一种包含脂溶性茶多酚的化妆品和/或护肤品的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种脂溶性茶多酚，该脂溶性茶多酚中总茶多酚的含量为60％?95％。本发明还公开了该脂溶性茶多酚的制备方法，以及该脂溶性茶多酚在化妆品领域的应用，该脂溶性茶多酚以绿茶为原料，以极性或非极性溶剂为溶媒，在一定温度条件下多次提取制备得到水溶性茶多酚，然后再向水溶性茶多酚酰基化得到。本发明提供的脂溶性茶多酚，具有优良的抗衰老能力，能够促进胶原蛋白的分泌，还可以清除皮肤细胞中的自由基。另外，本发明提供的脂溶性茶多酚还具有优良的保湿和美白作用，可以作为添加剂加入到化妆品中。
【专利说明】
一种包含脂溶性茶多酚的化妆品和/或护肤品
技术领域
[0001] 本发明属于生物化学领域，涉及一种化妆品和/或护肤品，尤其涉及一种包含脂溶 性茶多酚的化妆品和/或护肤品。
【背景技术】
[0002] 衰老是指机体各器官功能普遍的、逐渐降低的过程，随着年龄的增长，衰老不可避 免，但是，良好的生活习惯和保健措施可以有效地延缓衰老。目前市场上抗衰老的产品也层 出不穷。
[0003] 皮肤老化最主要的表现是产生皱纹，皮肤老化主要是由于年龄的增长或外界因素 的干扰，真皮层细胞分泌的I型胶原蛋白减少或胶原水解酶类增加，细胞缺乏胶原蛋白的支 撑，角质层和表皮层发生内陷而形成皱纹。目前一般认为，因自由基攻击生物膜多不饱和脂 肪酸、DNA、蛋白质和其他生物大分子而引发的氧化损伤，是导致机体老化及许多老年疾病 的主要因素。
[0004] 远古时代起，化妆品配方已有本草成分。随着科学发展，目前已有很多新型技术可 用于治疗皮肤老化。然而，天然本草产品因其高效低毒等特点仍然具有很大的吸引力和广 阔的市场。研究已证实越来越多的本草化学物质对皮肤具有益处，很多提取物和化合物具 有显著的治疗皮肤老化的潜力，并已初步阐明其机制。
[0005] 绿茶(Green Tea)，是中国的主要茶类之一，是指采取茶树的新叶或芽，未经发酵， 经杀青、整形、烘干等工艺而制作的饮品。常饮绿茶能防癌，降脂和减肥，对吸烟者也可减轻 其受到的尼古丁伤害。
[0000]绿茶中含有的茶多?KTea polyphenols)是一种天然抗氧化剂，对防衰老、防癌、 抗癌、杀菌、消炎等具有特殊效果，但是由于茶多酚易溶于水、乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯等 溶剂，难溶于油脂的特性使其应用受到了限制。目前解决茶多酚难溶于油脂的方法主要有 溶剂法、乳化法和分子修饰法，但是现有技术制备的产品要不脂溶性不稳定，要不制备方法 复杂，且产品纯度不高。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术存在的问题，本发明提供一种脂溶性茶多酚，并研究了该脂溶性茶 多酚在化妆品领域中的应用。
[0008] 本发明的第一个方面在于提供一种日化用品，所述日化用品包括脂溶性茶多酚， 优选为所述化妆品和/或护肤品中，还可以包括营养性添加剂。
[0009] 作为本发明的一个优选实施例，所述化妆品和/或护肤品中，所述脂溶性茶多酚的 含量为0.001%-60%，如0.003%，50%，优选为0.005%-40%，如20%、30%等。
[0010] 作为本发明的一个优选实施例，所述脂溶性茶多酚的通式为式(I):
[0011
[0012 ] 其中：Ri、R3、R4、R5独立地，为Η、C6-&4脂肪酰基中的任意一种；
[0013 ] RAH、-OH、C6-&4脂肪酰基中的任意一种；
[0014] R!、R2、R3、R4、Rs中至少有一个为C6-&4脂肪酰基。
[0015] 本发明的第二个方面在于提供上述任意一种脂溶性茶多酚的应用。
[0016] 所述脂溶性茶多酚优选为施用于皮肤外表面，更优选为应用于制备涂覆于皮肤外 表面的制品。
[0017] 其中，本发明所述脂溶性茶多酚应用于制备日化用品，优选为应用于制备化妆品 和/或护肤品。
[0018] 作为本发明的一个优选实施例，所述脂溶性茶多酚包括通式(I):
[0019；
[0020] 其中：Ri、R3、R4、Μ虫立为Η、C6-&4脂肪酰中的任意一种；
[0021] 1?2为!1、-0!1、(：6-(：14脂肪酰中的任意一种；
[0022] 、R2、R3、R4、Rs中至少有一个为C6-&4脂肪酰基。
[0023]本发明的第三个方面在于提供一种脂溶性茶多酚，所述脂溶性茶多酚包括通式 (I)：
[0024]
[0025] 其中：Ri、R3、R4、Μ虫立为Η、Cs-Cw脂肪酰中的任意一种；
[0026] RAH、-OH、C6-&4脂肪酰中的任意一种；
[0027]办、1?2、1?3、1?4、1^中至少有一个为〇5-&4脂肪酰基。
[0028] 作为本发明的一个优选实施例，所述脂溶性茶多酚中总茶多酚的含量为60%-95%，如65%、90%，优选为70%-85%，如75%、80%等。
[0029] 本发明的第四个方面在于提供一种脂溶性茶多酚的制备方法，所述制备方法包 括：
[0030] 向绿茶中加入5-20体积倍率的溶媒提取，得到提取液；
[0031 ]纯化制备的所述提取液，并减压浓缩得到浓缩液；
[0032 ]皂化所述浓缩液，过滤、干燥，得到中间产物；
[0033]酰化中间产物，向酰化剂中缓慢加入所述中间产物，反应一定时间，得到所述脂溶 性茶多酚。
[0034]作为本发明的一个优选实施例，所述溶媒为水、乙醇、甲醇、乙醚、超临界二氧化碳 中的任意一种或几种组合。
[0035] 作为本发明的一个优选实施例，所述提取的次数至少为2次，优选为3-5次，提取结 束后合并每次的提取液，得到混合提取液。
[0036] 作为本发明的一个优选实施例，所述皂化过程中，加入的皂化剂可以为无机碱、有 机碱中的任意一种或几种组合，如氨水、尿素、乙醇胺等，优选为无机碱，如氢氧化钠的水溶 液或乙醇溶液、氢氧化钾的水溶液或醇溶液、氨水等。
[0037] 作为本发明的一个优选实施例，所述酰化剂的制备试剂包括为羧酸、羧酸酐、酰氯 等中的任意一种或几种组合，如乙酸、乙二酸、苯甲酸、醋酸酐等，优选为酰氯，如五氯化磷、 三氯化磷、氧氯化磷、亚硫酰氯等。
[0038] 作为本发明的一个优选实施例，所述酰化剂在有机碱条件下，以酰氯和C6-C1Q脂肪 酸制备。
[0039] 作为本发明的一个优选实施例，所述脂肪酸优选为C6-C1Q饱和脂肪酸，更优选为直 链饱和脂肪酸。
[0040] 作为本发明的一个优选实施例，所述酰化过程的温度条件为20°C-50°C。
[0041 ]作为本发明的一个优选实施例，在所述酰化过程之后还包括萃取纯化工艺，所述 萃取纯化工艺的萃取剂可以为乙酸乙酯、磷酸三丁酯、苯、四氯化碳等中的任意一种或几种 组合。
[0042]作为本发明的一个优选实施例，酰化所述中间产物后，还可以包括浓缩反应液、干 燥浓缩后的反应液中的任意一种或其组合。
[0043]作为本发明的一个优选实施例，所述浓缩反应液的条件为5-20kPa、20_50°C旋转 蒸发 10_50min〇
[0044] 作为本发明的一个优选实施例，干燥浓缩后的反应液的条件为喷雾干燥，所述喷 雾干燥的条件为:60-120MPa压力下，将浓缩液喷射成100-400μπι的微粒，将微粒通过50-90 。(:的热空气干燥5-30s。
[0045] 本发明提供的脂溶性茶多酚，具有优良的抗衰老能力，能够促进胶原蛋白的分泌， 还可以清除皮肤细胞中的自由基。另外，本发明提供的脂溶性茶多酚还具有优良的保湿性 能，可以作为添加剂加入到化妆品中。
【附图说明】
[0046] 图1为自然状态下脂溶性茶多酚对I型胶原蛋白分泌的影响；
[0047] 图2为过氧化氢对细胞存活率的影响；
[0048] 图3为脂溶性茶多酚对过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响；
[0049] 图4为脂溶性茶多酚对过氧化氢损伤的HDF细胞ΜΜΡ-1含量的影响；
[0050] 图5为脂溶性茶多酚对过氧化氢损伤的HDF细胞MDA含量的影响；
[00511图6为脂溶性茶多酚对DPPH清除率的影响；
[0052] 图7为脂溶性茶多酚对L0R含量的影响；
[0053] 图8为脂溶性茶多酚对络氨酸酶的抑制率。
【具体实施方式】
[0054] 脂溶性茶多酚的制备 [0055] 实施例一
[0056]将新采摘的绿茶叶，清水清洗2次，清洗时向清水中注入浓度为lOOppm的二氧化 氯，对绿茶叶清洗、杀菌，并使用65°C热风干燥清洗过的绿茶叶，得到含水量在5%以下的干 绿茶叶，并将制备的干绿茶叶粉碎，过60目筛，备用。
[0057]取粉碎后的干绿茶10kg，并向其中加入10倍体积的水，在80 °C、1.0 IMPa压力下提 取2h，提取结束后再加入8倍体积的60%乙醇水溶液，在80°C、1.01MPa压力下进行二次提 取，提取2h，提取结束后，合并两次提取液，将混合后的提取液在D-101型大孔吸附树脂中、 25 °C吸附至饱和，然后分别用无水乙醇、60 %乙醇水溶液、50 %乙醇水溶液、30 %乙醇水溶 液洗脱，洗脱液的流速为3BV/h，常温常压洗脱大孔吸附树脂，洗脱结束后，在5kPa、微沸状 态下浓缩洗脱液，去除其中的乙醇，至6kg，向浓缩液中加入1.5L 0. lmol/L的氢氧化钠水溶 液，在90 °C、1.0 IMPa反应2h，过滤，得到滤饼，将滤饼在0.5MPa、60 °C热风干燥至质量不变， 得到中间产物。
[0058]向300g CH3(CH2)5⑶0H中加入285g S0C12和7.3g二甲基甲酰胺，在30-50°C反应 5h，反应结束后，旋转蒸发仪除去其中的S0C12，得到CH3 (CH2)5C0C1。
[0059] 将得到的CH3 (CH2) 5C0C1溶解于25L乙酸乙酯中，室温下缓慢加入得到的中间产物， 反应2h，升温至35°C，反应至无酸性气体产生，反应结束。经旋转蒸发浓缩除去其中的乙酸 乙酯，然后向浓缩液中加入与浓缩液等体积的去离子水和乙酸乙酯，搅拌混合后静置分层， 去除上层液体，再向下层液体加入与下层液体等体积的乙酸乙酯，萃取下层液体3次，合并 萃取液，5kPa、20°C旋蒸浓缩至2.51^，然后于85°(：经喷雾干燥至恒重，得到脂溶性茶多酚。 [0060]其中，喷雾干燥的条件为：lOOMPa压力下，将浓缩液喷射成150μπι的微粒，将微粒通 过70°C的热空气干燥15s。
[0061 ]经紫外扫描仪检测，确定该脂溶性茶多酚中总多酚含量为90%。
[0062] 经液质联用仪分析，该脂溶性茶多酚中包括C22H26〇7的离子峰，m/e = 402.17。
[0063] 实施例二
[0064]将新采摘的绿茶叶，清水清洗2次，清洗时向清水中注入浓度为lOOppm的二氧化 氯，对绿茶叶清洗、杀菌，并使用65°C热风干燥清洗过的绿茶叶，得到含水量在5%以下的干 绿茶叶，并将制备的干绿茶叶粉碎，过80目筛，备用。
[0065]取粉碎后的干绿茶10kg，并向其中加入5倍体积的无水乙醇，在80°C、1.5MPa压力 下提取2h，提取结束后，再加入8倍体积的60 %乙醇水溶液在80 °C、1. IMPa压力下进行二次 提取，提取2h，提取结束后，混合两次得到的提取液，将混合后的提取液在5kPa、微沸条件下 蒸发浓缩lh，得到浓缩液，浓缩液在AB-8型大孔吸附树脂中、25°C吸附至饱和，然后分别用 无水乙醇、60 %乙醇水溶液、50 %乙醇水溶液、30 %乙醇水溶液洗脱，洗脱液的流速为3BV/ h，常温常压洗脱大孔吸附树脂。
[0066]洗脱结束后，在5kPa、微沸状态下浓缩洗脱液，去除其中的乙醇，至6kg，得到浓缩 液二，将浓缩液二在AB-8型大孔吸附树脂中与本实施例中相同的条件二次纯化，洗脱结束 后，在5kPa微沸条件下浓缩二次洗脱液，得浓缩液三，向浓缩液三中加入0.8L 0 . lmol/L的 氢氧化钾水溶液，在90 °C、1.0 IMPa反应2h，过滤，得到滤饼，将滤饼在0.5MPa、60 °C热风干燥 至质量不变，得到中间产物。
[0067] 向0.75kg CH3(CH2)9C00H中加入0.5kg PC13和3.7g二甲基甲酰胺，在30-50°C反应 5h，反应结束后，旋转蒸发仪除去其中的PC1 3，得到CH3 (CH2) 9C0C1。
[0068] 将得到的CH3 (CH2) 9C0C1溶解于15L乙酸乙酯中，室温下缓慢加入得到的中间产物， 反应2h，升温至35°C，反应至无酸性气体产生，反应结束。经20°C、5kPa旋转蒸发浓缩除去其 中的乙酸乙酯，得到脂溶性茶多酚。
[0069] 经紫外扫描仪检测，确定该脂溶性茶多酚中总多酚含量为60%。
[0070] 经液质联用仪分析，该脂溶性茶多酚中包括C26H34〇7的离子峰，m/e = 458.54。
[0071] 实施例三
[0072]将新采摘的绿茶叶，清水清洗2次，清洗时向清水中注入浓度为lOOppm的二氧化 氯，对绿茶叶清洗、杀菌，并使用65°C热风干燥清洗过的绿茶叶，得到含水量在5%以下的干 绿茶叶，并将制备的干绿茶叶粉碎，过100目筛，备用。
[0073]取粉碎后的干绿茶10kg，并向其中加入20倍体积的乙醚，在40°C、1.2MPa压力下提 取2h，提取结束后，再加入10倍体积的30 %乙醇水溶液在80 °C、1. IMPa压力下进行二次提 取，提取2h，提取结束。
[0074]重复上述提取方法，共提取4次。
[0075]合并每次的提取液，使用200目硅胶柱纯化，以2BV/h流速的乙酸乙酯作为流动相， 在25°C、常压洗脱浓缩层，向浓缩液中加入1L 0. lmol/L的氨水溶液，在70°C、1. OIMPa反应 2h，过滤，得到滤饼，将滤饼在0.5MPa、60°C热风干燥至质量不变，得到中间产物。
[0076] 向1.5kg QMCftOnCOOH中加入0.8kg P0C13和7.3g二甲基甲酰胺，在30_50°C反应 5h，反应结束后，旋转蒸发仪除去其中的P0C1 3，得到CH3 (CH2) nCOCl。
[0077] 将得到的CH3(CH2)η⑶Cl溶解于25L乙酸乙酯中，室温下缓慢加入得到的中间产 物，反应2h，升温至35°C，反应至无酸性气体产生，反应结束。经旋转蒸发浓缩除去其中的乙 酸乙酯，然后向浓缩液中加入与浓缩液等体积的去离子水和乙酸乙酯，搅拌混合后静置分 层，去除上层液体，乙酸乙酯萃取下层液体3次，合并萃取液，浓缩得到脂溶性茶多酚。
[0078]经紫外扫描仪检测，确定该脂溶性茶多酚中总多酚含量为75%。
[0079] 经液质联用仪分析，该脂溶性茶多酚中包括C28H38〇7的离子峰，m/e = 486.60。
[0080] 对比实施例
[0081 ]称取l〇kg过30目筛的绿茶末置于提取槽中，向其中加入200L 30%乙醇水溶液，回 流3h，抽滤，得到茶多酚提取液，向茶多酚提取液中加入0.415mol/L的氯化锌水溶液，摇匀， 用质量分数为15 %的碳酸氢钠水溶液调节酸度至pH值=5.0，离心得到茶多酚-锌盐沉淀， 向茶多酚-锌盐沉淀中加入一定量硫酸溶液，溶解沉淀，离心去除少量胶状沉淀，得到茶多 酚酸转液，使用15%的碳酸氢钠水溶液调节酸度，再用乙酸乙酯在室温下分两次萃取，合并 萃取液，在乙酸乙酯相中加入质量分数为2%的VC水溶液，两者体积比未2:1，洗涤两次，在 60°C下进行真空干燥，得到1.3kg包含茶多酚的绿茶提取物。
[0082]经紫外扫描仪检测，确定该绿茶提取物中总多酚含量为60%。
[0083]经液质联用仪分析，该绿茶提取物中包括C15H14〇6的离子峰，其摩尔质量为290.26。 [0084] 脂溶性茶多酚对HDF细胞和Hacat细胞存活率的影响
[0085]取对数生长期、浓度为105个/mL的人HDF细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中， 每孔细胞液lOOyL。最终所铺的细胞孔数取决于样品数，每个样品设3个复孔。
[0086]将96孔板置于37 °C的细胞培养箱中贴壁培养6h。
[0087] 将终浓度为lmg/mL、0.1mg/mL和0.01mg/mL的脂溶性茶多酚加入到96孔细胞培养 板中，向对照组加入等体积的细胞培养液。于37°C、包含5%C02的细胞培养箱中孵育48h。
[0088] 然后向每孔中加入〇.5mg/mL的MTTlOOyL，于37°C、包含5%⑶2的细胞培养箱中黑 暗条件下孵育4h。去除上清液，加入150yL DMS0，震荡以570nm为实验波长，630nm为参照波 长，检测吸光度。
[0089]计算细胞存活率，结果如表1所示：
[0090] 表1，脂溶性茶多酚对HDF细胞和Hacat细胞存活率的影响
[0091]
[0092]
[0093]以细胞存活率高于80%为对人HDF细胞和Hacat细胞无毒的标准，由表1可知，本发 明提供的脂溶性茶多酚对人HDF细胞无毒的最高浓度为0.0 lmg/mL，本发明提供的脂溶性茶 多酚对人HDF细胞无毒的最高浓度为0.01mg/mL，因此，确定脂溶性茶多酚的最高浓度 0.0 lmg/mL为后续的试验浓度。
[0094] 脂溶性茶多酚的抗衰老性能
[0095]自然状态下脂溶性茶多酚对HDF胶原蛋白分泌的影响
[0096]为了考察本发明提供的脂溶性茶多酚对HDF胶原蛋白分泌的影响，本实施例将试 验分为空白组、实验组、对照实验组和标准组。
[0097]取对数生长期、浓度为105个/mL细胞，每孔100yL，于37°C、含有C02的细胞培养箱中 培养24h，之后取出上清液，以3000rpm的速度离心10min，取上清液。
[0098]向标准组中加入50yL标准液，向实验组中加入10yL上清液和40yL本发明提供的脂 溶性茶多酚的稀释液，向对照实验组中加入l〇yL上清液和40yL对比实施例提供的绿茶提取 物的稀释液，空白组中不加样品，分别于37°C孵育lh，并洗板5次，每组样品设3个复孔。 [0099]向四组样品中分别加入生物素标记的抗-lgG抗体50yL，于37°C温育30min，洗涤5 次。
[0100]向四组样品中分别加入50yL的链霉素和素-HRP，轻轻震荡混匀，于37 °C温育 30min，洗涤5次。
[0101] 向四组样品中分别加入显色剂A和显色剂B各50yL，轻轻震荡混匀，于37°C避光孵 育30min，向四组样品中加入终止液50yL。
[0102] 以空白组调零，在终止反应后15min内，在450nm波长测量各组的吸光度，结果如表 2所示。
[0103] 表2，脂溶性茶多酚对HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响
[0104]
[0105]
[0106] 胶原蛋白主要包括I型胶原和III型胶原，外界诱导促使真皮细胞中氧化水平提高 是细胞损伤的主要因素，氧化水平提高的直接结果是降低了 I型胶原蛋白的表达及I型胶原 蛋白被基质金属蛋白酶MPP-1降解，两种情况造成的结果均为I型胶原蛋白在皮肤中的含量 减少，而I型胶原蛋白含量减少是皮肤形成皱纹的主要原因。由表2和图1可知，向HDF细胞中 添加本发明提供的浓度为〇.〇lmg/mL脂溶性茶多酚后，皮肤中的I型胶原蛋白含量为 129.93 %，比现有技术制备的茶多酚中，I型胶原蛋白的含量106.52%，高出23 %，说明本发 明提供的脂溶性茶多酚能够极显著的促进I型胶原蛋白的表达。
[0107] 过氧化氢对HDF细胞存活率的影响
[0108] 选取不同浓度的过氧化氢，如50μΜ、100μΜ、200μΜ、400μΜ、600μΜ、800μ]\^Ρ1000μΜ， 与HDF细胞共同孵育不同时间，如3h、6h和9h等，采用ΜΤΤ法检测不同浓度的过氧化氢对HDF 细胞存活率的影响。
[0109] 取培养至浓度为1〇5个/mL的HDF细胞，接种于96孔细胞培养板，每孔100yL。于37 °C、含有C〇2的培养箱中贴壁培养6h，每板做复孔3个。
[0110] 使用不同浓度的过氧化氢分别孵育造模3h、6h和9h;向每个样品孔中加入浓度为 0.5mg/mL的MTT 100yL，于37°C、含有C02的培养箱中，黑暗条件下孵育4h。
[0111] 去除上清液，向样品中加入150yL DMS0,震荡，以570nm为实验波长，630nm为参照 波长，检测每个样品的吸光度，计算细胞存活率。
[0112] 测试结果如图2所示，人HDF细胞于浓度为50-800μΜ的过氧化氢共孵育3-9h后，人 HDF细胞的存活率明显下降，当孵育浓度超过400μΜ时，细胞存活率低于50% dOOyM过氧化 氢作用6h后，细胞存活率降到70 %。
[0113] 脂溶性茶多酚对经过过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响
[0114] 取培养至密度为105个/mL的HDF细胞接种于96孔板，每孔100yL。于37°C，含有C0 2的 培养箱中贴壁培养6h。
[0115] 向实验组加入本发明提供的脂溶性茶多酚，向对照实验组加入对比实施例提供的 绿茶提取物，利用过氧化氢损伤建模，并向每孔加入〇. 5mg/mL的MTT 100yL，于37 °C、5 % C02 的黑暗条件下孵育4h。去除上清液，加入DMS0 150yL，震荡检测吸光度。计算细胞存活率，并 以供试物不同浓度和细胞的存活率作图，结果如图3所示。
[0116] 经过过氧化氢孵育后，HDF细胞的存活率降低至70%以下，而向经过氧化氢损伤过 的HDF细胞中加入本发明提供的脂溶性茶多酚后，人HDF细胞的存活率达到80%，向经过氧 化氢损伤过的HDF细胞中加入现有技术制备的茶多酚后，人HDF细胞的存活率为73%，即本 发明提供的脂溶性茶多酚相对于现有技术制备的茶多酚能够显著减轻过氧化氢对HDF细胞 的损伤。
[0117] 脂溶性茶多酚对过氧化氢损伤的HDF细胞基质金属蛋白酶(MMP-1)的影响
[0118] 材料与试剂
[0119]细胞培养液 24孔细胞培养板
[0120] 细胞培养箱 过氧化氢
[0121] 离心机 ELISA试剂盒
[0122] 测试步骤
[0123 ] 分为标准组、空白组、实验组和对照实验组。
[0124] 取对数生长期的浓度为105个/mL的HDF细胞接种于24孔培养板中，每孔lmL，于37 °C，含有C0 2的细胞培养箱中培养6h。
[0125] 向实验组加入本发明提供的脂溶性茶多酚，向对照实验组加入对比实施例提供的 绿茶提取物，向标准组加入标准物，空白组不添加其他样品。
[0126] 诱导建立过氧化氢损伤模型。小心吸取上清液培养基，离心，按照试剂盒说明书， 取10yL细胞悬液进行实验。以空白孔调零，在反应终止后15min内，用450nm波长测量各孔的 吸光度。根据标准品对应的MMP-1的浓度及对应的吸光度值，计算出标准曲线的直线回归方 程，再根据样本的吸光度值，在回归方程上计算出实验组中MMP-1的浓度。
[0127] 如图4所示，经过过氧化氢刺激后，HDF细胞中的MMP-1水平显著上升至正常细胞水 平的170%，向经过过氧化氢刺激的HDF细胞中加入本发明提供的脂溶性茶多酚后，MMP-1的 含量降低至100%以下，为93.45%。而加入采用现有技术制备的绿茶提取物后，MMP-1的含 量为120.38%。这说明，在氧化应激条件下，本发明提供的脂溶性茶多酚与现有技术制备的 茶多酚相比，具有更优异的抑制MMP-1表达的性能。
[0128] 脂溶性茶多酚对过氧化氢损伤的HDF细胞中丙二醛(MDA)的影响
[0129] MDA在酸性条件下加热时，可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物3，5，5-三 甲基恶唑-2，4-二酮，在532nm处有最大吸收峰。因底物为硫代巴比妥酸(TBA)，故称此法为 TBA 法。
[0130]取对数生长期、浓度为105个/mL的HDF细胞，接种于6孔细胞培养板，每孔2mL，培养 6h，向实验组加入经新鲜培养基稀释的本发明制备的脂溶性茶多酚，向对照实验组加入对 比实施例制备的绿茶提取物，诱导建立过氧化氢损伤模型。以lOOOrpm离心10min，收集培养 基上清液中的细胞及贴壁细胞，在细胞沉淀中加入500yL PBS，轻轻颠倒混匀，于4°C下，以 2000rpm离心10min，弃除上清液留存底部沉淀。向沉淀中加入500yL PBS，超声破碎细胞 (400A，5s/次，间隙10s反复3~5次），制备细胞匀浆；
[0131]按照试剂盒说明书进行实验。将试剂混匀，用保鲜膜将试管口扎紧，用针头刺孔透 气，用锅开盖煮沸40min，取出后流水冷却，以4000rpm离心10min，使沉淀完全。取上清液，采 用分光光度法测定532nm波长处的吸光度;利用BCA蛋白检测试剂盒，按照说明书方法将本 发明制备的脂溶性茶多酚稀释适当倍数，测定细胞中的蛋白质含量；
[0132] 表3，脂溶性茶多酚对过氧化氢损伤的HDF细胞MDA含量的影响
[0133]
[0134] 由表3和图5可知，过氧化氢损伤后，MDA浓度快速上升，6h时MDA含量增加至正常细 胞的326.33 %，如阴性对照组所示。而加入维甲酸后MDA的增加得到抑制，最后稳定在 262.35%。向经过过氧化氢损伤的HDF细胞中加入本发明和对比实施例提供的茶多酚后， MM含量均比加入维甲酸后的低，说明脂溶性茶多酚具有优异的抑制MDA增加的能力，且本 发明提供的脂溶性茶多酚抑制MDA的能力也优于现有技术制备的茶多酚。
[0135] 脂溶性茶多酚去除自由基的性能
[0136] 1，1_二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性 主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能 发挥其应有的电子成对作用。作为一种稳定的自由基，其可以清除其他的自由基。目前广泛 用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处 有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使 其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行 快速的定量分析。
[0137] 材料与试剂
[0138] DPPH 无水乙醇
[0139] dd 水 200yL 吸头
[0140] 96孔板 8通道加样枪
[0141] 酶标仪
[0142] 测试步骤
[0143] 用无水乙醇配置0.2mmol/L的DPPH溶液，避光保存，配置0.01mg/mL的表没食子儿 茶素没食子酸酯(EGCG)溶液。
[0144] 向实验组添加20uL浓度为0.01mg/mL本发明提供的脂溶性茶多酚溶液和0.2mmol/ L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白组1中添加180uL无水乙醇与20uL本发明提供的 脂溶性茶多酚溶液，向标准组中添加180uL DPPH溶液与20uL蒸馏水，每孔设置至少3个复 孔，分别摇匀，室温下暗处静置30min，测定各组的吸光度。
[0145] 向对照试验组添加20uL浓度为0.01mg/mL采用现有技术制备的绿茶提取物溶液和 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白组2中添加180uL无水乙醇与20uL采用 现有技术制备的绿茶提取物溶液，每孔设置至少3个复孔，分别摇匀，室温下暗处静置 30min，测定各组的吸光度。
[0146] DPPH自由基的清除能力按下式表示：
[0147]
[0148] 其中，计算实验组的DPPH清除率时，测试样吸光度为实验组的吸光度，空白组吸光 度分别为空白组1的吸光度；
[0149] 计算对照实验组的DPPH清除率时，测试样吸光度为对照实验组的吸光度，空白组 吸光度为空白组2的吸光度；
[0150]清除率越大表明抗氧化能力越强，结果如图6所示，当溶液中不存在DPPH自由基 时，空白组的DPPH清除率为0，EGCG对DPPH自由基的去除率为47.23%，本发明提供的脂溶性 茶多酚对DPPH自由基的去除率为80.63%，采用现有技术制备的茶多酚对DPPH自由基的去 除率不足70%，说明脂溶性茶多酚具有非常强的去除DPPH自由基的能力，且相对于现有技 术提供的茶多酚，本发明制备的脂溶性茶多酚具有更优异的DPPH清除率。
[0151] 脂溶性茶多酚的保湿性能
[0152] 皮肤内水分的含量的多少，直接影响皮肤的弹性、光泽度等，皮肤的表皮、真皮、皮 下组织均对皮肤维持水分起着不同的作用。在皮肤保湿过程中，主要有两种机制影响皮肤 对水的维持作用：
[0153] 1)皮肤作为天然屏障，避免水分流失；
[0154]皮肤表皮是人的天然屏障，其中透明层、颗粒层和角质层对皮肤锁水能力起到重 要作用。透明层含有磷脂类物质和角质蛋白，能够防止水分及电解质等透过皮肤。颗粒层的 细胞排列致密，对贮存水分、防止水分渗透具有重要的作用。角质层是由角质形成细的坚 韧、有弹性的板层结构，细胞内充满了角蛋白。
[0155] 2)皮肤中存在许多保湿因子，吸收和锁住水分。
[0156]在皮肤真皮层中，透明质酸(HA)是含量较多的氨基多糖，HA粘稠度极高且能高比 例地结合水分子，HA的含量直接影响皮肤中水分的含量。作为皮肤内重要的保湿成分，它对 皮肤细胞的增殖、分化有显著作用，对维持皮肤细胞的正常新陈代谢至关重要。
[0157] 角质层是由角质形成细胞构成的坚韧有弹性的板层结构，细胞内充满了角蛋白。 角蛋白是非水溶性的硬蛋白，有阻止化学物质内渗和体液外渗的作用，其中含量最高的角 蛋白叫做兜甲蛋白，约占角蛋白的80 %，兜甲蛋白的含量会直接影响皮肤水分的流失状况。
[0158] 本试验通过考察Hacat细胞兜甲蛋白（L0R)的表达来考察本发明提供的脂溶性茶 多酚的保湿性能。本测试分为空白组、实验组、试验对照组和标准组。
[0159] 取对数生长期的浓度为105个/mL的Hacat细胞，将培养的细胞接种于24孔板中，每 孔细胞液lmL，于37°C、含有C0 2的细胞培养箱中培养6h。
[0160] 向实验组细胞液中加入一定量本发明提供的脂溶性茶多酚，向对照实验组细胞液 中加入一定量对比实施例提供的绿茶提取物，置于37 °C、含有5 % C02及饱和湿度的细胞培 养箱中分别培养24h;
[0161] 弃除上清液，用预冷ros冲洗细胞两次，在培养孔中加入100yL裂解液，冰上裂解细 胞lOmin，收集细胞裂解液，以13000rpm离心10min，取上清液备用。
[0162] 按照ELISA试剂盒说明书，取细胞裂解液进行试验；
[0163] 利用BCA试剂盒检测不同组别蛋白质含量，各组L0R表达量采用蛋白量矫正，结果 如表4所示。
[0164]表4，脂溶性茶多酚对L0R表达的影响
[0165]
[0166] 由表4和图7可知，添加本发明和对比实施例提供的绿茶提取物后，人Hacat细胞中 L0R含量均有所增高，说明茶多酚具有促进L0R分泌的功效，本发明提供的脂溶性茶多酚与 对比实施例提供的茶多酚的活性相近。
[0167] 脂溶性茶多酚提取物的美白作用
[0168] 酪氨酸酶是黑素合成的主要限速酶，通过抑制酪氨酸酶的活性，可以减少黑素的 生成，酪氨酸酶活性检测方法有:放射性同位素法、免疫学法和生化酶学法，以生化酶学法 较为简单成熟。生化酶学法测定酪氨酸酶活性抑制的原理是:酪氨酸或多巴酸在酪氨酸酶 的作用下转化为多巴醌，通过比色法测定判断酪氨酸酶活性的抑制率，该方法通过体外测 定酪氨酸酶的活性，简单快捷。
[0169] 材料与试剂
[0170] 蘑菇酪氨酸酶 PH值=6.8的磷酸盐缓冲液
[0171] 左旋多巴（L-DOPA) 200yL 吸头
[0172] 96孔板 8通道加样枪
[0173] 酶标仪
[0174] 操作步骤
[0175] 测定本发明提供的脂溶性提取物的酪氨酸酶抑制作用
[0176] 本测试分为空白组、空白参照组、实验组和实验参照组。
[0177] 配制质量浓度为0.1 %的L-D0PA水溶液，配制pH值=6.8的磷酸盐缓冲溶液。
[0178]向实验组中加入5yL浓度为0. lmg/mL的本发明提供的脂溶性茶多酚提取物，向实 验参照组中加入5yL浓度为0.1mg/mL的本发明提供的脂溶性茶多酚提取物和45yL pH值= 6.8的磷酸盐缓冲溶液，向空白参照组加入5yL蘑菇酪氨酸酶的磷酸盐溶液，和45yL pH值= 6.8的磷酸盐缓冲溶液，向空白组加入50yL pH值=6.8的磷酸盐缓冲溶液。
[0179] 置于37 °C空气浴中20min，向每孔加入50yL、质量浓度为0.1 %的L-D0PA水溶液，于 37°C空气浴中静置20min，于475nm下测定每组的吸光度值，并计算本发明提供的脂溶性茶 多酚提取物对蘑菇酪氨酸酶的活性抑制率。
[0180]
[0181] 采用相同的测试方法计算采用对比实施例(现有技术)制备的脂溶性茶多酚提取 物以及阳性对照组曲酸对酪氨酸酶的抑制率。
[0182] 结果如图8所示，本发明提供的脂溶性茶多酚提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制率为 80.63%，采用现有技术制备的绿茶提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制率为63.28%，说明本发 明提供的脂溶性茶多酚提取物具有优异的美白作用，可以作为添加剂添加到化妆品中。
[0183] 综上，本发明提供的脂溶性茶多酚具有优良的抗衰老性能，和去除自由基的能力， 此外，还具有保湿性能和美白作用，本发明提供的脂溶性茶多酚可以作为添加剂加入到化 妆品中。
[0184] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种化妆品和/或护肤品，其特征在于，所述化妆品和/或护肤品中包含脂溶性茶多 酚，所述脂溶性茶多酚的含量为0.001 %-60 %。2. 根据权利要求1所述的化妆品和/或护肤品，其特征在于，所述脂溶性茶多酚包括通 式⑴：其中:办、1?3、1?4、1?5独立为11、(：6-&4脂肪酰基中的任意一种； R2为H、-〇H、C6-C14脂肪酰基中的任意一种； Ri、R2、R3、R4、R5中至少有一个为C 6-C14脂肪酰基。3. -种脂溶性茶多酚，其特征在于，所述脂溶性茶多酚包括通式(I):其中：办、1?3、1?4、1?5独立为11、(：6-&4脂肪酰中的任意一种； R2为Η、-0ΗΧ6-&4脂肪酰中的任意一种； Ri、R2、R3、R4、R5中至少有一个为C 6-C14脂肪酰基。4. 根据权利要求3所述的脂溶性茶多酚，其特征在于，所述脂溶性茶多酚中总茶多酚的 含量为60 %-95 %。5. -种如权利要求3或4所述的脂溶性茶多酚的制备方法，其特征在于，所述方法包括： 向绿茶中加入5-20体积倍率的溶媒提取，得到提取液； 纯化制备的所述提取液，并减压浓缩得到浓缩液； 皂化所述浓缩液，过滤、干燥，得到中间产物； 酰化中间产物，向酰化剂中缓慢加入所述中间产物，反应一定时间，得到所述脂溶性茶 多酚。6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述酰化过程之后还包括萃取纯化 工艺，所述萃取纯化工艺的萃取剂可以为乙酸乙酯、磷酸三丁酯、苯、四氯化碳等中的任意 一种或几种组合。7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，酰化所述中间产物后，还可以包括浓 缩反应液、干燥浓缩后的反应液中的任意一种或其组合，所述浓缩反应液的条件为5-20kPa、20-50°C 旋转蒸发 10_50min。8. -种如权利要求3或4所述的脂溶性茶多酚的应用，其特征在于，所述脂溶性茶多酚 应用于制备涂覆于皮肤外表面的制品。9. 根据权利要求8所述的脂溶性茶多酚的应用，其特征在于，所述制品中脂溶性茶多酚 的含量为0.001 %-60 %。
【文档编号】A61K8/49GK105997556SQ201610520129
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】洪民华, 刘丹, 赵兆, 洪奇, 吕智, 卢艳花, 何浩
【申请人】上海相宜本草化妆品股份有限公司, 华东理工大学