少一种具有LOX表达和/或LOX活性的细胞类 型模型中，LOX的mRNA表达差别约为± 50 %和/或LOX的表达和/或LOX的活性差别约为土 15%〇
[0063] 优选在下列情况下认为活性成分对NRAGE有效:相对于对照模型(通常情况下不与 活性成分接触），在与活性成分接触后，在包括至少一种具有NRAGE表达和/或NRAGE活性的 细胞类型模型中，NRAGE的mRNA表达差别约为± 50 %和/或NRAGE的表达和/或NRAGE的生物 学作用差别约为±15%。
[0064]在第一个方面，本发明涉及有效量的至少一种物质在调节至少一种具有SEQ ID No. 1序列的LOX蛋白质的表达和/或活性和/或调节至少一种具有SEQ ID No.2序列的NRAGE 蛋白质的表达和/或活性的用途，用于生产调节LOX和NRAGE之间的相互作用的组合物，从而 用于调节细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡，特别是在这些现象受到干扰的情况 下，特别是在LOX和NRAGE之间的相互作用发生缺失和改变的情况下。
[0065]本发明涉及有效量的至少一种物质在调节至少一种具有SEQ ID No. 1序列的LOX 蛋白质的表达和/或活性和/或调节至少一种具有SEQ ID No. 2序列的NRAGE蛋白质的表达 和/或活性的用途，用于生产改善LOX和NRAGE之间的相互作用的组合物，特别是在LOX和 NRAGE之间的相互作用发生缺失和改变的情况下。
[0066]本发明还涉及有效量的至少一种物质在调节至少一种具有SEQ ID No. 2序列的 NRAGE蛋白质的表达和/或活性并任选调节具有SEQ ID No. 1序列的LOX蛋白质的表达和/或 活性的用途，用于生产预防或治疗至少一种状态的组合物，在该状态中，细胞增殖、细胞分 化和细胞凋亡之间的平衡缺失或者发生改变。
[0067]优选，调节LOX和/或NRAGE在上皮细胞、特别是在角质细胞中的表达。
[0068]优选，所述物质用于调节LOX蛋白质和NRAGE蛋白质之间的相互作用，所述相互作 用特别是发生在NRAGE的IRD区域。
[0069] 优选，LOX和NRAGE的相互作用是包括通过LOX操控的酶催化而导致的NRAGE的聚 合，特别是二聚。
[0070] 优选，由于LOX的催化活性，LOX和NRAGE之间的相互作用使得产生H2O 2，而H2O2又可 以激活其他的分子，例如中性鞘磷脂酶或NF-kB。
[0071] 优选，LOX和NRAGE之间的相互作用干扰LOX的非酶活性，特别是通过LOX的无功能 性原区域(pror6gion)(A22-D169)发挥的活性。
[0072] 优选，所述物质用于治疗和/或预防选自下列的疾病:细胞暴露于应激状态时，特 别是细胞暴露于热、细胞暴露于辐射(特别是太阳辐射）、细胞暴露于毒性物质(例如化学毒 性物质或微生物毒性物质）、皮肤老化、扁平癣、移植物抗宿主疾病、湿疹、牛皮癣、癌症(特 别是上皮细胞癌）。
[0073] 优选，所述物质在细胞过度增殖的情况下用于减少细胞增殖，特别是癌症(特别是 基底细胞型或刺细胞型上皮细胞癌，特别是皮肤上皮细胞癌）、牛皮癣、湿疹。
[0074] 优选，所述物质在细胞凋亡过多的情况下用于减少表皮的细胞凋亡，特别是在皮 肤发生老化的过程中、皮肤暴露于应急状态时，特别是暴露于热、暴露于辐射(特别是太阳 辐射）、暴露于毒性物质(例如化学毒性物质或微生物毒性物质)或移植物抗宿主疾病。
[0075] 优选，所述物质在表皮细胞增殖过少的情况下用于促进细胞增殖，特别是在皮肤 发生老化的过程中、皮肤暴露于热、皮肤暴露于辐射(特别是太阳辐射)或移植物抗宿主疾 病。
[0076] 优选，所述物质在下列情况下用于刺激LOX的表达并任选抑制NRAGE的表达:在皮 肤发生老化的过程中、皮肤暴露于应急状态时，特别是暴露于热或暴露于辐射(特别是太阳 辐射）、暴露于毒性物质(例如化学毒性物质或微生物毒性物质)或移植物抗宿主疾病。 [0077]优选，所述物质用于刺激表皮NRAGE的表达和/或活性并任选抑制LOX的表达和/或 活性，从而用于预防或治疗牛皮癣或湿疹。
[0078] 优选所述物质用于刺激LOX和NRAGE的表达，从而用于预防或治疗癌症，特别是基 底细胞型或刺细胞型上皮细胞癌，或扁平癣。
[0079] 优选，所述组合物为化妆用组合物、营养组合物（composition neutraceutique)、 皮肤药用组合物或药用组合物。
[0080] 优选，所述细胞平衡为角质细胞增殖和细胞分化之间的平衡，细胞凋亡为角质细 胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡。
[0081] 优选，在为植物(优选根、茎、皮层、花、果实、种子、胚芽、树胶、渗出物、叶子或整个 植物)或者为蛋白质的情况下，用于制备活性成分的原料经辐射或者不经辐射消毒，例如用 β或γ射线以优选5kGy的剂量照射，如果需要，随后研成磨末，例如在室温下研碎。接着，将 得到的粉以2 - 5% (重量/重量）、优选5% (重量/重量)分散于极性溶剂中，例如水、醇、二醇 (如丁二醇)或多元醇，和/或极性溶剂混合物中，优选水/(醇、二醇或多醇)混合物，所述醇 如乙醇、丙三醇、丁二醇和其他二醇、木糖醇等，可以对混合物的比例进行调整，优选水/ 丁 二醇之比为75/25 - 50/50的混合物，也可以采用非极性溶剂，例如链烷烃，或者采用非极性 溶剂混合物，或者采用极性溶剂和非极性溶剂的混合物。优选，在搅拌(例如磁力搅拌)2小 时和对溶剂任选加热后，优选通过倾析或离心使样品澄清，随后优选通过〇. 45μπι或0.22μπι 的滤膜过滤。
[0082] 优选，在为特征分子(例如通过合成或半合成获得的分子、通过纯化获得的生物分 子）的情况下，所述用于制备活性成分的原料用溶剂进行稀释，优选用水或二甲基亚砜(浓 度优选为I(T 6M - I(T2M，优选为KT4M数量级，或者基于所述分子的重量计，范围在1 % (重量/ 重量）一5% (重量/重量)之间）。随后任选过滤得到的溶液，优选通过0.45μηι或0.22μηι的滤 膜过滤。
[0083]优选，根据上述方法获得的活性成分的终浓度范围优选在0.01%体积/体积（ν/ V) - 10 %体积/体积(v/v)之间，更优选在0.1 %体积/体积(v/v) - 1 %体积/体积(v/v)之 间。
[0084] 优选，所述物质选自植物或者植物的提取物：大豆、麻黄（草麻黄（Ephedra sinica))、啤酒花（Humulus Lupulus) (Humulus Lupulus)、肉桂（棒属（Cinnamomum spp))、 白色阜角草（Saponaire blanche)(石头花属(Gypsophila ssp))、红色檀香(Pterocarpus santalinus)提取物、泻根(Bryonia dioica)、小枸骨叶冬青(Petit Houx)(假叶树(Ruscus aculeatus))、梓檬（Citrus limonia)、Mandarine(橘子（Citrus reticulata))、反式-3-己 稀酸乙酯、Khella(阿密茴(Amni Visnaga))、藻酸、胡萝KDaucus Carota)、2_甲基丁酸甲 酯（le Methyl 2methyl butyrate)、中国八角茴香（Badianier de chine)(八角茴香 (Illicium verum))、柏（地中海柏木（Cupressus sempervirens))、树胶（une gomme Asae Foetida)、木糖醇、黑刺李树（PrunelIier)(黑刺李（Prunus spinosa))、欧洲草莓树 (Arbousier)(草莓树（Arbutus unedo))、鹿蹄草（PyroIe)(伞形喜冬草（Chimaphi Ia umbel lata))、香车叶草(Asperule odorante) (Asperula odorata)、艾蒿（Armoi se)(北艾 (Artemisia vulgaris))、接骨木（Sureau)(西洋接骨木（Sambucus nigra))、中国白菜 (Brassica Brassica campestris var .Pekinensis)、苏里南苦木（Quassia de Surinam) (Cassia amara)、可可树（Cacoyer)(可可（Theobroma cacao))、糖丝（Serica)、红色康契 (Salsepareille rouge) (Smilax ornata)、酉昔栗(Groseille)(红酉昔栗(Ribes rubrum))、维 菊（Pyrethre)(南欧派利吞草（Anacyclus pyrethrum))、茴香（Fenouil) (Foeniculum) 〇
[0085] 在第二方面，本发明涉及鉴定至少一种上述的活性成分的方法，特别是用于调节 LOX和NRAGE之间的相互作用并因此用于预防或治疗至少一种病症的活性成分，在上述病症 中，细胞增殖，分化和凋亡之间的平衡发生缺失或改变，其特征在于：
[0086] -使所述活性成分与至少一种能够表达LOX蛋白质（SEQ ID No. 1)和/或NRAGE蛋白 质（SEQ ID No 2)的活细胞接触，并且
[0087] -分析LOX和/或NRAGE的表达，
[0088] 尤其是用于鉴定调节LOX和/或NRAGE的表达和/或活性从而改善细胞增殖、细胞分 化和细胞凋亡之间的细胞平衡的活性成分的方法。
[0089]本发明还涉及在LOX和NRAGE之间的相互作用发生缺失或改变的情况下，鉴定至少 一种调节LOX和NRAGE之间的相互作用从而用于改善LOX和NRAGE蛋白质之间的相互作用的 活性成分的方法，其特征在于：
[0090] -使所述活性成分与至少一种能够表达LOX蛋白质（SEQ ID No. 1)和/或NRAGE蛋白 质（SEQ ID No 2)的活细胞接触，并且
[0091] -分析LOX和/或NRAGE的表达，
[0092]尤其是用于在LOX和NRAGE之间的相互作用发生缺失或改变的情况下，鉴定调节 LOX和/或NRAGE的表达和/或活性从而改善LOX和NRAGE蛋白质之间的相互作用的活性成分 的方法。
[0093] 优选，在与所述活性成分接触前，细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡（其 中活细胞能够表达LOX和/或NRAGE蛋白质）或者LOX和NRAGE蛋白质之间的相互作用发生了 缺失或改变。
[0094] 优选，所述活细胞是上皮细胞，特别是角质细胞。
[0095] 优选，所述方法包括分析LOX和/或NRAGE的信使RNA的表达。
[0096] 优选，所述方法包括使用一定量的RT-PCR，特别是使用如下的引物：
[0097] 一对于LOX基因：
[0098] 正向引物ACGTACGTGCAGAAGATGTCC
[0099] 反向引物GGCTGGGTAAGAAATCTGATG
[0100] 一对于NRAGE基因：
[0101 ]正向引物TGCACAGACATCAGCAGATGG
[0102]反向引物TTCACGGATGATATCTCTCAGC。
[0103]优选，所述方法包括分析信使RNA表达的动力学，例如采用定量RT-PCR技术。
[0104]本发明还涉及对患者进行化妆或治疗的方法，在所述患者中，至少一种细胞类型 的细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡受到干扰，该方法包括通过施用一种调节LOX 和/或NRAGE表达的物质来改善LOX和NRAGE之间的相互作用。
[01 05] 本发明还涉及对患者进行化妆或治疗的方法，在所述患者中，LOX和NRAGE之间的 相互作用发生了缺失或改变，该方法包括使用或施用一种调节具有Seq. ID No. 1的LOX的表 达和/或活性的物质和/或者调节具有Seq. ID No. 2的NRAGE的表达和/或活性的物质。
[0106] 本发明还涉及对具有下列病症的患者进行化妆或治疗的方法，在所述病症中，细 胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡发生了缺失或改变，该方法包括使用或施用一种 调节NRAGE的表达和/或活性并任选调节LOX的表达和/或活性的物质。
[0107] 在第三方面，本发明涉及制备组合物的方法，该方法包括
[0108] -使用一种前面所述的鉴定方法鉴定调节LOX和/或NRAGE表达和/或活性从而用 于改善细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡的活性成分;并且
[0109] 一使所述活性成分与至少一种用于化妆组合物、营养组合物、皮肤药用组合物或 药用组合物的赋形剂混合，所述组合物用于预防或治疗至少一种病症，在所述病症中，细胞 增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡发生了缺失或改变。
[0110] 本发明还涉及制备组合物的方法，该方法包括：
[0111] 一使用一种上述的鉴定方法来鉴定调节LOX和/或NRAGE表达和/或活性从而用于 改善LOX和NRAGE蛋白质之间的相互作用的活性成分;并且
[0112] -使所述活性成分与至少一种用于化妆组合物、营养组合物、皮肤药用组合物或 药用组合物的赋形剂混合，所述组合物用于在LOX和NRAGE之间的相互作用发生了缺失或改 变的情况下改善LOX和NRAGE蛋白质之间的相互作用。
[0113] 在第四个方面，本发明涉及对NRAGE定位的方法，该方法包括使用至少一种抗 NRAGE的抗体用于检测和定位存在的NRAGE，尤其是在包括至少一种角质细胞的重建模型或 皮肤切片中，优选被证明具有细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡发生了缺失或改 变的病症的人皮肤的切片。
[0114] 在第五方面，本发明涉及用于制备组合物的抗NRAGE抗体，所述组合物用于检测细 胞中的NRAGE表达被调节的情况，特别是在上皮细胞中，优选角质细胞。
[0115] 优选，该组合物用于检测病症，在该病症中，细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间 的平衡或者LOX和NRAGE之间的相互作用发生了缺失或改变，尤其是在表皮中发生了缺失或 改变，所述病症选自：细胞暴露于应急状态(特别是细胞暴露于热)或细胞暴露于辐射(特别 是太阳辐射），或者细胞暴露于毒性物质（例如化学毒性物质或微生物毒性物质）、皮肤老 化、扁平癣或移植物抗宿主疾病、湿疹、牛皮癣和癌症，特别是基底细胞型或刺细胞型上皮 癌，尤其是皮肤上皮癌。
[0116] 优选，所述组合物还包括抗LOX的抗体，用于检测细胞中LOX表达的调节，特别是上 皮细胞，优选角质细胞。
[0117] 优选，所述组合物还包括抗LOX的抗体，用于检测角质细胞中的LOX表达的调节。
[0118] 优选，所述角质细胞是人类角质细胞。
[0119] 发明详述
[0120] 本发明人出乎意料之外地发现了 LOX和NRAGE蛋白质之间的相互作用。该发现非常 重要，是本发明的出发点之所在。事实上，该发现表明，LOX作为位于细胞增殖、细胞分化和 细胞凋亡途径交叉点上的蛋白质，能够控制细胞稳态。
[0121] 另一方面，本发明人发现了 NRAGE蛋白质可以特别是在表皮中进行表达，尤其是在 角质细胞中。该发现使得可以在细胞稳态受到干扰的情况下将LOX和NRAGE之间的相互作用 作为化妆学或治疗的靶点从而恢复细胞稳态。
[0122] 1)检测和鉴定L0X/NRAGE之间相互作用的体外试验
[0123] 人们已经发现LOX存在于表皮中（Noblesse等，赖氨酸氧化酶和赖氨酸氧化酶样物 质存在于真皮和表皮的相当皮肤和人皮肤中并与弹性纤维有关(Lysyl oxydase-like and lysyl oxydase are present in the dermis and epidermis of a skinequivalent and in human skin and are associated to elastic fibers)，X Invest. Dermatol.122: 621-630，2004)，发明人一直在进行研究，试图确定LOX是否在该水平上起作用，但是，迄今 为止，已知的主要作用（即在胶原和弹性硬蛋白交联中的作用）在这些细胞中不可能存在， 因为虽然LOX存在于这些细胞中，但是胶原和弹性硬蛋白却不存在(或极少）。
[0124] 为此，采用双杂交技术在酵母中对LOX的蛋白质配偶体进行了研究，对正常人皮肤 的角质细胞的DNAc文库进行了筛选，采用GAL4BD-hL0Xmat作为诱导物，由此证明了 NRAGE是 LOX的蛋白质配偶体(见实施例1)。
[0125] 然后，发明人又采用Hela细胞通过双杂交技术进行了验证，在哺乳动物细胞中同 样观察到这种潜在的配偶作用(见实施例2).
[0126] 随后的步骤包括测定这种LOX和NRAGE蛋白质之间的潜在配偶作用是否是直接的 物理作用。这可以通过将它们的基因转染到Cos7细胞中后产生的LOX和NRAGE蛋白质的共免 疫沉淀技术来实现。一方面，获得的结果证明了LOX和NRAGE之间的物理作用，并明确了LOX 与NRAGE作用的具体区域，该区域被称为IRD (散在重复结构域），该区域为MAGE蛋白质家族 的NRAGE的特异性区域(见实施例3)。
[0127] 就此而言，在该阶段值得注意的是，当考虑结合方式时发现LOX和NRAGE之间的相 互作用是特别重要的，一方面，NRAGE蛋白质含有两个富含赖氨酸残基的区域，该区域可能 成为在LOX催化作用下进行二聚化的适合部位，另一方面，正是这个二聚体使得NRAGE蛋白 质发挥其功能。
[0128] 由于在体外试验中发现了LOX和NRAGE之间存在直接的物理作用，并且相互作用的 区域为NRAGE的IRD区域，发明人产生了这样一个疑问：这种相互作用是否也存在于体内？在 这点上，需要注意的是，与LOX不同，NRAGE在皮肤中的存在未曾报道过。
[0129] 2)检测正常人皮肤和重构正常人皮肤中NRAGE的存在
[0130]发明人已经发现了 NRAGE在皮肤中表达的证据，在表皮和真皮中都有表达(见实施 例4和5)。
[0131 ]在本发明中，发明人实施了定位NRAGE在皮肤中表达的方法。
[0132] 在表皮中，发明人出乎意料之外地发现，NRAGE不是以均匀的方式表达的，而是以 梯度的方式表达的，这与广泛存在的蛋白质的表达方式不同。
[0133] 表皮结构：
[0134] 表皮是一种基于基底膜的复层上皮，所述基底膜与真皮层相连。其厚度平均在60 到 100μπι之间，它由四层构成，由角质细胞逐渐分化而成，从深层到表层依次为：
[0135] -基底层(仅有一层细胞）
[0136] -棘层(5到6层细胞）
[0137] -颗粒层(1到3层细胞）
[0138]-角质层或鳞肩层(5到10层细胞）
[0139] NRAGE不存在于基底层中，但似乎存在于分化的角质细胞的基础层（premieres couches)中，在鳞肩层中显著增加。这些在表皮的基底层之上的基础层中的增加与关于LOX 观察到的相符，L 0 X出现在基底层中。相反，L 0 X在表皮的最上层中减少，同时其中出现 NRAGE，由此导致产生了 3个不同的区域：
[0140] 一 1个表皮的最下面区域，该区域包括基底层和增殖的基底层上面的基础层，其中 仅表达LOX;
[0141] - 1个表皮的中间区域，从不增殖的基底层上面的基础层到鳞肩层基础层，其中 LOX和NRAGE共同表达；
[0142] 一 1个表皮的最上面区域，其中仅表达NRAGE。
[0143] 在细胞水平上观察到的结果表明，LOX和NRAGE出现在细胞的外围，特别是在细胞 膜下面的区域，此外，NRAGE似乎还出现在细胞质中（见实施例4和5)。
[0144] 因此，发明人首次证明了NRAGE在皮肤中的存在:真皮和表皮，而且还证明。表皮包 括一个在其中两个LOX和NRAGE蛋白质在细胞水平上均表达和分裂的区域，尤其是在角质细 胞中，另外还对这两个蛋白质进行了定位:细胞膜下的外围区域(另外NRAGE还存在于细胞 质中）。
[0145] 由此，发明人通过体外研究证明，在LOX和NRAGE均存在的皮肤区域可以使它们发 生直接作用。
[0146] 3) LOX和/或NRAGE在老化和发生了 一些病理变化的表皮中的表达受到了干扰
[0147] 发明人还出乎意料之外地发现，老化的皮肤和发生了一些病理性变化的皮肤均伴 随着LOX和/或NRAGE在表皮中的表达受到了干扰。
[0148] 3.1)LOX和NRAGE在表皮中的状况
[0149] 3.1.1)老年人皮肤
[0150] 老年人的皮肤的特征在于，表皮增殖减少并且非常薄(减少到仅存在数个细胞层） 以及角质化过度。
[0151] 发明人还发现，LOX在老年人的皮肤中完全缺失（通过使用的技术可以检测）。相 反，NRAGE却大量在细胞质中和基底层上面的基础层中表达，并且没有表达梯度的变化。
[0152] 因此，本发明可以通过重新诱导分化区和/或调节凋亡区，可以刺激LOX的表达 (和/或活性），同时抑制或者不抑制NRAGE的表达(和/或活性），尤其是通过恢复LOX和NRAGE 的共同表达区。此外，还使皮肤增厚，尤其是表皮增厚。
[0153] 因此，本发明的目的特别是在于校正或预防皮肤的老化。
[0154] 3.1.2)移植物抗宿主疾病GVH
[0155] GVH可能是一种因为造血干细胞的同种异体移植所引起的疾病。它与移植物中的 免疫细胞(淋巴细胞)对抗患者的正常器官(尤其是皮肤、肝脏和消化管）的作用有关。在皮 肤中，免疫排斥反应表现为皮疹、发痒和炎症。
[0156] 患有该病的患者的皮肤都很薄，并伴有表皮细胞凋亡的增加。
[0157] 发明人进行的组织学研究证明，在细胞质和基底层上面的基础层中LOX出现缺失 而NRAGE大量出现。
[0158] 因此，本发明的目的在于刺激LOX的表达(和/或活性），同时抑制或不抑制NRAGE的 表达(和/或活性)产生，从而可以重新诱导LOX和NRAGE的共同表达区，使它们能够相互作用 并使移植物抗宿主疾病的皮肤表象减少，同时特别是伴有皮肤、尤其是表皮的增厚。
[0159] 所以，本发明使GVH患者的该种疾病的皮肤表象减轻。
[0160] 3.1.3)扁平癣
[0161] 扁平癣是一种病因未知的皮肤病，其特征在于出现直径为几毫米的丘疹，该种丘 疹呈紫色、扁平状、确定、干燥并且十分的痒。
[0162] 本发明发现，在该种疾病中，LOX表达急剧减少，甚至完全缺失，而NRAGE的表达也 非常不规律。无疑，这些观察结果反映了这两个蛋白质之间相互作用的消失，或是十分的微 弱。
[0163] 因此，本发明的目的在于刺激LOX的表达(和/或活性），调节或者不调节NRAGE的表 达(和/或活性），从而重新诱导LOX和NRAGE的共同表达区，使它们能够相互作用并恢复至正 常表皮状态。
[0164] 因此，本发明能够治疗、缓解患者的扁平癣或预防该病的发生。
[0165] 3.1.4)牛皮癣
[0166] 牛皮癣是一种慢性皮肤疾病，其特征在于红斑性的鳞状损害。其原因是角质细胞 的快速增长，造成表皮更新加快并增厚。
[0167] 从组织学的角度来看，可以观察到最终分化阶段的初期步骤中的细胞增殖过度、 不完全的最终分化并同时伴随着细胞凋亡的缺失或减少。
[0168] 发明人检测到了LOX的大量表达和NRAGE的正常存在，在相关区域均匀分布，没有 表达梯度的变化。关于这种与正常不同的表达强度特征，还存在大量与蛋白质定位有关的 异常。所以，在牛皮癣患者的皮肤中，LOX基本上是在表皮的下面部分表达，而NRAGE仅在上 面部分表达，如此，这些蛋白质的表达发生了变化，无在健康的皮肤中观察到的重合区 (zone de recouvrement)。在细胞中，仅在细胞质中观察到NRAGE，而在细胞膜下的外围区 域则没有观察到。
[0169] 对牛皮癣的这些观察结果表明，尽管LOX和NRAGE蛋白质都在表皮中存在，但是由 于它们没有存在于同一区域，所以它们之间不能发生相互作用。这种相互作用的缺失，导致 了表皮功能的紊乱，同时反映出LOX和NRAGE的相互作用在维持表皮细胞稳态中起作用。
[0170] 所以，抑制LOX的表达(和/或活性）和/或任选刺激(优选部分刺激)NRAGE的表达 (和/或活性），特别是能够获得LOX表达和NRAGE表达的重合区，从而重新诱导产生调节的增 殖区，使有利于角质细胞凋亡的增殖过度降低。
[0171] 在另一方面，刺激NRAGE的表达(和/或活性)和/或抑制(优选部分)LOX的表达(和/ 或活性），特别是能够获得LOX表达和NRAGE表达的重合区，从而重新诱导产生调节的增殖 区，使有利于角质细胞凋亡的增殖过度降低。
[0172] 因此，本发明可以预防和/或治疗牛皮癣，或在一定程度上降低其影响。
[0173] 3.1.5)湿疹
[0174] 湿疹是一种皮肤病，临床特征在于红、面积或大或小的局部肿胀，而且还形成渗液 的囊泡，随后形成痂盖，同时伴随着剧痒。在湿疹慢性期，伴有皮肤的改变和皮肤的增厚。在 表皮中，细胞凋亡减少。
[0175] 发明人发现，细胞外围中的LOX表达非常强。相反，NRAGE的表达很少并且仅仅局限 在细胞质中，无疑，这就造成了研究的两种蛋白质之间相互作用的缺失或者很弱。
[0176] 因此，刺激NRAGE的表达（和/或活性）和/或抑制（优选部分）LOX的表达（和/或活 性），可以增加细胞的凋亡并因此可以减少湿疹的影响。
[0177] 所以，本发明能够预防和/或治疗湿疹，特别是减少湿疹的影响。
[0178] 3.1.6)皮肤上皮细胞癌
[0179]人们鉴别了两大类的皮肤上皮细胞癌：
[0180]-基底细胞癌（占90%)是一种发展很慢的肿瘤，基本上是局限性的，它几乎从来不 发生转移。它是由于基底层的角质细胞的增殖失控所引起的。
[0181 ]-棘细胞癌（占 10 % )是一种更具攻击性的局限性肿瘤，可能发生转移。它源于棘层 的角质细胞的增殖失控。
[0182] 发明人发现，在研究的两种类型的癌症（基底细胞癌和棘细胞癌）的攻击性细胞 中，LOX和NRAGE不存在，同时还伴有在肿瘤周围的表皮中LOX和NRAGE渐进性缺失。发明人还 观察到，LOX在肿瘤周围的基底部大量表达，而NRAGE的表达却是缺失的。
[0183] 值得注意的是，在该阶段LOX表达的丧失是出乎人们预料之外的，在这之前的研究 中从来没有在这两种癌中被证明过，并且可能是上皮细胞所特有的，因为LOX通常被认为在 原位癌中是存在的。
[0184] NRAGE表达的缺失的概念也是全新的，过去从来也没有在任何的癌症中有所描述。
[0185] 这样，刺激NRAGE的表达(和/或活性)和LOX的表达(和/或活性），可以恢复细胞稳 态。这就有可能逆转肿瘤表型，尤其是对于皮肤的上皮细胞癌。
[0186] 3.2)对病理组织研究的小结
[0187] 从这些观察中，发明人证明，在细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡下调的 情况下，或者在老年人表皮中或者在患有各种影响特别是表皮的疾病中，均存在系统性LOX 和/或NRAGE表达缺陷的特征，这些缺陷能够改变它们之间的相互作用或者使它们不能发生 相互作用。
[0188] 这使得发明人试图寻找一个通过对LOX或NRAGE进行调控来恢复细胞增殖、细胞分 化和细胞凋亡之间的平衡的方法，优选对LOX和NRAGE同时进行调控。
[0189] 由这些意外的发现，发明人已经找到了一种鉴定调节LOX和/或NRAGE表达从而通 过它们之间的相互作用恢复对这些蛋白质的调控的活性成分的方法，所述活性成分可以用 于制备组合物，特别是化妆组合物或药用组合物。
[0190] 在该方法中，在表皮细胞增殖减少(皮肤老化、GVH)的情况下，其特征在于表皮过 薄和LOX表达的缺失，可以刺激LOX的表达，同时抑制或不抑制NRAGE的表达，通过调节LOX和 NRAGE的共同表达，重新诱导产生一个调节的细胞分化和凋亡区，从而诱导皮肤增厚。
[0191]在表皮细胞增殖过度（牛皮癣、湿疹）的情况下，其中NRAGE表达低下，可以刺激 NRAGE的表达，同时抑制或是不抑制（轻柔的）LOX的表达，增加细胞的凋亡以重新诱导产生 一个调节的细胞增殖区(L0X/NRAGE重合区），使得细胞增殖过度被停止。
[0192] 在发生了大量的表皮细胞凋亡的情况下(皮肤老化、皮肤暴露在应急状态下，尤其 是在暴露于热的情况下，或是暴露于辐射(特别是太阳辐射），或是暴露于毒性物质（如化学 毒性物质或微生物毒性物质），或是在移植物抗宿主疾病(GVH中），在这些情况下，NRAGE是 表达过度的，可以在抑制NRAGE表达的同时刺激或是不刺激LOX的表达。
[0193] 4)对LOX参与细胞凋亡的证明
[0194] 发明人出乎预料之外地发现，LOX和细胞凋亡之间存在人们之前未知的联系。获得 的证据反映了LOX在角质细胞中的抗细胞凋亡作用，具体而言，该作用包括对促凋亡蛋白质 NRAGE的调节。
[0195] 5)活性成分的研究
[0196]对活性成分的研究是通过特别是对LOX和NRAGE的信使RNA的表达的分析来进行 的，特别是在培养的角质细胞中，优选人类角质细胞。在进行有效接触的充分条件下，使活 性待测的活性成分与培养的角质细胞接触足够的时间。优选在不同的浓度下对活性成分进 行检测，从而检测浓度对细胞的影响。
[0197] 优选，本发明所筛选的活性成分是植物源的，特别是要避免与化学合成有关的问 题。来源于植物的活性成分的优点是本领域技术人员公知的，特别是在药学、皮肤药学、营 养学和化妆学领域中。
[0198] 对活性成分的研究可以通过、特别是通过提取全部RNA、然后进行定量RT-PCR进 行。具体而言，优选的引物序列是实施例13中使用的序列，但不限于此。
[0199] 每个测定中cDNA的定量通过与肌动蛋白的cDNA比较进行。然后，对活性成分存在 时和不存在时的作用进行比较。与对照相比，当NRAGE和/或LOX的表达和/或活性得到调节 (刺激或抑制)时，可以对活性成分进行定性。优选，活性成分使LOX和/或NRAGE的信使RNA的 表达调节至少50%，或者使LOX和/或NRAGE的表达和/或活性调节至少15%。
[0200] 根据本发明，可以将化合物制备为组合物的形式，特别是化妆组合物、皮肤药用组 合物或药用组合物。因此，对于这些组合物而言，含有的赋形剂例如为至少一种选自下列的 成分：软化剂、乳化剂、表面活性剂、润湿剂、增稠剂、干燥剂、调理剂、消光剂（agents matifiant)、稳定剂、抗氧化剂、结构调理剂（les agentsde texture)、亮光剂、成膜剂、增 溶剂、颜料、着色剂、香料和滤光剂。优选，这些赋形剂选自氨基酸及其衍生物、聚甘油、酯 类、纤维素聚合物和衍生物、羊毛脂衍生物、磷脂、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、蔗糖基稳定剂、 维生素E及其衍生物、天然和合成蜡、植物油、甘油三酸脂、阜化剂、植物留醇、植物酯、娃氧 烷及其衍生物、水解蛋白质、霍霍巴油及其衍生物、亲水和疏水的酯类、甜菜碱、氨基氧化 物、植物提取物、蔗糖酯、二氧化钛、甘氨酸、对羟基苯甲酸酯，优选丁二醇、硬脂醇聚醚-2 (le st6areth_2)、硬脂醇聚酿_21(le st6areth_21)、15-二醇硬脂酿（le glycol_15st6 aryl ether)、十六醇（le c6t6aryl alcool)、苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲 酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、丁二醇、天然维生素E、甘油、二羟基十六烷 基钠、羟基十六基异丙基异丙醚、甘醇硬脂酸酯、三异壬精、椰油酸辛酯（I'octyl cocoate)、聚丙稀酰胺、异构石錯、月桂醇聚醚-7(laureth_7)、卡波姆、丙二醇、丙三醇、红 没药醇、硅油、氢氧化钠、PEG 30二聚羟基硬脂酸酯、甘油三癸/辛酸酯、辛酸十六酯、己二酸 二丁酯、葡萄籽油、霍霍巴油、硫酸镁、EDTA、环甲基硅酮、黄原胶、柠檬酸、十二烷基硫酸钠、 蜡和矿物油、异硬脂酸异硬脂酯、丙二醇二壬酸酯、丙二醇异硬脂酸酯、PEG 8蜂蜡、氢化棕 榈芯油甘油酯（les glycerides d'huile de coeur de palme hydrog6n6e)、氢化棕榈油 甘油酯、羊毛油、芝麻油、乳酸蜡基酯、羊毛醇、蓖麻油、二氧化钛、乳糖、蔗糖、低密度聚乙 烯、等渗盐溶液。
[0201] 优选，上述组合物配制为下列形式:溶液(水溶性的或脂溶性的）、乳剂或者水溶性 或脂溶性凝胶，特别是罐装的或是管装的，特别是沐浴露、洗发水、奶液、乳液、微乳或超微 乳，尤其是水包油型或是油包水型，或是多重的或是硅化的；洗液，尤其是玻璃瓶装的，或是 塑料瓶装的或是一个带剂量的瓶子或是制成喷雾剂;安瓿剂;糖浆;液态香皂;皮肤用小面 饼;软膏;泡沫剂;注射溶液;无水产品，优选液态、糊状或是固体，例如条状的，尤其是口红 形式;粉;片剂。
【附图说明】
[0202]-图I: NRAGE蛋白质序列和示意图。
[0203]-图2:在实施例2中获得的双杂交相互作用结果的平均值。
[0204] -图3:鉴定重构皮肤中LOX和NRAGE的存在。
[0205] -图4:采用共聚焦显微镜对人皮肤切片中的LOX和NRAGE进行共定位。
[0206]-图5:91岁的老年人皮肤切片中LOX和NRAGE的检测。
[0207] -图6:移植物抗宿主疾病患者皮肤切片中LOX和NRAGE的检测。
[0208] -图7:基底细胞癌和棘细胞癌患者皮肤切片中LOX和NRAGE的检测。
[0209] -图8:扁平癣患者皮肤切片中LOX和NRAGE的检测。
[0210] -图9:牛皮癣患者皮肤切片中LOX和NRAGE的定位。
[0211 ]-图10:湿疹患者皮肤切片中LOX和NRAGE的定位。
[0212] -图11:用伊文思蓝对重构皮肤进行染色(表皮层是红色的，细胞是蓝色的，真皮的 基质纤维是红色的，真皮层和表皮的融合处用点标记出来）。
[0213] -图12:用免疫组织化学方法对重构细胞中的细胞角蛋白进行检测(高度表达的细 胞呈红色，核呈蓝色，真皮层和表皮的融合处用点标记出来）。
[0214] -图13:用免疫组织化学方法对重构细胞中的转谷氨酰胺酶进行检测(高度表达的 细胞呈红色，核呈蓝色，真皮层和表皮的融合处用点标记出来）。
[0215] 本发明的其他目的、特征和优点在所属领域的技术人员参照下列实施例阅读了所 述解释性说明后将是显而易见的，所述实施例仅用于说明本发明，而不以任何方式限制本 发明的范围。
[0216] 这些实施例为本发明整体的一部分，在描述现有技术时所述及的任何新特征(包 括实施例)就其功能和总体上而言都构成本发明整体的一部分。
[0217]因此，每个实施例都有一个总的范围。
[0218] 另外，在这些实施例中，除特别指明外，所有的百分比均是重量百分比，并且除有 相反说明外，所有的温度均是摄氏度，除特别指明外，压力均指大气压。 实施例
[0219] 实施例1:使用双杂交技术在酵母中克隆NRAGE
[0220]最初，本发明在角质细胞中对LOX的潜在配偶体进行了研究。采用了在酵母(2HL) 中的双杂交技术。2HL系统能够对"诱导物"蛋白质和"目标"潜在配偶体之间的相互作用进 行鉴定和定性。在这种情况下，诱导物蛋白质是一个与Gal4基因的DNA结合域融合的LOX成 熟区域(结合域，BD)。与Gal4基因的活化区域(活化域，AD)融合的目标则是人角质细胞的互 补DNA文库编码的基因。诱导物(LOX)的结构域与所述文库序列编码的结构域之间的相互作 用，使得Gal4启动子能够结合并活化，从而控制赋予酵母AH109缺陷型的不同基因，这就使 得它在缺陷培养基中生长并激活半乳糖苷酶的活性。因此，借助于反应物筛选技术，鉴定了 编码为LOX配偶体的候选蛋白质的基因：细胞内蛋白质黑色素瘤相关的抗原Dl(MAGE-Dl)或 NRAGE(图1)。
[0221] 在酵母中通过诱导物GAL4 BD-hL0Xmat(成熟人L0X)双杂交来筛选角质细胞的基 因文库
[0222]采用在pGAD-ΙΟ载体中的正常人皮肤角质细胞的cDNA文库。该筛选采用的诱导物 为LOXmat，它是由人类的LOX酶的cDNA区编码的，这个区域没有信号肽也没有无功能性原区 域。在后期(en phase derri6re)将该核苷酸序列插入到位于pBD_Gal4Cam载体中的GAL4转 录因子的DNA结合区（结合域:BD)。借助于下列诱导物，通过PCR(聚合酶链反应)将插入至 pGal4-BD载体的Gal4结合域后的+494至+1254的LOX片段扩增：
[0223] l)ggg ate cgc atg gtg ggc gac gac(弓丨入Bam HI)
[0224] 2)ttg teg act aat acg gtg aaa ttg tgc(在保留的终止子中引入SaI I)。
[0225] 最初扩增的片段被插入到TOPO载体中，然后再插入到pGal4_BD中。为了有效表达 BD-LOXmat融合蛋白，采用pBD-LOXmat诱导质粒转化酵母AHl09。
[0226] 在AH109酵母中进行转化的酵母的筛选:6.88X 106cfu(在缺陷培养基中生长），80 个筛选的菌落在含有腺嘌呤，组氨酸，色氨酸和亮氨酸的缺陷培养基中生长，其中23个生长 旺盛。
[0227] 实施例2:在哺乳动物(2HM)中通过双杂交技术检测LOX和NRAGE之间的相互作用
[0228] 在脂转染胺存在下，一方面，用质粒pAct和pAct-NRAGE转染海拉细胞，另一方面， 用pBind和pBind-LOXmat进行转染。48h后测定焚光素酶活性，结果用相对于对照(pBind空 白载体)的荧光素酶活性表示。该实验以一式三份进行，所得结果的均值在图2中示出。
[0229] 在后期将实施例1中使用的用于酵母双杂交的hLOX序列插入到pBind载体 (Promega,Madison USA)的Gal4结合域，用于哺乳动物的双杂交相互作用。
[0230] 将捕获物（la proie)N_RAGE插入到载体pAct(Promega)中的VP16Gal4活化域。起 始于氨基酸152(核苷酸458)。
[0231] 实施例3: LOX和NRAGE在哺乳细胞中的免疫共沉淀
[0232] 对于LOX基因（全人的（complet humain)、人成熟区和鼠成熟区），通过构建物 pcL0X32-V5His(L0X)或 PcL0X36-V5His 或 pcL0X27-V5His 对细胞 Cos7(哺乳动物肾的上皮细 胞)共同转染，而对于NRAGE，则采用pNM3-HA(完全NRAGE)或pNM7-HA(IRD区）进行。转染在直 径为IOOmrn的培养皿中采用脂转染试剂进行。48h以后，转染的细胞在500yL裂解缓冲液进行 裂解，细胞裂解物中的蛋白质与V5抗体或HA抗体一起温育，以1 /250的浓度向细胞裂解物中 加入单克隆V5抗体或HA抗体，在4 °C下振荡1小时30分钟。
[0233] 形成的免疫复合物(Cl)通过与G-琼脂糖蛋白质在4°C下振荡1小时进行沉淀。用裂 解缓冲液洗涤3次(每次I Omin)并用SDS-PAGE缓冲液提取后，用10 %的SDS-PAGE胶对全部免 疫复合物进行电泳，随后进行蛋白质印迹检测。将免疫复合物转移到PVDF(聚乙烯氟)膜，显 色的方法是：
[0234] -对于NRAGE，用稀释至1/1.000的HA抗体，随后采用稀释至1/20.000抗辣根过氧化 物酶抗体
[0235] -对于LOX，采用稀释至1/5 · 000的V5-HRP抗体
[0236] 检测通过HRP的化学发光来实现。
[0237] 所获得结果表明，NRAGE的完整形式(匪3-HA)和人LOX的完整形式(L0X 32H)、人的 成熟区的L0X(L0X 36H)和鼠的成熟区的L0X(L0X27H)均可以免疫共沉淀。此外，NRAGE(NM7-HA)(相应于IRD区）同样可以与这三个重组蛋白质免疫共沉淀，这说明这个区域与相互作用 有关。
[0238] 实施例4:用免疫组织化学方法检测LOX和NRAGE在重构皮肤中的存在
[0239] 使用的重构皮肤模型(MIMESK3N?,Engelhard里昂，法国）是采用正常人成 纤维细胞接种的真皮基质(胶原/糖胺多糖/壳聚糖，MIMEDISC?,Engelhard里昂，法 国）制备的，在它的表面是正常人角质细胞。
[0240] 在培养45天(通过暴露于气一液界面使细胞分化）后，将样品固定在Bouin固定剂 或甲醛中，然后包封于石蜡中。
[0241] 采用下列抗体，对切片进行免疫标记：
[0242] -根据Sommer等所述的方法获得并纯化的LOX抗体(血吸重病鼠肝肌成纤维细胞赖 氨酸氧化酶的瞬时表达（Transient expres sion of lysyl oxidase by liver myofibroblasts in murine schistosomiasis) ,Laboratory Investigation 69:460-470,1993)
[0243] -NRAGE抗体（山羊多克隆I gG)，
[0244] -兔抗山羊第二抗体。
[0245] 用与过氧化物酶缀合的兔IgG抗体并采用二氨基联苯胺作为底物、随后用苏木精 进行反染色（contre-coloration)来检测免疫复合物。
[0246] 图3代表重构皮肤中LOX和NRAGE的免疫组织化学检测。
[0247] 用连续的线标示出表皮和真皮的连接处，真皮的基底部用箭头标出，角质细胞用 前头的头标出。
[0248] LOX在基底层表达，并且在基底层上面的层中也有，但在分化层逐渐消失。NRAGE表 达变化较小，在不增殖的基底层上面的层中表达，并且在颗粒层和棘层中表达增强，在此没 有观察到有LOX的表达。
[0249]所以，它们与重构皮肤M1MESK1N?模型表皮的不增殖的基底层上面的层有 关。
[0250]它们的共同存在在人类的正常皮肤中用免疫组织学方法进行了验证。
[0251] 由此，发明人发现，LOX和NRAGE蛋白质在表皮中表达，并且在棘层中有一个共同存 在的区域。
[0252] 实施例5:采用共聚焦显微镜对人正常皮肤中LOX和NRAGE的共同存在进行定位 [0253]冷冻的正常人皮肤样品来源于外科手术切除术(包皮）。使用实施例4的第一 LOX和 NRAGE抗体来检测LOX和NRAGE的表达。使用的第二抗体是：
[0254]-驴抗兔IgG-FlTC抗体，荧光标记为绿色；
[0255] 一驴抗山羊IgG-R抗体，苏丹红标记为红色。
[0256] 阴性对照没有使用第一抗体。
[0257] 用共聚焦垂直显微镜AXI0PLAN 2LSM510ZEISS对两个标记进行观察，并且用d ZEISS LSM5 Image Browser软件获得图像。
[0258] 图4代表使用共聚焦显微镜对正常人皮肤中的LOX和NRAGE的免疫检测。
[0259] 观察的结果验证了实施例4的结果，在正常人皮肤表皮的棘层中LOX和NRAGE共同 存在，LOX和NRAGE几乎完全共同表达。细胞水平的观察结果表明，LOX和NRAGE出现在细胞的 外围(在细胞膜下外围区域），NRAGE同时还出现在细胞质中。
[0260]因此，发明人证明，在体外证实的它们之间发生直接相互作用的条件在LOX和 NRAGE共同存在的表皮中也是具备的。
[0261] 实施例6:不同年龄的人皮肤中LOX和NRAGE的定位
[0262] 根据实施例4描述的方法，对来自两个不同年龄(20岁以下和60岁以上)类型的人 皮肤层进行免疫组织学研究。
[0263] 图5代表对一个91岁的人的皮肤进行的标记。结果表明，表皮增殖过低、皮肤非常 薄(细胞层数减少)同时角质化过度。
[0264] 发明人发现LOX完全缺失(通过采用的技术可以检测）。相反，NRAGE表达增加、存在 于细胞质中并且出现于基底层上面的基础层中，但没有梯度表达。
[0265] 实施例7:对移植物抗宿主疾病(或GVH)的人皮肤中的LOX和NRAGE进行检测
[0266] 根据实施例4所述的的方法，对患有移植物抗宿主疾病(GVH)的人皮肤切片进行免 疫组织学研究。该研究采用了 5个不同的患者。
[0267] 图6表明，LOX在表皮中几乎完全缺失(在真皮中的表达没有发生改变），而NRAGE则 明显存在，位于细胞质中并在基底层上面的基础层出现。
[0268] 实施例8:对细胞癌和棘细胞癌人皮肤中LOX和NRAGE的检测
[0269] 根据实施例4所述的方法，对患有基底细胞癌和棘细胞癌的患者皮肤样品进行免 疫组织学研究。
[0270] 图7表明在这两种皮肤癌中研究的结果：
[0271 ] -LOX和NRAGE在肿瘤周围的表皮中的表达逐渐减少
[0272] -在攻击型上皮细胞中LOX和NRAGE缺失
[0273] -在肿瘤周围的真皮基质反应（la reaction stromale dermique)中LOX表达增加
[0274] -在肿瘤周围的真皮基质反应中NRAGE缺失
[0275] 实施例9:对扁平癣患者皮肤中的LOX和NRAGE进行检测
[0276] 根据实施例4所述的方法，对3个患有扁平癣的患者的皮肤切片进行免疫组织学研 究。
[0277] 图8表明，LOX在表皮中的表达急剧减少，甚至于完全消失。该紊乱与NRAGE在表皮 中的表达不规则有关。
[0278] 实施例10:对牛皮癣患者皮肤中LOX和NRAGE的存在进行定位
[0279] 根据实施例4所述的方法，对5个患有牛皮癣的患者的皮肤切片进行免疫组织学研 究。
[0280]图9是所有这些切片观察结果的代表，表明，在表皮中，LOX表达非常强，存在中等 量的NRAGE，同时相关区域有或浓或淡的标记，没有发现表达梯度。除这些变化的表达强度 特征之外，与正常的细胞相比，相关蛋白质存在的位置也出现了很多异常。所以，在患有牛 皮癣的皮肤中，LOX主要在表皮下部表达，而NRAGE仅仅在上部表达，蛋白质的表达发生了改 变，不存在在健康的皮肤中正常观察到的重合区。而在细胞中，NRAGE仅仅在细胞质中被观 察到，在细胞膜下的周边没有发现。
[0281] 实施例11:对湿疹患者皮肤中LOX和NRAGE的存在进行定位
[0282] 根据实施例4所述的方法，对患有湿疹的患者皮肤进行免疫组织学研究。
[0283] 图10表明，LOX在表皮中外围的表达非常强。相反，NRAGE表达很少，仅在细胞质中 观察到，这表示LOX和NRAGE在细胞中不再共同存在于一个区域。
[0284] 实施例12: LOX对细胞凋亡抑制作用的研究.
[0285] 该研究采用单层生长至汇合的分化的人角质细胞培养物进行。在正常或是促凋亡 (通过暴露于45°C±0.5°C，1小时30分钟进行热休克）的条件下，加入β-ΑΡΝ(0.02%ρ/ν(重 量/体积）），通过观察对LOX活性的抑制，研究LOX对细胞凋亡的作用。
[0286]对于由于细胞凋亡所引起的细胞死亡的检测和定量采用TUNEL(末端脱氧核苷酸 转移酶介导的dUTP切口端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling))方法，该方法基于伴随细胞凋亡DNA标记的消失。
[0287] 第一步，用TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)标记DNA切口，TdT可以催化荧光素标记的 核苷酸与DNA的游离3'0H末端聚合。第二步，与碱性磷酸酶的底物一起温育，然后通过与碱 性磷酸酶缀合的抗荧光素抗体检测掺入的荧光。
[0288] 借助于在DNase酶溶液中的DNA片段获得阳性对照，并通过加入磷酸盐缓冲液获得 阴性对照，由此确认该试验的有效性。
[0289] 试验结果见下表
[0290] 表 1 无热休克(标记细胞％ ) 热休克(标记细胞％ )
[0291] 无 β-ΑΡΝ 6% 39% 加入 P-APN S6% 81 %
[0292]所得结果表明：
[0293] -热休克(45°C ±0.5°C，1小时30分钟)能诱导标记的细胞凋亡
[0294] -用β~APN来抑制LOX的酶活性导致细胞凋亡显著增加。
[0295] 这些结果证明了 LOX活性的抗细胞凋亡作用。
[0296] 实施例13:使用在含钙培养基中培养的分化角质细胞来分析LOX和NRAGE的信使 RNA的表达，加入或者不加入待测活性成分(通过例如定量RT-PCR对活性成分进行筛选）
[0297]采用青年人正常包皮角质细胞对所述活性成分进行检测(合并的正常人表皮包皮 角质细胞一 Clonetics)
[0298]于37°C、5%C02环境中，用补充有抗生素的K-SFM(不含角质细胞血清的培养基)培 养角质细胞使其扩增至第3代。
[0299] 将细胞例如以每cm240000个细胞的浓度接种于96孔平板中，培养至80 %汇合。随 后，将细胞在高钙培养基中进行培养(CaCl21.7mM，37°C，5%C02)来诱导细胞分化。
[0300] 在为植物(优选根、茎、皮层、花、果实、种子、胚芽、树胶、渗出物、叶子或整个植物） 或者为蛋白质的情况下，用于制备活性成分的原料经辐射或者不经辐射消毒，例如用β或γ 射线以优选5kGy的剂量照射，如果需要，随后研成磨末，例如在室温下研碎。接着，将得到的 粉以2 - 5% (重量/重量）、优选5% (重量/重量)分散于极性溶剂中，例如水或丁二醇，和/或 极性溶剂混合物中，优选水/(醇、二醇或多醇）混合物，所述醇如乙醇、丙三醇、丁二醇和其 他二醇、木糖醇等，可以对混合物的比例进行调整，优选水/ 丁二醇之比为75/25 - 50/50的 混合物，也可以采用非极性溶剂，例如链烷烃，或者采用非极性溶剂混合物，或者采用极性 溶剂和非极性溶剂的混合物。在搅拌(例如磁力搅拌)最少2小时后，通过倾析或离心使样品 澄清，随后优选通过〇. 45μπι或0.22μπι的滤膜过滤。
[0301] 在为特征分子(例如通过合成或半合成获得的分子、通过纯化获得的生物分子)的 情况下，所述用于制备活性成分的原料用溶剂进行稀释，优选用水或二甲基亚砜(浓度优选 为UT 6M - 10-2Μ，优选为10-4Μ数量级，或者基于所述分子的重量计，范围在1 % (重量/重 量）一5 % (重量/重量)之间）。随后任选过滤得到的溶液，优选通过0.45μηι或O . 22μηι的滤膜 过滤。
[0302] 优选，根据上述方法获得的活性成分的终浓度范围优选在0.01%体积/体积(ν/ V) - 10%(v/v)之间，更优选在0.1% - 1%(v/v)之间，例如 1%(v/v)。
[0303] 细胞培养优选在高钙、无生长因子的K-SFM培养基中进行24小时。将细胞用pH 7.4 的磷酸盐缓冲液洗涤，然后在-80 °C冷冻。
[0304] 总RNA的提取
[0305]根据生产商的关于96孔平板的说明，采用SV总RNA分离系统（SV Total RNA Isolation System)(Promega,Meylan,法国）提取总RNA。
[0306] 基因表达的改变通过采用实时RT-PCR测定相对于肌动蛋白（管家基因）的每个基 因的表达进行，并以相对于未处理的阴性对照的％表示。
[0307] 实时 RT-PCR (O-RT-PCR)
[0308] 将IOyL浓度为5ng/yL的总RNA加至40yL的PCR混合物（25yL的SYBR Green Buffer Mix 2 X，0.5yL酶混合物，最终浓度为0.5μΜ正向引物，和最终浓度为0.5μΜ反向引物，不含 RNase和DNase的水适量至40yL)。
[0309] RT-PCR各阶段反应的条件为:逆转录，50 °C，30min;聚合酶活化，95°C，15min; PCR 循环（95°C，15s ;6(TC，30s;72°C，30s) X 50次。
[0310]融合曲线：
[0311] 90 °C，Imin
[0312] 30 0Camin
[0313] 50°C-95°C，10s/°C (融合曲线）
[0314] 刺激或抑制以相对于未处理对照(不存在待检物质）的百分比表示。
[0315] 肌动蛋白基因 ：60°C进行杂交
[0316] 正向引物GTGGGGCGCCCCAGGCACCA
[0317] 反向引物CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC
[0318] LOX基因 ：6(TC进行杂交
[0319] 正向引物ACGTACGTGCAGAAGATGTCC
[0320] 反向引物GGCTGGGTAAGAAATCTGATG
[0321] NRAGE基因 ：6(TC进行杂交
[0322] 正向引物TGCACAGACATCAGCAGATGG
[0323] 反向引物TTCACGGATGATATCTCTCAGC [0324]内披蛋白基因 ：60°C进行杂交
[0325] 正向引物TGTTCCTCCTCCAGTCAATACCC
[0326] 反向引物ATTCCTCATGCTGTTCCCAGTGC
[0327] 考虑到存在的细胞群体，将所有的结果都以相对于用作报告基因（管家基因）的肌 动蛋白的信号表示。根据该实验，将T的标准域值C(T)(=循环域值)设定为0.05到0.01，然 后根据下式计算每个基因的标准单位：
[0328] Sffl《x》107X (l/2)c⑴細《X》
[0329] C(T)細《X》代表使基因的荧光信号达到0.01 -0.05的域值所需的循环数。
[0330] 目标基因值以相对于肌动蛋白的信号通过下式计算:R = Sffl《x》/Sfigsa。
[0331] 比较处理样品和未处理样品的结果，《X》表示肌动蛋白基因、LOX基因或NRAGE基 因。
[0332] 活性成分的筛选:
[0333] 每一试验中cDNA的量以相对于肌动蛋白的cDNA量和阴性对照（不含活性成分)报 道。当检测的结果的因子值约为2时，则认为结果具有显著意义。在测定的120个活性成分 中，在所述的试验浓度和条件下，有3个符合该标准。所述活性成分如下表所示：
[0334] 表 2
[0335] 名称 MRAGE被扩增用作对照MRAGE被扩增作对照 麻黄属 2 2 大豆 2.5： 1 啤酒花 1 2
[0336] 优选，所述麻黄提取物为整株植物的提取物，尤其是使用极性溶剂，如水或水/ 丁 二醇的混和物(例如75/25或50/50 )，优选水。
[0337] 优选，啤酒花的提取物为啤酒花雌花序提取物，尤其是使用极性溶剂，如水或水/ 丁二醇的混和物(例如75/25或50/50)，优选水。
[0338]优选，大豆提取物为大豆种子提取物，尤其是使用极性溶剂，如水或水/ 丁二醇的 混和物(例如75/25或50/50)，优选水。
[0339] 莖塗
[0340]根据对120种活性成分在不同条件下进行测定，发现：
[0341 ]--种活性成分能够显著激活编码NRAGE和LOX的基因的mRNA的合成率
[0342] --种活性成分能够显著激活编码NRAGE的基因的mRNA的合成率，但同时它又不对 编码LOX的基因起作用。
[0343] -一种活性成分能够显著激活编码LOX的基因的mRNA的合成率，但同时它又不对编 码NRAGE的基因起作用。
[0344] 该研究使得可以筛选能够调节细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡的活性 成分，至少是对角质细胞的调节。
[0345] 麻黄提取物可以用于例如治疗疾病，如治疗癌症，优选皮肤上皮细胞癌(基底细胞 癌或棘细胞癌），或是扁平癣，或者任选用于治疗GVH的皮肤表象，也可以用于减少皮肤老 化。
[0346] 大豆提取物可以用于例如治疗疾病，如治疗癌症，如皮肤上皮细胞癌(基底细胞癌 或棘细胞癌），GVH或扁平癣，或者用于对抗或预防老化。大豆提取物能够特别是用于对抗细 胞过度增殖。
[0347] 啤酒花提取物能够用于例如治疗疾病，如治疗癌症，如皮肤上皮细胞癌(基底细胞 癌或棘细胞癌），湿疹或牛皮癣。啤酒花提取物能够特别是用于对抗细胞过度增殖。
[0348] 大豆提取物和啤酒花提取物联合可以用于例如治疗疾病，如治疗癌症，如皮肤上 皮细胞癌(基底细胞癌或棘细胞癌），或扁平癣。
[0349] 大豆提取物和麻黄提取物联合可以用于例如治疗疾病，如治疗癌症，如皮肤上皮 细胞癌(基底细胞癌或棘细胞癌），或扁平癣。
[0350] 啤酒花提取物和麻黄提取物联合可以用于例如治疗疾病，如治疗癌症，如皮肤上 皮细胞癌(基底细胞癌或棘细胞癌），或扁平癣。
[0351] 实施例14:通过定量RT-PCT，分析角质细胞在钙存在下在分化过程中NRAGE和LOX 的信使RNA表达的动力学，活性成分对表达动力学的影响
[0352] 用于使细胞生长至80%汇合的试验条件与实施例13中所述的相同。使细胞在钙 (CaCl2 1.7mM)和活性成分存在下进行分化。在培养2、3和4天后，通过Q-RT-PCR进行分析 (实施例13中所述的方法）。
[0353] 另外还测定了 9个另外的物质。其中一个是桂皮提取物，该提取物在所述试验条件 下对LOX和NRAGE具有抑制作用。
[0354] ^3 名称 NRAGE扩增作对照 LOX扩增作对照 桂皮 2J 0.9 0.5
[0355] 3J 0.7 0.7 4 J 0.2 0,5 (J=天）
[0356] 优选，所述桂皮提取物为树皮提取物，特别是采用极性溶剂提取，如水或水和丁二 醇的混合物(75/25或50/50 )，优选水。
[0357]
[0358] 桂皮提取物可以用于例如治疗疾病，如牛皮癣。
[0359] 桂皮提取物和大豆提取物联合(其作用在前述实施例中测定)可以用于治疗例如 疾病，如GVH的皮肤表象、湿疹、牛皮癣，或者用于减少皮肤老化。
[0360] 实施例15:在没有钙的条件下对培养的角质细胞的LOX信使RNA的表达进行分析， 加入或者不加入活性待测的活性成分(使用例如定量RT-PCR进行分析，对活性成分进行筛 选）
[0361]采用青年正常人角质细胞进行这些活性成分的测定，所述角质细胞通过将外科手 术获得的人活组织进行酶化提取、在补充有抗生素的K-SFM(不含角质细胞血清但含补充物 的培养基)培养基中于37°C、5%C0 2环境中培养至单层获得。
[0362]在第2代时将细胞接种于24孔平板中，例如以每cm230000个细胞的浓度，然后培养 至95 %汇合。随后，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗涤细胞层，优选该缓冲液含有钙和镁，然后 与加入活性待测的活性成分或者加入在不含补充物但是含有抗生素的K-SFM培养基中稀释 的阳性对照。
[0363] 在0.1 %体积/体积(v/v) - 1 % (v/v)浓度下对不同来源(例如，来源于植物、生物 技术或合成）的活性成分进行测定。例如，在1%(v/v)浓度下，对植物来源的活性成分进行 测定，在〇. 1 % (v/V)浓度下，对合成分子进行测定，
[0364] 具体而言，植物来源的活性成分是通过在2 - 5% (p/p)的溶剂或溶剂混合物中浸 泡植物(优选，根、根状茎(rhyzome)、茎、皮层、花、果实、种子、胚芽或叶子），优选水/(乙醇、 二醇或多元醇）（例如乙醇、甘油、丁二醇和其他二醇、木糖醇等），浓度在100/0 - 〇/l〇〇(v/ v)。然后将获得的提取物过滤或蒸馏，回收可溶性组分，优选随后将其通过〇.45μπι的滤膜过 滤。通过在微生物(优选乳杆菌属或酵母菌属)存在下进行植物提取物的发酵获得生物技术 的水解产物。随后，将这些水解产物经过优选〇. 45μπι的滤膜过滤。
[0365] 培养优选在下列条件下进行:37°C，5%⑶2,不含生长因子但含有抗生素的K-SFM 培养基。阴性对照是培养基，或者是含有测试的提取物提取过程中使用的0.1%(v/V) - 1% (v/v)溶剂的培养基。优选，使用的用于诱导细胞分化的阳性对照是氯化钙溶液（CaCl2， 1.7mM的终浓度）。
[0366] 没有经过处理的细胞（阴性对照）在经过pH 7.4的磷酸盐溶液洗涤后于_80°C冷 冻。在活性成分或对照存在下处理24h后，用pH 7.4的磷酸盐溶液洗涤细胞，然后于-80°C冷 冻。
[0367] 总RNA的提取
[0368] 根据生产商的关于24孔平板的说明，采用SV总RNA分离系统（SV Total RNA Isolation System)(Promega,Meylan,法国）提取总RNA。
[0369] 基因表达的改变通过采用实时RT-PCR测定相对于肌动蛋白（管家基因）的每个基 因表达进行，并以相对于未处理的阴性对照的％表示。
[0370] 实时 RT-PCR (O-RT-PCR)
[0371] 将IOyL浓度为5ng/yL的总RNA加至40yL的PCR混合物（25yL的SYBR Green Buffer Mix 2 X，0.5yL酶混合物，最终浓度为0.5μΜ正向引物，和最终浓度为0.5μΜ反向引物，不含 RNase和DNase的水适量至40yL)。
[0372] RT-PCR各阶段反应的条件为:逆转录，50°C，30min;聚合酶活化，95°C，15min;PCR 循环（95。(：，158;60。(：，3〇8;72。(：，3〇8,78。(：，3〇8)\50次。
[0373] 融合曲线：
[0374] 90〇C ,Imin
[0375] 30〇C ,Imin
[0376] 50°C-95°C，10s/°C (融合曲线）
[0377] 使用的引物：
[0378] 肌动蛋白基因：60°C杂交
[0379] 正向引物GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA
[0380] 反向引物CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC
[0381] LOX基因：6(TC杂交
[0382] 正向引物ACG TAC GTG CAG AAG ATG TCC
[0383] 反向引物GGC TGG GTA AGA AAT CTG ATG
[0384] 考虑到存在的细胞群体，将所有的结果都以相对于用作管家基因（管家基因）的肌 动蛋白的信号表示。根据该实验，将T的标准域值C(T)(=循环域值)设定为0.05到0.01，然 后根据下式计算每个基因的标准单位：
[0385] Saa《L0X》107X (1/2)C(T)細《L0X》
[0386] C(T)細《L0X》代表使《L0X》基因的荧光信号达到0.01 -0.05的域值所需的循环数。
[0387] 目标基因值以相对于肌动蛋白的信号通过下式计算:R = Sffl《LOX》/Sfigsa。
[0388] 比较处理样品和未处理样品的结果。
[0389] 活性成分的筛选:
[0390]每一试验中cDNA的量以相对于肌动蛋白的cDNA量和阴性对照(NT)报道。当检测的 结果的因子值约为2(刺激)或0.5(抑制）时，则认为结果具有显著意义。在测定的60个活性 成分中，在所述的试验浓度和条件下，有30个符合该标准。所述活性成分如下表所示：
[0391]表1


[0395]
[0396] 根据对60种活性成分在不同条件下进行测定，发现：
[0397] 一 3种活性成分能够显著抑制编码LOX的基因的mRNA的合成率
[0398] 一 28种活性成分能够显著激活编码LOX的基因的mRNA的合成率。
[0399] 该研究使得可以筛选可能调节细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡的活性 成分，至少是对角质细胞的调节。
[0400] 实施例16:在重构皮肤模型中用组织学方法分析与表皮增殖/分化稳态调节有关 的蛋白质的表达，与或者不与活性待测的活性成分接触(比如麻黄提取物）
[0401] 使用的重构皮肤模型(MIMESKIN⑩，Engelhard里昂，法国）是采用正常人成 纤维细胞接种的真皮基质（胶原/糖胺多糖/壳聚糖，MIMEDIjS_C(|),Engelhard里昂，法 国）制备的，在它的表面是正常人角质细胞，这些细胞通过用酶处理外科手术切除的活组织 提取的，所述皮肤模型用于进行细胞增殖或分化的标记。
[0402] 具体而言，根据下述方法重构皮肤模型：
[0403] 一将0.5 - IX IO6个正常人皮肤成纤维细胞接种于胶原/糖胺多糖/壳聚糖基的矩 形基质上，随后在营养培养基中培养21天，例如补充有下列物质的DMEM-Glutamax培养基： 10%小牛血清、抗坏血酸（优选终浓度为ImM)、EGF(表皮生长因子）（优选终浓度为IOng/ ml)、Normocin(优选终浓度是 100yg/mL)。
[0404]-将0.5 - IX IO6个人类正常的角质细胞接种于真皮等同物中，随后在营养培养基 中培养，例如补充有下列物质的DMEM-Glutamax/Ham F-12(比例为3/1v/v):小牛血清、抗坏 血酸(优选终浓度为lmM)、EGF(表皮生长因子）（优选终浓度为10ng/ml)、氢化可的松(优选 终浓度为〇 · 4μg/ml)、umuline(优选终浓度为0 · 12UI/ml)、isuprel (优选终浓度为0 · 4yg/ 1111)、让11〇(1〇认7仰1^6(优选终浓度为2\10_91)、腺嘌呤（优选终浓度为24.3以8/1111)、 Normocine(优选终浓度为100μg/ml)。在浸入条件下（en contition immergge)，将培养继 续7天。随后将培养物再置于气一液界面上在与浸入培养相同的培养基(但是不加入小牛血 清、氢化可的松、丨8即代1、1：1'；[；[0(101：1171'011丨6和111]1111；[116)中14天。
[0405] 最好将活性成分(麻黄提取物)在上述培养基中稀释至0.5 - 1%，在分别接种成纤 维细胞和角质细胞3天后使用（即第3天至第21天和第24天至第42天）。优选在重构皮肤的出 现阶段（即第28天至第42天)通过加入终浓度为1.5mM的氯化钙来制备阳性对照，以刺激表 皮的分化。
[0406] 在培养的最后，将这些样品冷冻、封入到热敏树脂中，然后低温切成5μπι的切片。 [0407]采用下列物质对切片进行标记：
[0408] 一抗人转谷氨酰胺酶第一抗体 [0409] -抗人细胞角蛋白-10第一抗体
[0410] 一与alexa-f Iuor缀合的第二抗体
[0411] 一伊文思蓝
[0412] -4'，6_二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)
[0413] 对于免疫标记的目测采用光学显微镜(AXi〇Sk 〇p2plUS-ZeiSS，德国）进行，对免疫 标记的转谷氨酰胺酶的定量通过图像分析进行(Lucia-Nikon，法国），评价活性成分的治疗 作用(此1111-8丨(^1^统计学检验4〈0.01)。
[0414]表1:对转谷氨酰胺酶标记的定量 强度 未经活性 钙 0.5%的麻黄 1%的麻黄 .成分处理 0.149 0.061 0.082 0.276 0.099 0.076 0.126 0.196 0.092 0.064 0.094 0.192
[0415] 平均值 0.Π 3 0.067 0.100 0.221 均方根偏差 0.031 0.008 0.023 0.048 相对于 NT 100% 59% 88% 196% 相对于NT的- 无 无 有 显著性 相对于含钙的 169°〇 100% 149% 330% 相对于含转的 无 -无有
[0416] 显著性
[0417] 这些结果表明，所述活性成分能够以剂量依赖方式诱导与阳性对照相同类型的表 皮分化。事实上，经过处理的皮肤具有更多数量的表达转谷氨酰胺酶的角质细胞层，特别是 在颗粒层中。此外，所获得的标记的强度更高并且更确定，由表皮部分变大说明。定量结果 清楚地表明了，在处理之后、特别是用浓度为1% (诱导2次)的活性成分诱导的蛋白质形式。
[0418] 图11代表用伊文思蓝对重构皮肤的染色情况(表皮层为红色，细胞为蓝色，真皮基 底纤维为红色，真皮和表皮的连接处用虚线标出）。
[0419] 该结果表明，活性成分以剂量依赖方式诱导了与阳性对照相同类型的表皮分化。 事实上，经过处理的皮肤具有更多数量的分化的角质细胞层，特别是同时还观察到颗粒层 厚度的增加。此外，在用麻黄处理的真皮中，成纤维细胞的密度也同样具有有意义的增加。
[0420] 图12代表对重构皮肤中的细胞角化蛋白-10的免疫组织学检测(细胞呈很强的红 色标记，细胞核为蓝色，真皮和表皮的连接处用虚线标出）。
[0421] 该结果表明，活性成分以剂量依赖方式诱导了与阳性对照相同类型的表皮分化。 事实上，经过处理的皮肤具有更多数量的表达细胞角化蛋白-10的角质细胞层，特别是在颗 粒层中。
[0422] 图13代表对重构皮肤中的转谷氨酰胺酶的免疫组织学检测(细胞呈很强的红色标 记，细胞核为蓝色，真皮和表皮的连接处用虚线标出）。
[0423] 实施例17:使用本发明的产物制备水包油型乳剂形式的化妆用制剂或药用制剂
[0424] 制剂 17a A.
[0425] 水 适量至100 丁二醇 2 甘油 3 二幾基十六基钠 2 磷酸盐 异丙基羟基十六基醚 B 乙二醇硬脂酸酯SE 14 三异壬精 5
[0426]椰油酸辛酯 6 C 丁二醇 2 对羟基苯甲酸甲脂 对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯 调节pH值到 5,5 D 本发明产物 0.01 - 10 %
[0427]制剂 17b A 水 适量加至100 丁二醇 2 甘油 3 聚丙烯醜胺，石蜡油溶剂 2J
[0428] 月桂醇聚醚-7 B 丁二醇 2 对羟基苯曱酸甲脂， 对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯曱酸丙酯； 2 苯氧基乙醇 对羟基苯甲酸甲脂，
[M29]对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯， 对幾基苯甲酸乙酯 0.5 丁二醇 D 本发明产物 0.01-10%
[0430]制剂 17C A 卡波姆 0.50 丙二醇 3 甘油 5 水 适量至丨00 B 椰油酸辛酯 S 没药醇 0.30
[0431]硅油(二甲基毯氧烷） 0.30 C 氢氧化钠 L60 苯氧基乙醇 0·50 对羟基苯甲酸甲脂， 对羟基苯甲酸丙醋，对羟基苯甲酸丁酯， 对羟基苯甲酸乙酯 Ε_ 香料 0.30
[0432] F 本发明产物 0.01-10%
[0433] 本发明的实施例18:本发明产物在油包水型制剂中的用途 A PEG 30- 3 聚二羟基硬脂酸酯 甘油三癸酸酯 3 辛酸十六酯 4 己二酸二丁基酯 3 葡萄籽油 1，5 霍霍巴油 1.5 苯氧基乙醇 0.5 对羟基苯曱酸甲脂， _4]对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯， 对羟基苯甲酸乙酯 B 甘油 3 丁二醇 3 硫酸镁 0.5 EDTA 0.05 水 适量至100 € 环甲基娃氧烷 I 硅油(二甲基娃氧娱<) 1 D_
[0435] 香料 OJ E 本发明产物 0.01-10 %
[0436] 本发明物的实施例19:本发明产物在洗发水和沐浴液形式的制剂中的用途 A 黄原胶 0.8 水 适量加至100 丁二醇 0.5 对羟基苯甲酸甲脂， 对羟基苯甲酸乙醋，对羟基苯甲酸丙酯 苯氧基乙醇， 0.5 对羟基苯曱酸甲脂，
[Q437]对羟基苯甲酸丙酿，对羟基苯曱酸丁酿， 对羟基苯甲酸乙酯 C 杵檬酸 0.8 ?_ 聚氧乙燁烷基硫酸钠 40.0 本发明产物 OJl-10 %
[0438] 本发明的实施例20:本发明产物在口红或其他无水产品形式的制剂中的用途 A 地蜡 17.0 异硬脂酸异硬脂酯 31.5 丙二醇二壬酸酯 2·6 丙二醇异硬脂酸酯 1.7 PEG-8 蜂蜡 3.0 氢化棕榈仁油 3.4 甘油酯 氢化棕榈油甘油酯 羊毛油 3.4 祕油 1.7
[0439] 乳酸十六姨?基酯 1.7 矿物油，羊毛醇 3.0 Β_ 蓖麻油 适量加至100 二氧化钛 3.9 CI 15850 :1 0.616 CI 45410 :1 0.256 C119140:1 0,048 Cl 77491 2.048 C 本发明产物品 0.05%
[0440] 本发明的实施例21:本发明的产物在水性啫喱型制剂中的用途(眼霜，瘦身乳等) [0441 ] A_ 水 适量加至100 卡波姆 0.5 丁二醇 15 苯祕乙醇，对羟基苯甲酸曱脂， 〇.:5
[0442] 对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯 对羟基苯甲酸乙酯 本发明产物 0*01-10%
[0443] 本发明的实施例22:本发明的产物在3部分乳剂型制剂中的用途
[0444] 初乳 W1/0 A PEG-30- 二聚羟基硬脂酸鳙 4 癸酸三甘油酯 7.5 异十六燒 15 PPG-15 硬脂基醚(PPG-15 st6arul ether) 7.5 B
[0445] ~ 水 653 C 苯氧基乙醇 0 7 对羟基苯甲酸曱脂， 对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯， 对羟基苯甲酸乙酯
[0446] 次乳 W1/0/W2 4
[0447] - 初乳 60 泊洛沙姆407 2 苯氧基乙醇 0.3 对羟基苯甲酸甲腊， 对羟基苯甲酸丙酯，2-溴·2-硝基·1，3·丙二醇 厂^ 水 适量加至 100
[0448]' C 卡波姆 15 D 三乙醇胺 .pH: .6...0 _石.3
[0449]本发明的实施例23:制备含有本发明产物的药用制剂 [0450] 制剂23a:制备片剂 4 赋形剂 每片的克数 乳糖 0.359
[0451] 蔗糖 0.240 B 本炭明产物* 0.001 - 0.1
[0452] *可以例如根据实施例13所述的提取方法随后进行干燥获得本发明产物。
[0453] 制剂23b:制备膏剂 4
[0454] 赋形剂 低密度聚乙烯 5.5 液体石蜡 适量加至100
[0455] 本发明产物* OJOl - 0.1
[0456] *可以例如根据实施例13所述的提取方法随后进行干燥获得本发明产物。
[0457] 制剂23c:制备注射用制剂 A 赋形剂 等渗盐水5 ml
[0458] B 本发明产物*0.001 -o.l g
[0459] *可以例如根据实施例13所述的提取方法随后进行干燥获得本发明产物。
[0460] 实施例24:对含有本发明成分的制剂的化妆用可接受性的评估
[0461] 毒理学实验采用根据实施例2获得的化合物进行，将化合物以10%的浓度加至 0.5%的黄原胶啫喱中，评价对兔眼的影响，通过单次经口给大鼠施用研究异常毒性，并采 用豚鼠进行致敏性实验。
[0462] 采用兔进行皮肤初级刺激的评估
[0463] 将上述制备的制剂不经稀释以0.5ml的剂量施用于3只兔的皮肤上，使用的方法是 OCDE关于《对皮肤的急性刺激性/腐蚀性》条例中所推荐的方法。
[0464] 根据1982年2月1日制定并于1982年2月21日在JORF上公布的标准对这些产品进行 分类。
[0465] 由实验结果可以得出结论，本发明产物对皮肤而言属于无刺激性类。
[0466] 对兔眼部刺激性的评价
[0467] 根据1987年2月24日第405号OCDE关于《对眼的急性刺激性/腐蚀性》条例中所推荐 的方法，将上述制剂纯品以0.1ml的量滴入3只兔的眼中一次。
[0468] 由该试验结果可以得出结论，根据91/326CEE条例的标准，上述制剂纯品（未经稀 释)对于眼睛是没有刺激性的。
[0469] 通过对大鼠单次经口施用测定异常毒性
[0470]根据1987年2月24日的第401号0⑶E条例所倡导并适用于化妆用产品的方法，将上 述制剂经口以5g/Kg体重的剂量单次施用于5只雄性大鼠和5只雌性大鼠。
[0471 ] 结果表明，LDo和LD5q均在5000mg/Kg以上。因此，测定的上述制剂不属于对消化道 有危险的制剂类。
[0472] 用豚鼠进行潜在的皮肤致敏性研究
[0473] 对上述制剂进行Magnusson和Kligmann描述的最大限度化试验，根据OCDE的第406 号条例的方案。
[0474]上述制剂属于与皮肤接触无致敏性类。
【主权项】
1. 有效量的至少一种调节具有SEQ ID No. 1序列的LOX表达和/或活性和/或调节具有 SEQ ID No. 2序列的NRAGE表达和/或活性的物质在制备用于调节L0X和NRAGE蛋白质之间的 相互作用从而尤其是在细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡受到干扰、特别是在L0X 和NRAGE之间的相互作用发生缺失或改变的情况下调节细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之 间的平衡的组合物中的用途。2. 有效量的至少一种调节具有SEQ ID No. 1序列的L0X表达和/或活性和/或调节具有 SEQ ID No.2序列的NRAGE表达和/或活性的物质在制备在L0X和NRAGE之间的相互作用发生 缺失或改变的情况下用于改善L0X和NRAGE蛋白质之间的相互作用的组合物中的用途。3. 有效量的至少一种调节具有SEQ ID No.2序列的至少一种NRAGE蛋白质表达和/或活 性并任选调节具有SEQ ID No. 1序列的L0X蛋白质表达和/或活性的物质在制备用于预防或 治疗其中细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡发生缺失或改变的疾病的组合物中的 用途。4. 根据权利要求1 一3中任一项的用途，其特征在于上皮细胞、特别是角质细胞中的L0X 的表达和/或活性和/或NRAGE的表达和/或活性被调节。5. 根据权利要求1 一4中任一项的用途，其特征在于所述物质用于调节L0X蛋白质和 NRAGE蛋白质之间的相互作用，所述相互作用特别是在NRAGE蛋白质IRD域中的相互作用。6. 根据权利要求1 一 5中任一项的用途，其特征在于L0X和NRAGE之间的相互作用包括通 过L0X操控的酶催化的NRAGE聚合，特别是二聚。7. 根据权利要求1 一 5中任一项的用途，其特征在于L0X和NRAGE之间的相互作用是通过 干扰L0X的催化活性所产生的作为其他分子活化剂的H 2〇2的产生，所述其他分子特别是中性 鞘磷脂酶或NF-kB。8. 根据权利要求1 一 5中任一项的用途，其特征在于LOX和NRAGE之间的相互作用是通过 干扰L0X的非酶活性，特别是L0X无功能性原区域的活性。9. 根据权利要求1 一8中任一项的用途，用于治疗和/或预防选自下列的疾病:细胞暴露 于应急状态，特别是细胞暴露于热，或细胞暴露于福射，特别是暴露于太阳福射，或细胞暴 露于毒性物质，例如化学毒性物质或微生物毒性物质；皮肤老化；扁平癣;移植物抗宿主疾 病(GVH)，湿疹;牛皮癣和癌症，特别是上皮细胞癌。10. 根据权利要求1 一 9中任一项的用途，用于在细胞增殖过度的情况下减少增殖，特别 是癌症，特别是基底细胞型和刺细胞型上皮细胞癌，特别是皮肤上皮细胞癌。11. 根据权利要求1 一 9中任一项的用途，用于在细胞凋亡增加的情况下减少表皮细胞 凋亡，特别是在皮肤老化过程中，在皮肤暴露于应急状态时，特别是暴露于热，或皮肤暴露 于辐射，特别是暴露于太阳辐射，或皮肤暴露于毒性物质，例如化学毒性物质或微生物毒性 物质;或移植物抗宿主疾病(GVH)。12. 根据权利要求1 一 9中任一项的用途，用于在表皮细胞增殖过少的情况下增加细胞 增殖，特别是在皮肤老化过程中，皮肤暴露于热，或皮肤暴露于辐射，特别是暴露于太阳辐 射，或移植物抗宿主疾病(GVH)。13. 根据权利要求1 一9中任一项的用途，用于在下列情况下刺激L0X的表达并任选抑制 NRAGE的表达:在皮肤老化过程中，在皮肤暴露于应急状态时，特别是暴露于热，或皮肤暴露 于辐射，特别是暴露于太阳辐射，或皮肤暴露于毒性物质，例如化学毒性物质或微生物毒性 物质，或移植物抗宿主疾病(GVH)。14. 根据权利要求1 一9中任一项的用途，用于刺激表皮NRAGE的表达和/或活性并任选 抑制LOX的表达和/或活性，从而用于预防或治疗牛皮癣和湿疹。15. 根据权利要求1 一 9中任一项的用途，用于刺激LOX和NRAGE的表达从而用于预防或 治疗癌症，特别是基底细胞型和刺细胞型上皮细胞癌，特别是皮肤上皮细胞癌。16. 根据权利要求1 一 15中任一项的用途，其特征在于所述组合物为化妆用组合物、营 养用组合物、皮肤药用组合物或药用组合物。17. 根据权利要求1 一 16中任一项的用途，其特征在于所述细胞增殖、细胞分化和细胞 凋亡之间的平衡为角质细胞的细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡。18. 根据权利要求1 一 17中任一项的用途，其特征在于所述物质选自下列物质或植物的 提取物：大豆、麻黄(草麻黄(Ephedra sinica))、啤酒花(Humulus Lupulus)、肉桂(樟属 (Cinnamomum spp))、白色阜角草（Saponaire blanche)(石头花属（Gypsophila ssp))、红 色檀香(Pterocarpus santalinus)、泻根（Bryonia dioica)、小枸骨叶冬青（Petit Houx) (假叶树（Ruscus aculeatus))、梓檬（Citrus limonia) 'Mandarine (橘子（Ci trus reticulata))、反式-3-己稀酸乙酯、Khella(阿密茴(Amni Visnaga))、藻酸、胡萝KDaucus Carota)、2_甲基丁酸甲酯、中国八角茴香(Badianier de chine)(八角茴香（Illicium verum))、柏(地中海柏木(Cupressus sempervirens))、树胶(une gomme Asae Foetida)、 木糖醇、黑刺李树(Prunellier)(黑刺李(Prunus spinosa))、欧洲草莓树(Arbousier)(草 莓树(Arbutus unedo))、鹿蹄草(Pyrole)(伞形喜冬草(Chimaphila umbellata))、香车叶 草（Asperule odorante)(Asperula odorata)、艾蒿（Ar mo ise)(北艾（Artemisia vulgaris))、接骨木（Sureau)(西洋接骨木（Sambucus nigra))、中国白菜（Brassica Brassica campestris var .Pekinensis)、苏里南苦木（Quassia de Surinam) (Cassia amara)、可可树（Cacoyer)(可可（Theobroma cacao))、糖丝（Serica)、红色康契 (Salsepareille rouge) (Smilax ornata)、酉昔栗(Groseille)(红酉昔栗(Ribes rubrum))、维 菊（Pyrethre)(南欧派利吞草（Anacyclus pyrethrum))、茴香（Fenouil) (Foeniculum) 〇19. 鉴定用于调节LOX和NRAGE之间的相互作用从而用于预防或治疗至少一种其中细胞 增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡发生缺失或改变的状态的活性成分的方法，其特征 在于： 一将活性成分与至少一种能够表达L0X蛋白质（SEQ ID No.l)和/或NRAGE蛋白质（SEQ ID No.2)的活细胞接触，和 一分析L0X和/或NRAGE的表达， 特别是用于鉴定调节L0X和/或NRAGE表达和/或活性从而用于改善细胞增殖、细胞分化 和细胞凋亡之间的平衡的活性成分。20. 鉴定用于调节L0X和NRAGE之间的相互作用从而在L0X和NRAGE之间的相互作用发生 缺失或改变的情况下改善L0X蛋白质和NRAGE蛋白质之间的相互作用的活性成分的方法，其 特征在于： 一将活性成分与至少一种能够表达L0X蛋白质（SEQ ID No.l)和/或NRAGE蛋白质（SEQ ID No.2)的活细胞接触，和 一分析L0X和/或NRAGE的表达， 特别是用于鉴定调节LOX和/或NRAGE表达和/或活性从而用于在LOX和NRAGE之间的相 互作用发生缺失或改变的情况下改善L0X蛋白质和NRAGE蛋白质之间的相互作用的活性成 分。21. 根据权利要求19或20的鉴定方法，其特征在于所述平衡为细胞增殖、细胞分化和细 胞凋亡之间的平衡，所述活细胞能够表达L0X蛋白质和/或NRAGE蛋白质，或者L0X蛋白质和 NRAGE蛋白质之间的相互作用在与活性成分接触前发生了缺失或改变。22. 根据权利要求19 一 21任一项的鉴定方法，其特征在于所述活细胞为上皮细胞，特别 是角质细胞。23. 根据权利要求19 一 22任一项的鉴定方法，其特征在于所述方法包括分析L0X和/或 NRAGE的信使RNA的表达。24. 根据权利要求19 一 23任一项的鉴定方法，其特征在于所述方法包括采用定量RT-PCR，特别是采用下列引物： 对于L0X基因： 正向引物ACGTACGTGCAGAAGATGTCC 反向引物GGCTGGGTAAGAAATCTGATG 对于NRAGE基因： 正向引物TGCACAGACATCAGCAGATGG 反向引物TTCACGGATGATATCTCTCAGC。25. 制备组合物的方法，该方法包括 一采用根据权利要求19 一 24中任一项的鉴定方法鉴定调节L0X和/或NRAGE表达和/或 活性从而用于改善细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡的活性成分， 一将活性成分与至少一种用于制备化妆用组合物、营养组合物、皮肤药用组合物或药 用组合物的赋形剂混合，所述组合物用于预防或治疗至少一种其中细胞增殖、细胞分化和 细胞凋亡之间的平衡发生缺失或改变的状态。26. 制备组合物的方法，该方法包括 一采用根据权利要求19 一 24中任一项的鉴定方法鉴定调节L0X和/或NRAGE表达和/或 活性从而用于改善L0X蛋白质和NRAGE蛋白质之间的相互作用的活性成分， 一将活性成分与至少一种用于制备化妆用组合物、营养组合物、皮肤药用组合物或药 用组合物的赋形剂混合，所述组合物在L0X和NRAGE之间的相互作用发生缺失或改变的情况 下用于改善L0X蛋白质和NRAGE蛋白质之间的相互作用。27. 对NRAGE进行定位的方法，该方法包括采用至少一种抗NRAGE的抗体检测和定位 NRAGE的存在，特别是在至少包括角质细胞的重构皮肤模型中，或在皮肤切片中，优选在证 明表皮存在细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡之间的平衡发生缺失或改变状态的人的皮肤切 片中。 28. NRAGE抗体在制备用于检测细胞、特别是上皮细胞、优选角质细胞NRAGE表达的调节 的组合物中的用途。29. 根据权利要求28的用途，其特征在于所述组合物用于检测其中细胞增殖、细胞分化 和细胞凋亡之间的平衡或者L0X和NRAGE之间的相互作用发生缺失或改变的状态，特别是表 皮水平上的缺失或改变，所述状态选自：细胞暴露于应急状态，特别是细胞暴露于热，或细 胞暴露于辐射，特别是暴露于太阳辐射，或细胞暴露于毒性物质，例如化学毒性物质或微生 物毒性物质，皮肤老化，扁平癣，移植物抗宿主疾病(GVH)，湿疹，牛皮癣和癌症，特别是基底 细胞型或棘细胞型上皮癌，尤其是皮肤上皮癌D
【文档编号】G01N33/573GK105963184SQ201610410912
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2006年10月26日
【发明人】C·布埃, C·格莱扎尔, I·奥利, V·安德烈, P·佐默, C·雷梅尔米耶, O·达穆尔, E·佩里尔
【申请人】巴斯夫美容护理法国公司, 科学研究国家中心, 克洛德贝纳尔里昂第大学, 克洛德贝纳尔里昂第一大学