用于制备糖-蛋白质糖缀合物的方法
【专利摘要】本发明提供了用于还原胺化多糖的还原端处的羰基的方法，其中所述还原胺化在pH4至5之间进行。本发明还提供了用于制备多糖和载体分子的缀合物的方法，其包括步骤：(a)使多糖与连接体偶联，以形成多糖-连接体化合物，其中连接体的游离端是酯基；和(b)使酯基与载体分子中的伯氨基反应，以形成多糖-连接体-载体分子缀合物，其中所述连接体通过酰胺键与载体分子偶联。本发明还提供了减少未反应的连接体污染多糖-连接体化合物的方法，其包括在小于pH5的含水条件下沉淀未反应的连接体的步骤。本发明还提供了通过这些方法获得的或者可获得的多糖-连接体-载体分子缀合物和中间化合物。
【专利说明】用于制备糖-蛋白质糖缀合物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及缀合的糖领域，特别是来自革兰氏阴性菌的脂多糖的核心结构域，以及用于形成复合糖的载体。可将复合糖用于免疫接种。
[0002]发明背景
[0003]已经将来自细菌的糖用于疫苗多年。然后，由于糖是非T细胞依赖性抗原，所以它们免疫原性差。与载体缀合可以将非T细胞依赖性抗原转变成T细胞依赖性抗原，从而增强记忆应答，并允许产生保护性免疫。因此，最有效的糖疫苗是基于复合糖的，并且原型结合疫苗(prototype conjugatevaccine)是针对流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae) b型(‘Hib’ )的[例如参见参考文献64的第14章]。
[0004]革兰氏阴性菌由含脂多糖的外膜围绕。脂多糖是作为内毒素并在哺乳动物中诱发强免疫应答的一组分子。每一脂多糖包含三个部分:0-抗原(也称为O-特异多糖或O-多糖)、核心结构域和脂质A结构域。针对来自特定革兰氏阴性菌的O-抗原的抗体可以赋予针对该细菌感染的保护。因此，已经设想了含有与载体蛋白缀合的O-抗原的疫苗。例如，基于O-抗原的结合疫苗已经建议用于多种沙门氏菌(Salmonellae)(例如，参考文献I和2中的肠沙门氏菌(Salmonella enterica)中的血清型鼠伤寒杆菌(Salmonella Typhimurium)和甲型副伤寒沙门 氏菌(SalmonellaParatyphi A));志贺氏杆菌属(Shigella)[参考文献
3、4、5、6、7、8和9];以及大肠杆菌(Escherichia coli)[参考文献10和11]。在这些疫苗中，O-抗原与来自全长脂多糖的核心结构域连接(即缀合的多糖是没有其脂质A结构域的脂多糖)。多糖通过其核心结构域与载体缀合。该核心结构域自身可以诱导保护性抗体，因此设想结合疫苗含有不与O-抗原连接的核心结构域[参考文献12]。
[0005]已知将含核心结构域的多糖与载体蛋白缀合的多种方法。一些方法涉及通过连接体缀合之前，多糖链的随机活化(例如使用溴化氰(CNBr)或1-氰-4-二甲基氨吡啶四氟硼酸酯(CDAP))(参见例如，参考文献I和2)。其他方法是更有选择性的，涉及该链的特异性残基(例如核心结构域的2-酮-3-脱氧辛酸(KDO)端)。例如，参考文献13的方法涉及KDO端中的羰基与己二酸二酰肼(ADH)连接体之间的还原胺化。涉及还原胺化的反应通常非常慢，例如参考文献13中需要7天的步骤。另一选择性方法描述于参考文献9中，这次涉及通过KDO中的羧基，使用1-乙基-3 - (3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDAC)和ADH的偶联。在这些非选择性和选择性方法中，通常使用EDAC进行与载体的后续反应，EDAC活化蛋白质中的用于与连接体反应的羧基。该EDAC活化可以引起KDO亚基中羧基的活化，导致不想要的副反应。EDAC活化还可以引起载体蛋白的交联，因为蛋白质中活化的羧基可以与蛋白质中的而非连接体中的伯胺基反应。
[0006]因此，仍存在制备缀合物，特别是来自革兰氏阴性菌的脂多糖的核心结构域的其他以及更好的方法的需求。
[0007]发明公开
[0008]本发明基于缀合方法，其可以用于取代现有技术的缀合方法。这些方法可以比现有技术方法，特别是涉及还原胺化的那些方法更快地施行。该方法还不需要使用EDAC，这避免了不想要的副反应。在研发这些方法期间，发明人发现了不需要使用毒性化合物来纯化中间化合物的方法。因此，本方法可以更安全地实施。与现有技术的缀合物相比，得到的缀合物具有不同的，优选地改进的免疫学特性。
[0009]因此，本发明提供了用于将多糖与载体蛋白缀合的备选或改进方法，以及通过这些方法获得或者可获得的缀合物。本发明还提供了用于本发明方法的中间化合物，以及用于制备这些中间化合物的方法。
[0010]本发明的第一方面
[0011]在第一个方面，本发明提供了用于制备多糖和载体分子的缀合物的方法，其包括以下步骤:(a)使多糖与连接体偶联，以形成多糖-连接体中间产物，其中连接体的游离端是酯基；和(b)使酯基与载体分子中的伯胺基反应，以形成多糖-连接体-载体分子缀合物，其中连接体通过酰胺键与载体分子偶联。不同于参考文献1、2和13中所使用的缀合方法，本发明不需要使用EDAC活化载体分子，从而避免了不想要的副反应。本发明还提供了该方法的各个步骤(a)和(b);通过该方法获得的或者可获得的缀合物；以及通过该方法的步骤(a)获得的或者可获得的多糖-连接体中间产物。[0012]本发明第一方面的步骤(a)
[0013]在本发明第一方面的步骤(a)中，将多糖与连接体偶联，以形成多糖-连接体中间产物，其中连接体的游离端是酯基。因此，连接体是这样的连接体，其中至少一个末端是酯基。如下所述，连接体的其他末端是选择性的，以使其可以与多糖反应以形成多糖-连接体中间产物。
[0014]在本发明的一些实施方案中，直接发生步骤(a)中的偶联。在这些实施方案中，通常使用多糖中的伯胺基将多糖与连接体偶联。在这些实施方案中，连接体通常在两个末端均具有酯基。这允许酯基中的一个通过亲核酰基取代与多糖中的伯胺基反应来发生偶联。该反应产生了多糖-连接体中间产物，其中多糖通过酰胺键与连接体偶联。因此在这些实施方案中，连接体是双功能连接体，其提供用于与多糖中伯胺基反应的第一酯基以及用于与载体分子中伯胺基反应的第二酯基。例如，可以使用通式X1-L-X2的双功能连接体，其中X1是可以与多糖中的伯胺基反应的酯基；X2是可以与载体分子中的伯胺基反应的酯基；并且L是连接体中的连接部分。一般的L基团是具有1-10个碳原子的直链烷基(例如C1X2'C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C1(I)，特别地-(CH2) 4_。通式X-L-X的同型双功能连接体是特别合适的，其中两个X基团是一模一样的，并且能与两个伯胺基反应；并且其中L是连接体中的连接部分。一般的X基团是N-氧丁二酰亚胺。L通常具有通式-L’-L2-L’-，其中L’是羰基。一般的L2基团是具有1-10个碳原子的直链烷基(例如Cp C2、C3> C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)，特别地-(CH2)4-。因此，一般的连接体是己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯(adipic acid Nhydroxysuccinimide diester) (SIDEA),并且发明人发现该化合物特别适合作为本发明的
连接体:
[0015]
【权利要求】
1.用于还原胺化多糖的还原端处的羰基的方法，其中所述还原胺化在pH4至PH5之间进行。
2.权利要求1的方法，其中所述羰基在所述多糖的还原端处的KDO亚基内。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述多糖包含来自革兰氏阴性菌脂多糖的核心结构域。
4.权利要求3的方法，其中所述多糖包含与所述核心结构域连接的来自革兰氏阴性菌的脂多糖的O-抗原。
5.权利要求3或权利要求4的方法，其中所述脂多糖来自沙门氏菌属(Salmonella)细菌。
6.权利要求5的方法，其中所述脂多糖来自甲型副伤寒杆菌(S.Paratyphi A)、鼠伤寒杆菌(S.Typhimurium)或肠炎沙门菌(S.Enteritidis)。
7.权利要求1的方法，其中所述多糖是细菌荚膜多糖。
8.权利要求7的方法，其中所述细菌荚膜多糖来自脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清组 X。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述还原胺化包括所述羰基与通式为Y1-L-Y2的双功能连接体中的Y1反应，以形成多糖-双功能连接体化合物，其中所述多糖通过C-N键与所述双功能连接体偶联，其中:所述Y1包含可与所述多糖中的羰基反应的伯胺基；所述Y2包含第二反应基团例如伯胺基或-SH基团；并且L是连接部分。
10.权利要求9的方法，其中所述Y1和Y2均是-NHNH2基团。
11.权利要求10的方法，其中所述L具有通式-L’-L2-L’-，其中所述L’是羰基，并且所述L2是具有1至10个碳原子的直链烷基。
12.权利要求11的方法，其中所述L2是-(CH2)4_。
13.权利要求10的方法，其中所述L是羰基。
14.通过权利要求9至13中任一项的方法获得的多糖-双功能连接体化合物。
15.用于制备多糖和载体分子的缀合物的方法，其包括步骤:(a)将所述多糖与连接体偶联，以形成多糖-连接体化合物，其中所述连接体的游离端是酯基；和(b)使所述酯基与所述载体分子中的伯胺基反应，以形成多糖-连接体-载体分子缀合物，其中所述连接体通过酰胺键与所述载体分子偶联，特别地，其中所述多糖包含(i)来自革兰氏阴性菌的脂多糖的核心结构域或(ii)来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组X的荚膜多糖。
16.权利要求15的方法，其中所述多糖包含来自革兰氏阴性菌的脂多糖的核心结构域，所述连接体在两个末端均具有酯基，并且所述多糖通过以下方式与所述连接体偶联，以形成多糖-连接体化合物:所述酯基中的一个通过亲核酰基取代与所述核心结构域中的伯氨基反应，其中所述多糖通过酰胺键与所述连接体偶联。
17.权利要求16的方法，其中所述连接体具有通式X1-L-X2，其中所述X1是可以与所述核心结构域中的伯氨基反应的酯基；所述X2是酯基；并且所述L是连接部分。
18.权利要求17的方法，其中所述L是具有1至10个碳原子的直链烷基。
19.权利要求18的方法，其中所述L是-(CH2)4_。
20.权利要求17至19中任一项的方法，其中所述X1-L-X2是己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯。
21.权利要求16至20中任一项的方法，其中所述多糖是如权利要求4至6中任一项限定的多糖。
22.权利要求17至21中任一项的方法，其中所述脂多糖来自甲型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌或肠炎沙门菌，并且所述伯氨基在焦磷酸乙醇胺基团内。
23.权利要求15的方法，其中使用其他连接体进行所述步骤(a)，所述其他连接体在与所述连接体偶联之前用于衍生所述多糖。
24.权利要求23的方法，其中所述其他连接体在两个末端均具有伯氨基，并且所述多糖通过以下方法使用所述多糖的还原端处的羰基与所述其他连接体偶联，所述方法包括两步:(&1)所述羰基通过还原胺化与所述其他连接体中的伯氨基中的一个反应，以形成多糖-其他连接体化合物，其中所述多糖通过C-N键与所述其他连接体偶联；和(a2)使所述其他连接体的游离端与所述连接体反应。
25.权利要求24的方法，其中所述还原胺化根据权利要求1的方法进行。
26.权利要求23的方法，其中所述其他连接体在两个末端均具有伯氨基，并且所述多糖通过以下方法使用所述多糖中的羧基与所述其他连接体偶联，所述方法包括两步:(?)所述羧基通过EDAC活化与所述其他连接体中的伯氨基中的一个反应，以形成多糖-其他连接体化合物，其中所述多糖通过酰胺键与所述其他连接体偶联；和(a2)使所述其他连接体的游离端与所述连接体反应。
27.权利要求23至26中任一项的方法，其中所述其他连接体是权利要求9至13中任一项定义的双功能连接体。
28.权利要求24至27中任一项的方法，其中所述连接体在两个末端均具有酯基，并且所述步骤(a2)包括所述酯基中的一个通过亲核酰基取代与所述其他连接体的游离端处的伯氨基反应，以形成多糖-连接体化合物，其中所述多糖通过所述其他连接体与所述连接体偶联，其中所述其他连接体通过酰胺键与所述连接体偶联。
29.权利要求15和权利要求23至28中任一项的方法，其中所述连接体是权利要求16至20中任一项定义的连接体。
30.权利要求15和权利要求23至29中任一项的方法，其中所述多糖是如权利要求2至8中任一项限定的多糖。
31.权利要求15至30中任一项的方法，其中所述载体分子是白喉毒素、破伤风毒素、类毒素或其突变体。
32.权利要求31的方法，其中所述载体分子是CRM197白喉毒素突变体。
33.通过权利要求15至32中任一项的方法获得的多糖-连接体-载体分子缀合物。
34.在权利要求15至30中任一项的方法中获得的多糖-连接体化合物。
35.在权利要求24至30中任一项的方法中获得的多糖-其他连接体化合物。
36.用于减少未反应的连接体污染根据权利要求34的多糖-连接体化合物的方法，其包括在小于PH5的含水条件下沉淀未反应的连接体的步骤。
37.权利要求36的方法，其中所述沉淀在pH2至5之间，特别地在pH4至5之间进行。
38.权利要求36或权利要求37的方法，其中所述pH通过添加含水缓冲液，特别地柠檬酸缓冲液获得。
39.权利要求36或权利要求37的方法，其中所述pH通过添加HCl获得。
40.权利要求36至38中任一项的方法，其中所述沉淀在具有>60%含水量(体积/体积)的水溶液中进行。
41.权利要求36至39中任一项的方法，其中所述沉淀通过离心去除。
42.权利要求36至41中任一项的方法，其中所述多糖-连接体化合物通过使用醇沉淀从溶液中回收。
43.权利要求42的方法，其中所述醇是乙醇或2-丙醇。
44.权利要求43的方法，其中将所述醇加入到含所述多糖-连接体化合物的溶液中，以产生80%至95%之间的乙醇或2-丙醇(体积/体积)的终浓度。
45.权利要求44的方法，其中沉淀的所述多糖-连接体化合物通过离心回收。
46.根据权利要求36至45中任一项的方法，其中所述方法在权利要求15至32中任一项的步骤(a)和(b)之间 进行。
【文档编号】C08B37/00GK103917245SQ201280054487
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年9月14日 优先权日:2011年9月14日
【发明者】A·索尔, F·米科利 申请人:诺华股份有限公司