血清变型4型副猪嗜血杆菌疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明是一种对抗血清变型4型副猪嗜血杆菌的疫苗，其作为灭活疫苗施用于猪时能够触发保护性免疫应答。本发明也是一种用于猪疫苗接种对抗血清变型4型副猪嗜血杆菌感染的方法，其通过a)克隆性繁殖能够触发对抗血清变型4型副猪嗜血杆菌感染的免疫应答的一个或多个细胞，所述免疫应答保护猪对抗副猪嗜血杆菌感染，以及b)将免疫学上有效量的所述细胞和兽医学上可接受的载体混合成适于作为猪的疫苗进行施用的形式，以及c)作为灭活疫苗进行施用来用于猪疫苗接种对抗血清变型4型副猪嗜血杆菌感染。细胞培养物来自致病性亲本株。
【专利说明】血清变型4型副猪嗜血杆菌疫苗
[0001] 关于序列表的声明
[0002] 以文本格式代替纸件副本提供与本申请相关的序列表，并且其通过引用并入本说 明书中。含有序列表的文本文件的名称为"H parasuis genomic-Paul Lawrence_ST25"。该 文本文件为8，732KB;其创建于2013年10月2日；并且其与提交说明书一起通过EFS-网络 (EFS-Web)被电子递交。
[0003] 发明背景
[0004] 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是γ -变形菌并且被分类于巴斯德氏菌科 (Pasteurellaceae)中。副猪嗜血杆菌(H. parasuis)是一种杆状、非溶血的、革兰氏阴性烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖性细菌(Biberstenia和White，1969;Nicolet 1992)。副猪 嗜血杆菌是健康猪上呼吸道的共生菌。它也是一种重要的病原体，并且是革拉斯氏病 (Glasser ' s disease)的病原学因素，革拉斯氏病的典型特征为纤维蛋白性多衆膜炎、多关 节炎、脑膜炎以及有时急性肺炎和败血症（Amano等人，1994; Peet等人，1983; Little， 1970)。这种疾病是美国和全世界范围内猪产业中猪死亡的主要病因之一，造成了巨大的经 济损失。
[0005] 近期研究已经证明，无毒株在上呼吸道中比强毒株更普遍，但是，它们不能被保护 从而对抗由强毒株引起的全身感染。
[0006] 基于热稳定性抗原以及凝胶扩散测试数据，迄今已经鉴定出副猪嗜血杆菌的15个 血清变型，但是野外分离物中仍有很高百分比是不可分型的（Kielstein和Rapp-Gabriel S〇n，1992)。副猪嗜血杆菌的不同血清变型表现出不同的毒力，范围为从高度强毒 到无毒。在世界范围内，血清变型5型株是在被识别的15个血清变型中比任何其他血清变型 更频繁被分离出来的。血清变型5型株也频繁从猪的呼吸感染和全身感染被分离出，并且高 度强毒（Rapp-Gabrielson和Gabrielson，1992;BIacka 11等人，1996;Oliveira，2003)。此 外，它最近已经作为全世界范围内猪产业中新生猪死亡的主要病因之一出现。
[0007] Newport实验室使用一种高度强毒的血清变型5型北美野外分离物开发了一种对 抗副猪嗜血杆菌感染的商业疫苗(ParaSail)。在美国，当将这种疫苗按照推荐由猪生产者 使用时，这种疫苗在减轻副猪嗜血杆菌感染方面高度有效。然而，近期已经有报道称，使用 这种疫苗的美国中西部少量农场暴发了重症肺炎。由Newport实验室在2011-2012年暴发期 间获得组织样品得到了高度强毒的血清型4型副猪嗜血杆菌株。尽管内部攻击实验结果表 明，当在IO 9CFU/剂量使用ParaSail疫苗时，ParaSail疫苗可以有效地保护猪对抗血清型4 型副猪嗜血杆菌株，但当时仍不清楚暴发的原因。
[0008] 与巴斯德氏菌科的其余成员一样，副猪嗜血杆菌拥有大量的毒力基因和毒力相关 基因。这些包括脂多糖(LPS)、荚膜多糖、黏附素/菌毛、外膜蛋白、神经氨酸酶、铁和重金属 的捕获和转运系统（Amano等人，1994; Biberstein，1990; Munch等人，1992 ; Zucker等人， 1996 !Morozumi和Nicolet，1986)。然而由于涉及复杂的基因调控机制，这些候选毒力因子 内在的分子基础仍没有被完全阐述清楚。猪副嗜血杆菌在分子水平表现出高度异质性，这 主要是因为重组或横向基因转移。为了在分子水平上阐明2011-2012年中西部暴发背后可 能的原因，我们对两株血清型4型猪副嗜血杆菌分离物的基因组进行了测序，并针对我们的 Parasail疫苗株(用作参照;SEQ ID NO. 1)进行了3通道(3-way)比较基因组分析。两株血清 型4型猪副嗜血杆菌分离物获得自Newport实验室的案例编号为12-1322(SEQ ID NO.2; GenBank登录号JJNQ00000000;ST4-1)和n-1398-2(SEQ ID N0.3;GenBank登录号 JJNR00000000；ST4-2)〇
[0009] 尽管当时无论控制暴露后保护性免疫所涉及的机制还是提供保护性免疫的抗原 的身份均不清楚，但是仍然知晓这样的暴露能够诱导保护性免疫。
[0010] 猪肉产业急需一种安全且有效的产品，其能够帮助预防疾病，特别是血清型4型猪 副嗜血杆菌。
[0011] 发明概述
[0012] 在一个方面，本发明提供了一种血清变型4型副猪嗜血杆菌的疫苗，其包含兽医学 上可接受的载体和免疫学上有效量的灭活细菌疫苗或者细菌细胞培养物，所述免疫学上有 效量的灭活细菌疫苗或者细菌培养物能够触发免疫应答，所述免疫应答保护猪对抗副猪嗜 血杆菌感染。在另一个方面，本发明提供了一种疫苗，其中所述细菌疫苗或细菌细胞培养物 的DNA序列包括SEQ ID N〇:2。在另一个方面，本发明提供了一种疫苗，其中所述细菌疫苗或 细菌细胞培养物的DNA序列包含SEQ ID N〇:3。在另一个方面，本发明的疫苗包括对抗血清 变型5型副猪嗜血杆菌的ParaSail疫苗。
[0013] 在另一个实施方案中，本发明是一种用于猪疫苗接种对抗血清变型4型副猪嗜血 杆菌感染的方法，其包括步骤a)克隆性繁殖能够触发对抗血清变型4型副猪嗜血杆菌感染 的免疫应答的一个或多个细胞，所述免疫应答保护猪对抗副猪嗜血杆菌感染，以及步骤b) 将免疫学上有效量的所述细胞和兽医学上可接受的载体混合成适于作为猪的疫苗进行施 用的形式，以及步骤c)作为灭活疫苗进行施用。在一个方面，用灭活疫苗用于猪疫苗接种的 方法包括SEQ ID No:2的DNA序列。在另一个方面，用灭活疫苗用于猪疫苗接种的方法包括 SEQ ID NO.3的DNA序列。在又一个方面，用于猪疫苗接种的方法包括施用对抗血清变型5型 副猪嗜血杆菌的Parasail疫苗。
[0014] 附图的简要说明
[0015] 图1:文氏图（Venn diagram)表示的是，与ParaSail疫苗（SEQ ID NO. 1)相比，副猪 嗜血杆菌ST4分离物 12-1322(即ST4-1;SEQ ID N0.2)和 11-1398-2(即ST4-2;SEQ ID N0.3) 中特有的基因数量。
[0016] 发明详述
[0017]
【申请人】已经发现，市售可得的对抗副猪嗜血杆菌(血清变型5型）的Parasail疫苗 接种猪可能不足以对抗突变株血清变型4型副猪嗜血杆菌（即ST4)。本发明提供一种可以触 发保护猪对抗副猪嗜血杆菌ST4感染的免疫应答的灭活疫苗。
[0018] 本发明进一步提供了一种用于制备保护猪对抗血清变型4型副猪嗜血杆菌感染的 疫苗的方法，其包括选择并克隆性繁殖能够触发对抗血清变型4型副猪嗜血杆菌感染的免 疫应答的一个或多个细胞，当作为灭活疫苗施用时所述免疫应答保护猪对抗副猪嗜血杆菌 感染，以及将免疫学上有效量的所述细胞和兽医学上可接受的载体混合成适于作为猪的活 疫苗进行施用的形式。
[0019] 实施例1
[0020]本研究的目的是确定用ParaSail单独或与自身细菌疫苗联合接种的猪是否被保 护而对抗与4型副猪嗜血杆菌(H.parasuis) (11-1398-2; SEQ ID NO. 3)相关的疾病。本研究 包括三个组;A组(n = 15)按标签指示接受ImL ParaSail和ImL 4型自身细菌疫苗，B组(η = 15)按标签指示接受ImL ParaSail，2周后接着接受ImL 4型自身细菌疫苗，以及C组(η=14) 按标签指示接受ImL ParaSail (用Quil和Trigen进行佐剂化）。最后一组(D) (η= 13)作为未 接种疫苗的对照组。所有登记的猪在初始接种后40天均用4型副猪嗜血杆菌（11-1398-2; SEQ ID NO.3)野外株进行攻击。每天观察受攻击动物的疾病的临床症状和死亡。攻击之后 五天所有存活下来的动物被处死并尸体剖检。记录具有副猪嗜血杆菌的典型病变的动物。 [00 21 ] ParaSail在其与自身4型配对时比ParaSail被单独给予时保护得更好。此外，同一 天施用的Parasail和4型副猪嗜血杆菌细菌疫苗比2周后提供更好的保护。
[0022] 目的
[0023]本研究的目的是确定用ParaSail按照标签指示施用和/或与自身细菌疫苗配对施 用时，ParaSail是否保护免受与血清变型4型副猪嗜血杆菌野外分离物（11-1398-2; SEQ ID NO. 3)相关的疾病的侵害。
[0024]材料和方法
[0025] 所使用的Parasail疫苗是释放型ParaSail系列（15B030710)。该系列疫苗均通过 了Newport实验室的质量控制设施中USDA所要求的全部测试。该系列的效价为8.171og/剂 量。
[0026]自身细菌疫苗：通过生长分离物ll-1398-2(SEQIDN0.3)的活培养物并且根据 Newport实验室的用于副猪嗜血杆菌抗原生产的标准操作规程灭活培养物制备同源灭活疫 苗。效价为约8.41og/剂量。
[0027]动物:从中西部猪研究中心(普林斯顿站)收到67只17-21日龄的猪。在接种时，所 有猪均是健康且正常的。
[0028] 预攻击:将一组10只猪在单独的房间中饲养并且在研究攻击之前一周进行攻击。 该组帮助确定合适的攻击滴度。5只猪接受ImL IP和ImL IV的2.451og培养物，5只猪接受 ImL IP和ImL IV的3.41og培养物。就疾病的临床症状和死亡观察动物5天。结果概括于表1 中。
[0029] 表 1
[0031]基于预攻击的结果，选择约2.451og的攻击滴度。
[0032] 攻击:攻击株是通过Prestage Farms收到的野外分离物。该株是在MVP实验室分离 自猪的肺组织并被确认为4型副猪嗜血杆菌。所有猪在攻击当天都接受ImL IV和ImL IP的 2.78 log培养物。表2概括了事件的日程表。
[0033]表 2
[0035] ~处理组:
[0036] A.ParaSail+自身4型：同时进行施用，在颈部任一侧施用lmL(n = 15)。
[0037] B.ParaSail+自身4型：在第0天给予ParaSai 1，在第12天给予自身型(η = 15)。
[0038] C.仅ParaSail:用Quil和Trigen进行佐剂化（1 个剂量）（η = 14)。
[0039] D.对照（η = 13)。
[0040] 观察：
[0041] 攻击后每天观察猪的与副猪嗜血杆菌相关的临床症状，包括跛行、呼吸困难、呕吐 和猝死。所有的观察由不知道处理组分配情况的研究人员实施和记录。出于人道原因，将任 何不能起立的猪进行安乐死。
[0042]尸体剖检：
[0043]在研究观察时间段期间，任何被发现死亡或者被安乐死的猪都被设为具有内部病 变，包括腹膜炎、胸膜炎、和/或心包炎。在攻击后5天，所有存活下来的猪均被安乐死并进行 尸体剖检。总(gross)病变(包括腹膜炎、胸膜炎、心包炎，和关节肿胀)的存在都被记录。
[0044] 分析：
[0045] 由Tammy Kolander使用SAS软件进行统计分析。
[0046] 应用t-检验和Tukey HSD全成对比较接种疫苗组和对照组之间临床症状、死亡、和 病变的存在。表3概括了针对临床症状、死亡、和总病变所搜集的原始数据。
[0047] 表 3
[0049]统计分析的结果表明接种疫苗猪和对照猪之间在以下方面存在显著差异：
[0050]临床症状(包括死亡）：t_检验发现，对照组与所有其他处理组均存在显著差异，但 是所有其他处理组(A-D)彼此之间却不存在显著差异。Tukey's全成对比较发现，仅对照组 和A组互相存在显著差异，而任意其他组合之间不存在差异。
[0051 ] 观察期间的死亡:t-检验显示对照组(D组)与B组之间以及对照组(D组)与A组之间 存在显著差异。任意其他组之间不存在显著差异。Tukey's全成对比较结果表明，A组和对照 组存在显著差异;任意其他组之间不存在差异。
[0052]尸体剖检（和观察期间死亡）时病变:t_检验显示对照组与A-C组之间存在显著差 异，而A-C组之间不存在显著差异。Tukey's全成对比较结果表明，对照组和A组以及对照组 和B组之间存在显著差异。
[0053]研究了由副猪嗜血杆菌引起疾病存在的三个参数:观察期间的临床症状、观察期 间的死亡、和尸体剖检时病变的存在。两种不同的统计检验被用来比较每组之间的每个参 数。结果清楚地显示与Parasil制剂一起施用4型副猪嗜血杆菌细菌疫苗的优势。添加4型副 猪嗜血杆菌细菌疫苗可以显著减少肺部病变、临床症状以及降低由于死亡所带来的损失。 [0054] 基因组DNA测序
[0055] 使用细菌基因组DNA分离试剂盒(Edge Biosystems)分离两株副猪嗜血杆菌ST4野 外株（12-1322;SEQ ID N0.2和 11-1398-2;SEQ ID N0.3)和ParaSail疫苗（血清型5，ST5; SEQ ID NO. 1)的基因组DNA，并使用Illumina HiSeq paired end 50(PE50)对基因组DNA进 行测序。
[0056] 序列分析
[0057] 副猪嗜血杆菌ParaSail疫苗和Genbank ST5分离物SH0165(登录号CP001321.1)用 作参照基因组。下载GenBank分离物的基因组序列，并且使用ABACAS (http:// abacas, sourceforge .net/)来比对SHO165重叠群（contigs)并且鉴定重叠群的推定缺口的 大小、方向以及顺序。然后使用定制Python脚本拼接(concatenate)重叠群，用N填充缺口， 并传送注释。向所得序列中添加附加注释以表示缺口并标记原始重叠群。不能与针对参照 进行比对的重叠群被包括在所拼接序列的末端。
[0058]使用定制Python脚本就质量过滤读数。弃去低质量读数(任何PHRED质量〈20的含 有5个或更多个碱基的读数被认为是低质量读数）。由于非常高的覆盖，预期存在重复读数 并且只有存在至少2个重复时才保留读数。每个读数最多保留10个重复。质量过滤后，读数 被针对SH0165进行作图，使用SH0165作为参照对一组拼接的重叠群进行比对和定向。使用 Bowtie2v2.0.6对读数进行作图。以缺省参数使用bowtie2将每个分离物的读数针对猪副嗜 血杆菌ParaSail疫苗（HSP_ref)进行作图。然后使用定制脚本进行过滤以除去多次 (multiply)被作图的读数并且MAPQ〈10。
[0059] 然后，使用SAMtools包进一步分析来自Bowtie2的序列比对/图（SAM)输出以检出 (call)变体。然后，使用其中变体基于其在基因组内部的位置注释的以R编写的定制脚本， 进一步分析所得到的变体检出。变体还基于覆盖深度和由SAMtools报告的基因型质量进行 过滤。SAMtools还用来基于作图结果生成共有序列。采用参照序列对该序列进行注释并且 由于Artemis兼容性，使用定制脚本和BioPython将该序列格式化为Genbank文件。
[0060] 鉴定不能使用Bowtie2对参照进行作图的读数（由大约10%的读数组成）并使用 Roche GsAssembler(Newbler)v2 · 6进行组装。对于S1322和Sl398，组装的总长度分别为150 和190Kb，且分别由149和194个重叠群组成。使用基因预测程序Prodigal v2.6预测组装的 重组群中的基因，然后使用软件工具BLANN0TAT0R对这些基因给出推测的注释。
[0061 ] 单核苷酸多态性(SNP)和共有检出
[0062] 使用"SAMTools mpileup"流水线鉴定SNP，然后使用定制R脚本进行过滤和注释。 跨三个株鉴定SNP。
[0063] 基因覆盖
[0064] 使用samtools计算参照中每个位置的作图覆盖。然后，基因注释信息用于计算覆 盖每个基因的碱基百分比。其中覆盖少于80%碱基的基因被称为缺失。
[0065]基因覆盖和全面作图
[0066] 在三个分离物中约2328个基因是共有的。有83个基因是parasail疫苗（SEQ ID N0.1)特有的，有48个基因是12-1322(SEQ ID N0.2)特有的，有26个基因是ll-1398-2(SEQ ID NO. 3)特有的，参见图1。
[0067]使用去除5个或更多碱基、具有Q-值〈20的读数的内部脚本针对质量和Illumina TruSeq接头对读数进行过滤。我们针对分离物11-1398-2和12-1322分别获得255x的覆盖和 300x的覆盖。两株副猪嗜血杆菌ST4分离物均对参照Parasail疫苗作图大约90%。
[0068]副猪嗜血杆菌ST4株缺乏一些酶，诸如UDP-葡萄糖-4-差向异构酶、毒素-抗毒素系 统和大量假设蛋白。
[0069] -些重要的酶改变了外膜蛋白（OMP)和脂寡糖(L0S)的结构，这些酶是唾液酸转移 酶、糖基转移酶、多糖生物合成蛋白capD、孢子外壳多糖生物合成蛋白C和多糖输出蛋白。这 些蛋白质参与了血清型确定、免疫逃逸，并充当毒力因子。此外，副猪嗜血杆菌ST4-1(即SEQ ID NO. 2)和ST4-2(即SEQ ID NO. 3)编码也在Newport实验室野生型副猪嗜血杆菌ST5中发 现的其他毒力基因和毒力相关基因。下文讨论与副猪嗜血杆菌ST5和其它病原性细菌相比， 这些蛋白质和基因中每一种的功能意义。
[0070] 唾液酸转移酶
[0071] LOS的唾液酸化已经被认为是通过抑制抗体结合和增强细菌耐受性而成为细菌毒 力因素。在属于巴斯德氏菌科(诸如淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、杜克氏嗜血 杆菌（HaemophiIus ducreyi )、流感嗜血杆菌（HaemophiIus infIuenzae)以及睡眠嗜组织 菌(Histophilus somni))的病原性细菌中编码α-2,3唾液酸转移酶的基因参与LOS生物合 成(Vimr和Lichtensteiger 2002; Inzana等人，2002)。唾液酸化的LOS通过其分子模拟帮助 宿主免疫逃避。另外，病原性细菌也利用连接特异性的唾液酸转移酶(诸如α_2,3连接至半 乳糖，或者α_2,6连接至半乳糖或者N-乙酰半乳糖胺)使其LOS发生唾液酸化以躲避宿主固 有防御机制（Inzana等人，2002)。据推测，唾液酸化的LOS通过抑制TLR-4信号传导途径诱导 显著更少的来自巨噬细胞的细胞因子应答，其进而比去唾液酸化的LOS诱导显著更少的转 录因子NF-k：B(Vimr等人，2000; Severi等人，2007)。
[0072]早期报道显示编码唾液酸转移酶的基因（IsgB)仅存在于强毒副猪嗜血杆菌中，与 缺乏IsgB基因的菌株相比，这些强毒副猪嗜血杆菌也会对血清介导的杀灭作用以及由肺泡 巨噬细胞带来的吞噬作用展现出更高的耐受性(ref)。然而，被变体副猪嗜血杆菌ST4感染 的猪显现出急性肺炎和败血症的症状，其表示作为感染结果的"细胞因子风暴"。另外，纯的 副猪嗜血杆菌ST4培养物获得自组织样品。当小鼠被注射去唾液酸化的出血败血性巴斯德 氏菌(P.multocida)突变体时，所有小鼠在48小时内由于败血症而死亡，这表示过度的免疫 应答。另一方面，注射了唾液酸化的（野生型）出血败血性巴斯德氏菌的小鼠并没有死亡，只 是注射部位有些肿胀(Newport实验室内部报告）。
[0073]副猪嗜血杆菌ST4和ST5缺少唾液酸的从头生物合成，但是基因组编码两个三份 ATP 非依赖性周质转运蛋白（tripartite ATP-independent periplasmic transporter)， Neu5Ac TARP(HPM_1229，HPM_0026)，一个TRAP通透酶(HPM_0027)和CMP-Neu5Ac合成酶基因 (HPM_0608)以及酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶（HPM_1673)，这表示与流感嗜血杆菌 (H. influenza)类似的唾液酸清除机制和CMP-Neu5Ac的合成。
[0074]由于变体副猪嗜血杆菌ST4缺乏α_2,3唾液酸转移酶，我们假设与LOS偶联的唾液 酸的量应该少于ST5。用神经氨酸酶处理细胞后测定与LOS偶联的唾液酸的量。与野生型ST5 相比，变体副猪嗜血杆菌ST4株具有显著更少的连接至LOS的唾液酸残基(数据未显示）。这 些结果与目前唾液酸对副猪嗜血杆菌的毒力是必要的法则相矛盾。当变体ST4-1(即SEQ ID NO. 2)用于攻击研究（15，3周大的仔猪）时，与死亡率为0 %的对照相比，54 %表现出临床症 状并死亡，这清楚地表明LOS唾液酸化对毒力不是必要的。变体副猪嗜血杆菌ST4具有帮助 破坏宿主免疫应答并帮助致发病的其他毒力因子。在下文讨论这些毒力因子和毒力相关因 子。
[0075] 糖基转移酶
[0076] 变体副猪嗜血杆菌ST4缺乏四种糖基转移酶(HPM_1373、HPM_1372和HPM_1370和 HPM_1371)。糖基转移酶催化涉及向蛋白质或者脂类分子添加碳水化合物侧基的反应。向蛋 白质添加碳水化合物残基显著改变蛋白质的生物物理性质和结构性质，如溶解度指数、对 蛋白酶的耐受性、稳定性、与其他蛋白质的相互作用，以及最重要的是病原性细菌的免疫原 性(Lairson等人，2008)。两种重要且常见的蛋白质糖基化类型为N-连接型和0-连接型。N-连接型糖基化是共翻译过程，其涉及将前体寡糖转移到序列段Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)中 的天冬酰胺残基上，其中X可以是除脯氨酸之外的任意氨基酸(Yan和Lennar Z，2005)。相比 之下，〇-连接型糖基化涉及寡糖翻译后转移到丝氨酸或苏氨酸残基上(Van den Steen等 人，1998)。表面蛋白和分泌蛋白中的许多蛋白质被糖基化修饰，其进而影响细菌与它们的 环境和宿主免疫系统如何进行相互作用（Szymanski和Wren，2005; Schmidt等人，2003)。由 于不同群组的糖基化转移酶具有功能重叠，变体副猪嗜血杆菌ST4中缺少糖基化转移酶表 明糖基化的替代途径。但是，许多酶参与细胞壁生物合成，如N-乙酰胞壁酰-三肽合成酶蛋 白（HPM_1513)，乙酰胞壁酸-五肽合成酶（HPM_1514)，磷酸-N-乙酰胞壁酸-五肽转移酶 (HPM_1515) ,UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酸合成酶(HPM_1945)，D-丙氨酸一D-丙 氨酸连接酶(HPM_2304)，UDP-3-0-酰基-N-乙酰葡糖胺脱乙酰酶(HPM_2413)和胞外多糖生 物合成蛋白（HPM_0770)，这些存在的酶跨所有三个分离物是相同的（数据未显示）。突变副 猪嗜血杆菌ST4株中修饰的LOS和OMP的糖基化模式可能帮助躲避吞噬作用。
[0077] 多糖输出蛋白和多糖生物合成蛋白CapD
[0078]多糖输出蛋白和多糖生物合成蛋白作为连续开放阅读框位于副猪嗜血杆菌ST4和 ST5株中。细菌通过复杂的转运系统输出胞外多糖(EPS)和夹膜多糖(CPS) (Cuthbertson等 人，2009)。这些生物聚合物发挥各种生物功能，诸如提供备用材料或者作为保护结构的一 部分以及能够在某些环境条件下为病原性细菌提供实质性优势。在病原性细菌中，EPS和 CPS的产生和输出具有主要挑战，因为这些高分子量亲水聚合物必须被组装并跨包膜输出， 同时不能损害包膜的基本功能特性(Cuthbertson等人，2009)。两个具备不同聚合物生物合 成策略的主要途径被细菌用于组装大部分EPS/CPS:Wzy-依赖性途径和ATP结合盒(ABC)转 运蛋白-依赖性途径(Larue等人，2011)。它们在由外膜辅助蛋白（OM)家族介导的外膜输出 步骤中聚集。OMA蛋白形成生物聚合物的外膜流出通道(ref)。酶的多糖辅聚合酶(PCP)家族 与OMA蛋白相互作用形成一个跨包膜支架用于聚合物的输出（Larue等人，2011)。与强毒副 猪嗜血杆菌ST5类似，变体副猪嗜血杆菌ST4株具有众多ABC转运蛋白系统，但是缺少多糖转 运蛋白（HPM_0299)wza。这证实ABC转运蛋白在输出复杂碳水化合物和生物聚合物之间的功 能性重叠。
[0079] capD基因（HPM_0300)编码一种多糖生物合成蛋白。该蛋白已涉及副猪嗜血杆菌的 毒力，但是，该基因与副猪嗜血杆菌致病性相关的特征还没有被阐明。该域被发现于多种多 样的细菌多糖生物合成蛋白中，包括WalL蛋白、甘露糖基转移酶和差向异构酶(Whitfield， 2006)。葡萄球菌属的某些种中1型夹膜多糖的生物合成需要CapD蛋白（Lin等人，1994)。在 副猪嗜血杆菌中，capD蛋白涉及血清耐受性。但是，变体副猪嗜血杆菌ST4-1(即SEQ ID NO. 2)和ST4-2 (即SEQ ID NO. 3)缺少该域，但它们却是高度强毒的，并且被从死猪中回收为 纯培养物，这证明无 capD蛋白而具有血清耐受性。早期研究表明capD基因的缺失显著减弱 SH0165的致病性，同时该基因的互补大大恢复在仔猪中的致病性(Wang等人，2013)。此外， 缺失capD的SH0165株不能从攻击后的仔猪中回收得到，而野生型SH0165和互补capD的株二 者从全身大多数部位回收得到(Wang等人，2013)。与SH1065强毒株相反，在我们的研究期 间，变体副猪嗜血杆菌ST4分离物引起临床症状的快速发作，并且4只猪中的2只死亡。当猪 被尸体剖检时，我们发现副猪嗜血杆菌感染的典型病变并分离了强毒株副猪嗜血杆菌ST4 即原始攻击株。
[0080] 毒力基因的PCR分析
[0081 ] 变体副猪嗜血杆菌ST4-1(即SEQ ID N0.2)和ST4-2(即SEQ ID如.3)株缺少冊]?_ 1370、HPM_1371、即]?_1372、即]\1_1373、即]\1_0299和即]\1_0300开放阅读框，重现了 (reiterate)我们基于电脑的分析。另一方面，副猪嗜血杆菌变体ST4株具有与强毒副猪嗜 血杆菌ST5株相似的所有三个毒力相关三聚化自转运蛋白（VtaA)域。比较基因组分析已经 表明第3组VtaA在侵入性和非侵入性株二者中都是高度保守的，而第1和2组VtaA仅在强毒 株中被检测到(Pina等人，2009)。但是，与在无毒株ST5株中一样，在高度强毒株ST4-1 (即 SEQ ID NO.2)、ST4-2(即SEQ ID NO.3)和ST5中我们发现了所有三个域(Newport实验室内 部报告）。鉴于副猪嗜血杆菌毒力确定涉及复杂的基因调控机制，我们推测基于VtaA域表征 无毒和强毒副猪嗜血杆菌株可能不是可靠的方法。
[0082] 其他毒力基因和毒力相关基因
[0083]除了已知的毒力基因以外，副猪嗜血杆菌ST4和ST5基因组编码大量其他毒力基因 和毒力相关基因。这些包括金属离子吸收的调控、MerR家族转录调节子、巨噬细胞感染性增 效剂-相关蛋白、溶血素、浊度相关蛋白、毒素-抗毒素系统、毒力相关蛋白D、大肠菌素和细 胞致死性肿胀毒素。
[0084] 金属离子吸收的调控
[0085] 与许多病原性细菌一样，变体副猪嗜血杆菌ST4-1(即SEQ ID N0.2)、ST4-2(即SEQ ID NO. 3)株和ST5具有广泛的调节和蛋白质编码机制，其专门用于维持生物所需金属离子 的稳态。这些金属尚子中的大部分必须从环境中获取。金属尚子中的铁是许多毒力基因的 主要调节子，并且变体副猪嗜血杆菌ST4-1(即SEQ ID N0.2)、ST4-2(即SEQ ID N0.3)和ST5 具有广泛的蛋白网络以调节铁离子。由于在中性PH条件下Fe(III)在水中具有低溶解度，铁 一般是病原性细菌生长的限速因子，但是为许多基本代谢酶(包括细胞色素、核糖核苷酸还 原酶、Fe-S簇）的生物发生以及毒力基因的活化/调控所必需(Laham和Ehrlich 2004)。大部 分哺乳动物宿主缺少用于吸收的游离铁，因为其大部分都在细胞内储存或者在细胞外以紧 密结合的形式存在，如转铁蛋白、乳铁蛋白、血红素结合蛋白以及触珠蛋白（Litwin和 Calderwood 1993) 〇一些外膜OM受体蛋白如ferroxamine(HPM_2297)先结合乳铁蛋白或者 铁蛋白并且介导转运。这些受体通常是22链的β桶状蛋白，其含有结合底物的胞外环以及在 周质表面附近折叠成桶状的N-端区或栓(plugKFerguson等人，2002)。由于没有离子梯度 来驱动该转运，跨OM的转运通过与由TonB(HPM_0089和HPM_0090)、ExbB(HPM_0091)以及 ExbD(HPM_0092)组成的周质生成复合物的细胞质膜的质子动力势偶联(Braun等人，1996)。 一旦在周质中，通过在质膜中发现的ATP结合盒(ABC)转运蛋白的跨膜通道吸收Fe(III)或 Fe(III)螯合物(Davidson等人，2008)。该过程由ATP水解介导。副猪嗜血杆菌ST4和ST5也具 有结合血红素和氯化血红素的三种血红素结合蛋白（HPM_0689、HPM_2386和HPM_0785)，并 且参与血红素的获取。变体副猪嗜血杆菌ST4还编码铁结合蛋白IscA(HPM_1829)，其将细胞 内的游离铁转化为例如apo-铁氧还蛋白、铁利用蛋白hugX(HPM_0784)、三价铁还原酶(HPM_ 1543，参与铁异羟肟酸(hydroximate)转运）、高亲和铁清除蛋白血红素结合蛋白B和A(HPM_ 1235和HPM_1236)、两个周质铁吸收和结合蛋白（HPM_1161和HPM_1150)、铁转运蛋白ATP结 合亚单位(HPM_1466)和高亲和血红素/血红素结合蛋白利用蛋白C/外膜受体蛋白（HPM_ 1031，转运Fe离子）以及铁吸收调节蛋白（HPM_1051)。血红素输出蛋白B(HPM_2191)(其将血 红素输出到周质用于细胞色素 C的生物发生)与细胞色素 C生物发生ATP-结合输出蛋白CcmA (HPM_2192)相邻。副猪嗜血杆菌ST4和ST5编码两个外膜TonB依赖性受体或铁调控的外膜蛋 白IROMP(HPMJ) 168和HPM_0415)。副猪嗜血杆菌ST5和ST4还编码三个小的多功能蛋白：共济 蛋白（HPM_1028)、铁氧还蛋白（HPM_0902)和铁蛋白/DNA结合应激蛋白（HPM_2074)。在细胞 血红素和铁-硫(Fe-S)簇生成期间，共济蛋白作为一种铁伴侣在铁过载的情况下清除铁并 储存铁，修复氧化损伤的顺乌头酸酶的Fe-S簇，通过调节活性氧(ROS)的浓度减少氧化应激 并参与能量转换和氧化磷酸化作用。铁氧还蛋白是一类含有被组织成的铁-硫簇(4Fe-4S) 的铁和硫原子的蛋白质，这类蛋白质在生物氧化还原反应过程中参与电子的转运 (Carvajal等人，1996)。铁氧还蛋白的功能与甲酸脱氢酶的铁-硫亚单位的功能有重叠。它 含有氢化酶组分1(HPM_1699)，氢化酶组分1在需氧呼吸过程中参与使用甲酸作为主要电子 供体。铁蛋白是另一种细胞质蛋白，这种蛋白质结合并螯合铁并以一种受控的方式释放。此 外，铁蛋白结合DNA，并将铁递送到细胞核用于铁依赖性酶或者转录因子（Prince和 Grossman，1993;DempIe等人，1999 ;KhoroshiIova等人，1997)。因此，副猪嗜血杆菌ST4-1 (即SEQ ID NO.2)、ST4-2(即SEQ ID NO.3)和ST5基因组编码了大量的功能上与参与维持铁 稳态的有重叠的蛋白质，这表明铁在副猪嗜血杆菌发病机制中具有重要作用。这些蛋白也 被靶向以开发通用疫苗或用于菌株的鉴定。
[0086]为了激活许多金属蛋白酶、代谢酶和DNAse，除了铁外，副猪嗜血杆菌还需要其他 的金属离子，例如钼、锌、铜、镍、镁。副猪嗜血杆菌ST4-1(即SEQ ID N0.2)、ST4-2(即SEQ ID NO. 3)和ST5有广泛的蛋白质网络可以捕获这些金属，这些金属包括钼辅因子生物合成 (HPM_0200)、钼蛋白生物合成蛋白、钼蛋白生物合成MoeB和两个MoeA(分别为HPM_0201、 HPM_1239和HPM_1012)、钼酸盐ATP转运蛋白（HPM_1718)、钼酸盐ABC转运蛋白（HPM_1719)、 钼转运蛋白（HPM_0692)、钼酸盐结合周质蛋白（HPM_0693)、钼辅因子的生物合成蛋白C' (HPM_0289)、钼蛋白转换因子(HPM_0290)、锌ABC转运蛋白（HPM_0361，HPM_1198)、高亲和力 的锌转运蛋白周质组分(HPM_0485)、锌/铜歧化酶(HPM_0873)、铜稳态(HPM_1035)、镍转运 通透酶(HPM_2246)、镍结合周质前体蛋白，11丨1^(冊1_0691)^8(：型镍/钴外排系统、通透酶 组分(HPM_2454)、Mg 2+/C02+转运蛋白（HPM_2352)、镁歧化酶(HPM_1717)和镁转运corA蛋白 (HPM_0841)〇
[0087] MerR家族转录调节子
[0088]金属离子稳态的调控专门由转录调节子的MerR家族控制。在广泛的细菌范围内都 已经发现了调节子的MerR家族，但是却没有在古菌或真核生物中鉴定出来。MerR转录调节 子的功能主要为表达金属流出或者解毒、防御氧化反应、生物或者非生物应激以及提供耐 药性基因所需要的转录活化剂（Lund等人，1986)。副猪嗜血杆菌ST4和ST5的MerR调节子 (HPM_1347)是15.7KDa的蛋白质，属于螺旋-转角-螺旋(HTH)MerR-SF超家族。副猪嗜血杆菌 的MerR与其它细菌的MerR调控蛋白相似，遵循规则的N-末端HTH-DNA结合域，该域大约拥有 40个氨基酸。它还包含一个在80-130个氨基酸之间的C-末端金属配位域，该域是特异性针 对识别的效应子(金属离子）（〇'HalIoran等人，1989 ;Ma等人，2009)。金属结合蛋白、金属反 应蛋白中的MerR家族独特之处在于它们激活来自不常见的启动子的转录，启动子在-35到-10位点之间拥有19个碱基对的大间隔（O'Halloran等人，1989)。这些细胞质转录因子通过 半胱氨酸或组胺酸残基与金属配位(结合）（Ma等人，2009)。虽然不同的细菌具有共同的设 计（即保守的一级结构），但是在体内它们可以有效区分金属(Brown等人，2003)。基于NCBI 分析(E-值:7.89e-39)，副猪嗜血杆菌Mer R调节子似乎是重金属(铜、镉、铅、锌)耐受性转 录调节子。
[0089]综上所述，与特异性转录调节子一起的大量金属捕获基因的存在显示出非常复杂 的基因调控机制，其参与副猪嗜血杆菌毒力基因的表达。
[0090] 巨噬细胞感染性增效剂-相关蛋白
[0091] 在许多病原性细菌(诸如奈瑟菌、放线杆菌、军团菌、衣原体）中均被鉴定出巨噬细 胞感染性增效剂（MIP)相关蛋白。在一些细胞内病原体贝氏柯克斯体（Coxi el Ia burnetii)、类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)和原生动物寄生虫克氏锥虫 (Trypanosoma cruzi)中，也鉴定出含有巨细胞感染增强子(MIP)相关蛋白（Lundemose等 人，1993;Masuzawa等人，1997;Norvilie等人，2011;Pereira等人，2002)。变体副猪嗜血杆 菌ST4和ST5基因组编码一种推定的巨噬细胞感染性增效剂相关蛋白（HPM_0216)，其为 20KDa的外膜蛋白质。分析显示，副猪嗜血杆菌ST4和ST5的MIP属于羧基粘康酸内酯脱羧酶 超家族(CMD超家族;C0G2128)，表明多域结构。副猪嗜血杆菌ST5和ST4的MIP含有一个重叠 的烷基氢化过氧化物酶AhpD家族核心域，烷基氢化过氧化物酶域蛋白（Avi_7169家族)和一 个γ_羧基粘康酸内酯脱羧酶。与其它的原核MIP-样蛋白一样，预测副猪嗜血杆菌ST4和ST5 的MIP的N-末端结构含有三个大的α-螺旋接着一个短的β-折叠或转角。
[0092] 类鼻疽伯克氏菌(B. pseudomallei)的MIP-样蛋白对免疫抑制剂（如FK506和雷帕 霉素)敏感，这些抑制剂可以使它丧失肽基脯氨酰异构酶的活性。缺乏MIP的类鼻疽伯克氏 菌突变体显示出在细胞内存活能力降低，在体内毒性显著减弱(Norville等人，2011)。此 外，MIP已涉及在衣原体在进入McCoy细胞中起作用(Lundemorse等人，1993)。副猪嗜血杆菌 的MIP的类似功能不能被排除，并可能有助于细胞的侵袭和细菌的存活。MIP-样蛋白质可能 潜在地作为一种通用疫苗的靶标。
[0093] 溶血素
[0094] 溶血素对于红细胞有毒，但是一些细菌种产生也裂解白细胞的溶血素 (Cavalieri 等人，1984; Fores tier和 We Ich 1991; Gadebeerg 等人，1983; Keane 等人，1987; Wi Ie s等人， 2008)。变体副猪嗜血杆菌ST4-1(即SEQ ID N0.2)、ST4-2(即SEQ ID N0.3)和ST5具有两个 溶血素激活/分泌蛋白（HPM_2302和HPM_1788)以及两个溶血素结构蛋白（HPM_1789和HPM_ 2290)。与杜克氏嗜血杆菌（H.ducreyi)(hhdB和hhdA)、粘质沙雷杆菌（Serratia marcescens) (shlB和shlA)、奇异变形菌（Proteus mirabilis) (hpmA和hpmB)以及迟纯愛德 华菌(Edwardsiella tarda)类似，开放阅读框HPM_1788和HPM_1789彼此相邻。然而，开放阅 读框HPM_2302和HPM_2290并不相邻。此外，副猪嗜血杆菌ST4和ST5基因组还编码影响溶血 素表达的AphA-样蛋白/膜蛋白（HPM_2138)、一种为21KDa的溶血素前体蛋白（HPM_0599)以 及另一种可能的溶血素结构蛋白（HPM_0082)。早期研究已经显示，粘质沙雷杆菌 (S.marcescens)的ShlB蛋白是外膜蛋白，其是分泌和激活溶血素结构蛋白ShlA所必需的（ Κδηη i nger等人，1999)。一旦分泌，与"RTX"毒素家族其他的成员相似，aiA会与靶细胞 膜相互作用，寡聚化，并形成细胞膜上的孔，导致靶细胞膜裂解(Schdnh&rr等人，1994)。 [0095]与对照株相比，表达经克隆的溶血素基因的杜克氏嗜血杆菌株表现出人上皮细胞 侵袭的十倍增加(Wood等人，1999)。杜克氏嗜血杆菌溶血素的靶细胞范围包括T-细胞、巨噬 细胞、人包皮成纤维细胞、人包皮上皮细胞和B细胞。PMN对由溶血素引起的裂解相对不敏感 (Wood等人，1999)。由病原性细菌引起的溶血素的分泌与激活受到铁的密切调控。
[0096] 浊度相关蛋白
[0097] 在流感嗜血杆菌和淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrae)中，池度相关蛋白质（OapA 和OapB)已经涉及初始定殖和细胞侵袭过程中阶段性变异、黏附至上皮细胞(Weiser等人， 1995 ;Blake和Gotschichl984)。副猪嗜血杆菌ST5和变体ST4分离物编码两个OapA和OapB蛋 白（HPM_0924和HPM_0925)，这些蛋白与菌毛/黏附素以及菌毛复合位点一起有助于初始定 殖和黏附（HPM_0366，HPM_0367，HPM_0368，HPM_0371，HPM_1452，HPM_1455和HPM_1637)。
[0098] 毒素-抗毒素系统
[0099] 副猪嗜血杆菌ST4和ST5基因组编码大量的毒素-抗毒素系统(TAS)，这些系统是丰 富的、多种多样的、水平移动的基因元件(Arcus等人，2004; Buts等人，2005; Zie lenkiewi cz 和Ceglowski 2001KTAS绝大部分局限于细菌和古菌的基因组，并参与各种功能，包括质粒 稳定、转录调控、增强耐受性机制和RNA-干扰（Pandey等人，2005; Buts等人，2005; Zielenkiewicz和Ceglowski 2001)。副猪嗜血杆菌ST4和ST5的TAS模块包括毒素/抗毒素稳 定系统(HPM_1007)的宿主-死亡阻止家族蛋白/抗毒素、抗毒素/毒素系统ζ毒素、信号识别 颗粒GTPase蛋白（HPM_1145)、fic家族毒素-抗毒素(ΗΡΜ_1182)、上瘾模块抗毒素/推定的 RelE毒素-样蛋白、质粒稳定系统(ΗΡΜ_1184)、毒素组分RelE家族(ΗΡΜ_0312)、转录调节子/ 抗毒素、MazE蛋白（HPM_1226)、抗毒素 ChpS/转录调节子/抗毒素、MazE/推定的质粒稳定遗 传蛋白（HPM_1862)、生长抑制物、PemK-样自调控/MazE转录调节子/毒素、MazF、质粒稳定遗 传蛋白K蛋白（HPM_1863)、质粒稳定蛋白 StbD(HPM_2272)、HicA和B(HPM_2185、HPM_0011 和 HPM_0012) C3TAS中模块数量范围可以从1个到8个(Mittenhuber 1999 ;Gerdes 2000)。大部 分被调控TSS是双组分系统，并且功能与HicA和HicB相似。开放阅读框HicA和B(HPMJ)Oll和 HPM_0012)是连续的并且附接至感受态蛋白comM(HPM_0013)，而另一个HicA(HPM_2185)与 一种内切核酸酶(HPM_2184)相关。HicB蛋白有一部分降解的RNAse H折叠，而HicA含有一个 双链RNA-结合域(Markarova等人，2006)。这两个域的稳定结合清楚地说明通过RNA、最有可 能通过RNA-结合降解（即RNA干扰）的方式来介导转录调控。在绝大部分HicB蛋白中，RNAse H-样域与DNA-结合域融合，其具有带状-螺旋-螺旋结构或者与螺旋-转角-螺旋模体融合。 含有这些DNA-结合域的TAS蛋白质作为抗毒素发挥功能(Markarova等人，2006)。副猪嗜血 杆菌ST4和ST5分离物具有大量位于致病性岛(PAI)内的TAS基因，致病性岛适于水平转移并 辅助主要毒力基因发挥功能。
[0100] 毒力相关蛋白D
[0101] 副猪嗜血杆菌ST4和ST5基因组编码的毒力相关蛋白D(VapD;HPM_1572)，其显示与 副猪嗜血杆菌SH0165(YP_002476324)、副猪嗜血杆菌ZJ0906(YP_008124455)和副猪嗜血杆 菌挪114化(^00157.1)的\^)0为100%同一性，但是与小放线杆菌(ActinobaciIlus minor) (WP_005826028)只有90% 的同一性，与乳糖奈瑟氏菌（Neisseria lactamica) (WP_ 〇〇37111〇6.1)只有64%的同一性，与脑膜炎奈瑟氏菌0.1^111即1衍(168)(肝_〇〇2238271.1) 只有63%的同一性，与脑膜炎奈瑟氏菌(WP_002251489)中CRISPR相关的Cas2家族蛋白只有 62%的同一性。从马駒中分离的马红球菌(Rhodococcus equi)在80_90kb毒力质粒中含有 一个高度表征的vapD基因（Giguere等人，1999)。该马红球菌毒力质粒含有一个27.5kb的致 病性岛，其编码包括VapA-G的7个Vap蛋白的家族(Jain等人，2003)。缺少生成5个vap基因 (抑?六，-(：，-0,4和4)的7.91^0嫩区的马红球菌突变体是无毒的并且与野生型相比很快 被小鼠免疫系统清除(Jain等人，2003)。另外，马红球菌株的同基因质粒去除突变体丧失了 在肺泡巨细胞中存活的能力并且不能在马駒中诱发肺炎（Hondalus和Mosser，1994 ; Hondalus 1997) Jap基因也可以被H2O2诱导(Benoit等人，2002) JapD蛋白与巨噬细胞感染 性增效剂一起可能参与副猪嗜血杆菌细胞内感染的起始和保持，尤其在巨噬细胞内。因此， 这些抗原可以纳入新疫苗的开发策略。
[0102] 大肠菌素
[0103] 大肠菌素是首次在大肠杆菌(Escherichia coli)的某些株中鉴定的不耐热蛋白， 这些株含有一个具有产生大肠菌素能力的质粒(Feldgarden和Riley，1999)。大肠菌素也曾 在拮抗另一密切相关株的许多细菌株中得到鉴定。病原性细菌中具有产生大肠菌素能力的 株在自然界中广泛分布并且在动物的肠道中尤其丰富(Cascales等人，2007)。副猪嗜血杆 菌ST4和ST5的大肠菌素在常规条件下并不被合成，因为大肠菌素操纵子被LexA蛋白（HPM_ 1027)抑制。副猪嗜血杆菌ST4和ST5编码大肠菌素 V(HPM_1084)以及大肠菌素转运蛋白TolQ (HPM_1307)，赋予这些菌株在占据猪的鼻腔和上呼吸道的竞争性优势。
[0104] 细胞致死性肿胀毒素(CTD)
[0105]在各种革兰氏阴性细菌中已经鉴定到细胞致死性肿胀毒素，包括弯曲菌属的某些 种(Campylobacter spp.) (ref)、大肠杆菌(ref)、杜克氏嗜血杆菌(ref)、放线共生放线杆 菌（Actinobacillus actino my cetemcomitans)(ref)、痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae) (ref )、螺杆菌属的某些种(Helicobacter spp ·) (ref)。CDT是异源三聚体毒 素 （Johnson 等人，1988; Pickett 等人，1994; Cope 等人，1997; Mayer等人，1999; Okuda 等人， 1995 ; Young等人，2000) XDT-旦进入靶细胞，CDT在细胞DNA上随机切口，导致细胞凋亡 (Jinadasa等人，2011)。这些毒素也会触发特定的哺乳动物细胞系停滞在G2/M细胞周期，导 致细胞增大或膨胀并且引起坏死(Elwell和Dreyfus 2000)。毒素通过高尔基复合体内化并 且以与霍乱毒素 Al相似的逆行方式转运到内质网（Teter等人，2002)。⑶T的产生依赖于操 纵子中三个连续基因（cdtA、cdtB和cdtC)的表达(Matsuda等人，2008;Dreyfus 2003)。然 而，副猪嗜血杆菌ST4和ST5基因组仅含有一个编码CTD内化蛋白的基因（cdtA;HPA_2217)， 但是缺少活性毒素 cdtB和内化蛋白cdtC。丢失cdtB和cdtC的可能原因在基于图谱的组装中 包括一个缺口或者它们可能缺少有功能的CTD操纵子。在人类感染中，已经从患有肠道疾病 的患者中分离了⑶T-阴性弯曲菌株，这表明与强毒副猪嗜血杆菌ST4菌株相似，CDT的表达 对毒力是不重要的(Abuoun等人，2005) 〇
[0106] 未作图基因
[0107] 分析ST4-1(即SEQ ID NO.2)的未作图区域可以产生263个基因，分析ST4-2(即SEQ ID NO. 3)的未作图区域可以产生323个基因（数据未显示）。少于300个碱基对的开放阅读框 通常会发生重复且经常不编码任何功能蛋白质。因此，将截断值设定为300个碱基对，开放 阅读框多300碱基对的才会被作图并注释。ST4-1 (即SEQ ID NO. 2)中产生了 190个开放阅读 框，ST4-2(g卩SEQIDN0.3)中产生了237个开放阅读框。ST4-l(g卩SEQIDN0.2)和ST4-2(即 SEQ ID NO.3)的未作图区含有水平基因转移元件、假定蛋白质、转录因子、噬菌体基因组、 转运蛋白、持家基因（细胞壁/LPS生物合成）以及毒素抗毒素蛋白ζ毒素。因为这是基于基因 组草图的组装，因此每株中基因的独特性并没有经过验证。
[0108] 单核苷酸多态性(SNP)
[0109]我们跨所有3种分离物鉴定了 40,000+同义和非同义的SNP(数据未显示）。这些SNP 跨越了已知的毒力基因、毒力相关基因和持家基因。这些数据将被用于设计SNP阵列，其将 帮助研究跨株的变异，并且将可能帮助理解各种毒力因子的基因调控和作用模式。
[0110] 综上所述，比较基因组学分析显示，变体副猪嗜血杆菌ST4-1(即SEQ ID NO. 2)和 ST4-2(即SEQ ID NO.3)株具有大量的LOS和OMP结构修饰，其帮助鼻腔定殖、宿主免疫逃逸 和可能提供血清耐受性。另外，在OMP和LOS上缺乏唾液酸残基引起细胞因子不受控的释放， 如肺部病理学所示，这导致败血症、肺水肿和重症肺炎。当使用变体副猪嗜血杆菌ST4对仔 猪进行攻击时，50%的仔猪在48小时内死亡。很明显，变体ST4株是高度强毒的。与先前的描 述相比，变体副猪嗜血杆菌ST4还具有更加多种多样的毒力基因和毒力相关基因谱 (repertoire)。由于LOS取代的包膜修饰以及阶段变异的组合将帮助变体副猪嗜血杆菌ST4 逃避宿主的免疫系统，并变形成致命的病原体，其可导致暴发。
[0111]在不偏离本发明的精神或其基本属性的情况下，本发明可以采用其他特定行式实 现，因此希望本发明的实施方案在所有方面被视为说明性的，而非限制性的，参照所附权利 要求书而非前述的说明书来表示本发明的范围。
【主权项】
1. 一种血清变型4型副猪嗜血杆菌的疫苗，其包含兽医学上可接受的载体和免疫学上 有效量的灭活细菌疫苗或者细菌细胞培养物，所述免疫学上有效量的灭活细菌疫苗或者细 菌培养物能够触发免疫应答，所述免疫应答保护猪对抗副猪嗜血杆菌感染。2. 权利要求1所述的疫苗，其中所述细菌疫苗或细菌细胞培养物的DNA序列包含SEQ ID N〇 ： 2 ο3. 权利要求1所述的疫苗，其中所述细菌疫苗或细菌细胞培养物的DNA序列包含SEQ ID No ： 3〇4. 权利要求1所述的疫苗，其包含对抗血清变型5型副猪嗜血杆菌的ParaSail疫苗。5. -种用于猪疫苗接种对抗血清变型4型副猪嗜血杆菌感染的方法，其包括步骤a)克 隆性繁殖能够触发对抗血清变型4型副猪嗜血杆菌感染的免疫应答的一个或多个细胞，所 述免疫应答保护猪对抗副猪嗜血杆菌感染，以及步骤b)将免疫学上有效量的所述细胞和兽 医学上可接受的载体混合成适于作为猪的疫苗进行施用的形式，以及步骤c)作为灭活疫苗 进行施用。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述能够触发对抗血清变型4型副猪嗜血杆菌感染 的免疫应答的一个或多个细胞包含SEQ ID No:2的DNA序列。7. 根据权利要求5所述的方法，其中所述能够触发对抗血清变型4型副猪嗜血杆菌感染 的免疫应答的一个或多个细胞包含SEQ ID No:3的DNA序列。8. 根据权利要求5所述的方法，其中施用灭活疫苗的步骤包括施用对抗血清变型5型副 猪嗜血杆菌的Parasail疫苗。
【文档编号】C12R1/21GK105992592SQ201480063818
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2014年10月6日
【发明人】P·K·劳伦斯, R·F·贝伊
【申请人】梅里亚股份有限公司