一种肝癌靶向光热治疗剂及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明提供了一种肝癌靶向光热治疗剂及其制备方法与应用，属于生物医学工程领域。本发明的肝癌靶向光热治疗剂通过以下方法制备得到：(1)制备生物素化纳米微泡；(2)制备Cy7荧光标记的生物素化抗GPC3抗体；(3)制备生物素化还原性氧化石墨烯(RGO)；(4)通过生物素?亲和素系统将上述三个步骤制得的产物偶联得到肝癌靶向光热治疗剂。本发明的光热治疗剂具有超声和荧光成像双重功能，通过超声靶向微泡破坏技术介导RGO靶向投递，实时监控光热治疗进程，该光热治疗剂可用于制备治疗肝癌的药物，具有优异的临床应用价值。
【专利说明】
一种肝癌靶向光热治疗剂及其制备方法与应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物医学工程技术领域，具体地，涉及一种肝癌靶向光热治疗剂及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]肝细胞肝癌(HCC)在世界癌症发病率中占第6位，死亡率占第3位。虽然肝癌以手术治疗为主，但只有9%?29%的患者能够手术切除。光热治疗(Photothermal therapy,PTT)是近年来发展的一种非侵入性热消融治疗技术，主要是以具有光吸收能力的物质充当光热治疗剂，在激光照射下使其局部温度升高来杀伤肿瘤细胞。肿瘤血管由两部分组成，一部分是宿主固有的血管，在肿瘤生长的过程中，宿主局部的微血管大部分被破坏，仅有动脉和较大的静脉可能保留下来，成为肿瘤血管系统的主干，该部分血管通透性正常，其管壁的最大孔径不超过10nm;另一部分是肿瘤新生血管，其结构不完善，基底膜不完整，管壁薄且缺乏平滑肌层，通透性明显升高，其管壁的最大孔径约380?780nm，有时血管外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连。纳米级微泡可以有效的通过孔径约380?780nm的血管壁进入肿瘤组织内部，更加高效的转运光热治疗剂。但一般纳米微泡对肿瘤组织的特异性较差，不能保证靶部位较高的光热治疗剂浓度。
[0003]理想的光热治疗剂应该在近红(外光区域650-950nm)具有较强的吸收，低毒性，表面可以连接上功能基团实现肿瘤的主动靶向治疗。PTT作为一种非侵入性热消融技术，可实现癌细胞的选择性杀伤，降低对正常细胞和组织的损伤。还原性氧化石墨烯(RGO)的光热治疗疗效肯定，但RGO无法独立显像且无主动靶向能力。RGO光热治疗作为一种有潜力的创伤小的肿瘤治疗技术，得到了广泛关注。然而，在治疗前需要通过合适的成像技术来确定肿瘤的位置、大小及光热治疗剂的体内分布情况和其在肿瘤部位的富集情况;在治疗中需要影像监测肿瘤部位及周边正常组织的温度变化，以保证良好的消融疗效并避免对周围正常组织的损伤;在治疗后通过成像技术来评价PTT效果。因此，若能够对RGO光热治疗剂优化升级，得到可同时应用于超声-荧光双模态成像和治疗的新型多功能诊疗一体化光热治疗剂，以实现肿瘤的可视化光热治疗，将会大大提高肝癌的临床治疗效果，减轻患者痛苦。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种可应用于超声的荧光成像肝癌靶向光热治疗剂及其制备方法与应用。
[0005]本发明首先提供了一种肝癌靶向光热治疗剂的制备方法，包括以下步骤:
[0006](I)制备生物素化纳米微泡；
[0007](2)制备Cy7荧光标记的生物素化抗肝癌细胞膜高表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)抗体;
[0008](3)制备生物素化还原性氧化石墨烯；
[0009](4)通过生物素-亲和素系统将上述三个步骤制得的产物偶联得到肝癌靶向光热治疗剂。
[0010]本发明制备肝癌靶向光热治疗剂的技术方案参见图1。
[0011 ]本发明的上述方法中，步骤(I)制备生物素化纳米微泡是将二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)、生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000-b1tin)的混合物溶解于氯仿和甲醇的混合溶液中，蒸干，加入PBS缓冲液复溶，移液到离心管中，密封，将内部空气置换为温室气体;振荡、水浴、超声匀质器处理、温育后继续超声处理，静置浮集上层微球即为生物素化纳米微泡。
[0012]进一步地，所述温室气体为全氟丙烷(C3F8)。
[0013]进一步地，步骤(I)中DSPC、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-b1tin的混合物是指三者按照质量比为18:1:1混合;氯仿和甲醇的混合溶液是指二者的体积比为2-2.5:1;所述PBS缓冲液pH值为7.4，浓度为0.15mol/l;所述水浴的温度为50-60°C ;水浴后的超声匀质器处理时间不超过30秒;温育温度为50-60°C，继续超声处理的时间为1-2.5分钟。
[0014]优选地，DSPC、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-b1tin的混合物是指三者的质量比为18:1:1;氯仿和甲醇的混合溶液是指二者的体积比为2:1 ；所述PBS缓冲液pH值为7.4，浓度为0.15mol/l;所述水浴的温度为55°C;水浴后的超声匀质器处理时间20秒;温育温度为550C，继续超声处理的时间为2分钟。
[0015]步骤(I)中使用超声均质器处理有利于使微米级微泡向纳米级微泡转化，有利于减小微泡粒径，并且使体系中的纳米微泡更加均匀、稳定。本发明方法中，步骤(2)所述的Cy7荧光标记的生物素化抗GPC3抗体是通过以下方法制备得到的:
[0016]①生物素化抗GPC3抗体购自英国ABCAM公司；
[0017]②配置交联反应液:精确称取NaHCO3粉末0.378g、Na2⑶3粉末0.053g、NaCl粉末
0.368g于50ml容量瓶中，加无菌双蒸水定容至50ml ；
[0018]③Cy7粉末溶于DMSO中，浓度lmg/ml，全程避光操作；
[0019]④将抗体以2mg/ml的浓度溶于交联反应液中，按抗体与Cy7质量比为Img比150yg的比例反应，将Cy7荧光染料缓慢加入抗体交联反应液中，轻轻摇晃混匀，避光40C反应8小时；
[0020]⑤滴加5mol/L的NH4Cl溶液25uL终止反应，避光4°C继续反应8小时；
[0021]⑥所得交联反应液通过葡聚糖凝胶GlO层析柱避光分离纯化，使用冷冻干燥机将滤液避光冻干，所得冻干粉即所制备的Cy7荧光标记生物素化抗GPC3抗体。
[0022]本发明采用葡聚糖凝胶GlO层析柱能够实现最大程度分离纯化Cy7荧光标记抗GPC3抗体，较其他层析柱能够取得最佳的分离纯化效果。
[0023]本发明方法中，步骤(3)所述的生物素化还原性氧化石墨烯通过以下方法制备得到，将生物素化聚乙二醇与2mg/mL还原性氧化石墨烯溶液按照质量比1:10比例混合后超声处理80-100min，然后离心去除不稳定的RG0，取上清液，用滤膜过滤去除多余的生物素化聚乙二醇，得到具有生物相容性的生物素化还原性氧化石墨烯RGO-PEG-B1tin。
[0024]优选地，超声处理时间为90min。采用超声匀质器，20kHz进行超声处理。
[0025]本发明方法中，步骤(4)的偶联方法包括以下步骤:
[0026]①调整步骤(I)制得的生物素化纳米微泡浓度为IX 108-3X 10%1)，加入过量的链霉亲和素混匀，37 0C下反应30min，得到溶液I;
[0027]②再将步骤(2)制得的Cy7荧光标记的生物素化抗GPC3抗体调整至浓度l_1.5mg/ml后，逐滴加入溶液I中，前后二者的体积比为4:1，混匀，37°C下反应30min;离心，吸取下层清液，洗去未结合的抗体得到溶液2 ；
[0028]③然后在溶液2中加入过量的生物素化还原性氧化石墨烯(RGO-PEG-B1tin)，4°C静置30分钟；
[0029]④用I3BS冲洗，洗去未结合的RGO-PEG-B1tin，形成携载抗GPC3抗体和RGO-PEG-B1tin 的纳米级超声微泡， S卩为肝癌革 E 向光热治疗剂。
[0030]本发明提供了上述制备方法制备得到的肝癌靶向光热治疗剂。
[0031]本发明还提供了上述肝癌靶向光热治疗剂在制备治疗或诊断肝癌药物中的应用。
[0032]进一步地，本发明提供一种治疗肝癌的药物，含有本发明所述的肝癌靶向光热治疗剂。
[0033]本发明制备得到的光热治疗剂具有超声和荧光成像双重功能，通过超声靶向微泡破坏技术介导RGO靶向投递，能够实时监控光热治疗进程，可用于制备治疗肝癌的药物，具有优异的临床应用价值。
【附图说明】
[0034]图1为本发明制备肝癌靶向光热治疗剂的方法流程图。
[0035]图2为肝癌靶向光热治疗剂的粒径测试结果，该结果显示复合物平均直径为(316± 31 )nm，该复合物粒径呈正态分布，分散度12.1 %。
[0036]图3为光学显微镜下实施例4制得的肝癌靶向光热治疗剂的图片。
[0037]图4为激光共聚焦显微镜下肝癌靶向光热治疗剂携带荧光的图片。
图5为激光共聚焦显微镜观察纳米微泡复合体与肝癌细胞及正常肝细胞的偶联图片，
a、b图为肝癌细胞，c、(1图为正常肝细胞。
图6为光学显微镜下，肝癌靶向光热治疗剂治疗后的HepG2细胞与未经治疗的HepG2细胞图，a、b图反映肝癌细胞迀移能力，c、d图反映肝癌细胞侵袭能力。
【具体实施方式】
[0038]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0039]若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0040]实施例1生物素化纳米微泡(Nanobubble)制备
[0041 ]①选质量比为 18:1:1的DSPC、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-b1tin为原料，将1mg磷脂混合物置于20ml圆底烧瓶中，逐滴加入氯仿与甲醇混合溶液(体积比2:1)，直至脂质混合物完全溶解。将烧瓶置于旋转蒸发仪器，真空状态下40°C蒸干；
[0042]②蒸干后，在烧瓶中加入5mlPBS缓冲液(pH= 7.4，0.15mol/l)复溶，移液到离心管中，密封，将内部空气置换为C3F8;
[0043]③银汞振荡器震荡40秒，再将溶液置于温度55°C下水浴，同时使用超声均质器(工作频率20kHz)进行处理20秒。处理结束后，同样温度孵育60分钟，之后继续超声均质器处理2分钟。静置浮集上层微球即所制生物素化纳米微泡。
[0044]④电子显微镜观察纳米微泡的形态和大小，平均粒径(497.9± 30.9)nm。光镜下阳离子微泡形态规整，大小均匀，分散度好。见图2。
[0045]实施例2生物素化抗GPC3抗体的Cy7荧光标记
[0046]①生物素化抗GPC3抗体购自英国ABCAM公司；
[0047]②配置交联反应液:精称NaHCO3粉末0.378g、Na2C03粉末0.053g、NaCl粉末0.368g于50ml容量瓶中，加无菌双蒸水定容至50ml;
[0048]③Cy7粉末溶于DMSO中，浓度lmg/ml，全程避光操作；
[0049]④将抗体以2mg/ml的浓度溶于交联反应液中，按抗体与Cy7质量比为Img比150ug的比例反应，将Cy7荧光染料缓慢加入抗体交联反应液中，轻轻摇晃混匀，避光40C反应8小时；
[0050]⑤滴加5mol/L的NH4Cl溶液25yL终止，避光4°C继续反应8小时；
[0051]⑥所得交联反应液通过葡聚糖凝胶GlO层析柱避光分离纯化，使用冷冻干燥机将滤液避光冻干，所得冻干粉即所制备的Cy7荧光标记生物素化抗GPC3抗体。
[0052]实施例3生物素化还原性氧化石墨烯的制备
[0053]①称取Ig石墨粉末，加入约40g的NaCl粉末混匀，用陶瓷研钵将该混合物充分研磨，至无明显石墨颗粒可见。加水溶解并过滤洗去混合物中NaCl粉末，并将研细的石墨置于烘箱中烘干。将烘干后的石墨粉末加入250mL圆底烧瓶中，边搅拌边小心地加入约23mL浓硫酸，在室温下搅拌8小时直至浓硫酸与石墨充分混合均匀。将反应容器置于冰水浴内，待烧瓶内混合物温度下降至15°C以下后，缓慢逐次加入共3g高锰酸钾固体，添加过程中不断搅拌，确保此过程中烧瓶内温度保持均匀而稳定。待高锰酸钾固体加完后，用加热套加热逐渐升温至750C，保温45min，并持续搅拌。此时向反应物中迅速加入约3mL蒸馈水并不断搅拌约5min，重复一遍后待反应物变色，升温过100°C后可加入40mL蒸馏水并将温度升至100°C，保温下搅拌15min。之后向反应物内再加入约140mL蒸馏水，并加入1mL 30%过氧化氢溶液，搅拌5min后反应结束。待反应物冷却后将其分置于50mL离心管中，以8000rpm离心保留沉淀并用5%稀盐酸溶液和蒸馏水分别洗涤数次，至溶液中溶质不能再被SOOOrpm离心下来为止，所得溶液即为氧化石墨烯胶体溶液，储存备用。
[0054]②利用水合肼还原氧化石墨烯(GO)制备还原性氧化石墨烯。水合肼与GO溶液按照1:10比例混合，在95°C水浴中反应24h，之后通过抽滤装置洗涤除去多余的水合肼，得到固体状的还原性氧化石墨烯(RGO)。
[0055]③由于还原过程中RGO表面官能团被还原作用去除，所以RGO不溶于水。为了获得水溶性的RGO，使用生物素化聚乙二醇(PEG-B1tin)通过非共价修饰RGO得到RGO-PEG-B1tin JEG-B1tin 与 2mg/mL RGO溶液按照质量比1:10比例混合后超声90min。然后使用14800rpm离心3h去除不稳定的RGO，取上清液，用10nm的滤膜过滤去除多余的PEG-B1tin，得到具有生物相容性的PEG-B1tin修饰的RGO(RGO-PEG-B1tin)。
[0056]实施例4制备携载还原性氧化石墨烯的荧光纳米微泡复合体(肝癌靶向光热治疗剂)
[0057]1、肝癌靶向光热治疗剂的制备
[0058]①吸取实施例1制备好的生物素化纳米微泡2ml(浓度为3XlO8Ail )，加入过量的链霉亲和素，轻微吹打使其混匀，37°C下反应30min，得到溶液I ；
[0059]②再将实施例2制备得到的荧光标记的生物素化抗GPC3抗体用无菌双蒸水调整至浓度lmg/ml后，逐滴加入溶液I中，前后二者的体积比为4:1，轻微吹打使其混匀，37°C下反应30min;离心，吸取下层清液，洗去未结合的抗体得到溶液2;
[0060]③然后在溶液2中加入实施例3制得的过量RG0-PEG-B1tin，4°C静置30分钟。
[0061 ] ④再用PBS冲洗两遍，洗去未结合的RGO-PEG-B1tin，形成携载抗GPC3抗体和RGO-PEG-B i ο t i η的纳米级超声微泡，S卩本发明所述的肝癌革El向光热治疗剂，4 °C避光保存，光学显微镜下图片见图3。
[0062]2、携载还原氧化石墨烯的荧光纳米微泡复合体的表征
[0063]①取少量的微泡复合体(即上述步骤制得的携载抗GPC3抗体和RGO-PEG-B1tin的纳米级超声微泡)于光学显微镜来表征纳米微泡复合体的形态及分散情况。血细胞计数仪计算纳米微泡复合体的浓度;动态光散射-激光粒度仪及Zeta电位测量仪，测定其粒径和Zeta电位，图4显示由CY7红色荧光标记的RGO及由绿色荧光标记的GPC3抗体与纳米微泡紧密相连，证明载RGO纳米靶向微泡复合体构建成功。
[0064]②采用紫外可见近红外光谱仪对制备的复合体在水中及培养基中的吸收光谱进行测试，测试用去离子水作为参比物，扫描波长范围为200-900nm。结果显示复合体在近红外光区域808nm处具有较强的吸收。
[0065]实施例5本发明的肝癌靶向光热治疗剂的靶向性检测
[0066]①体外培养肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株L02:细胞株在含10%胎牛血清的DMEM培养液中，5 %的CO2、37 °C下行常规细胞培养传代，取对数生长期的细胞进行实验。
[0067]②体外靶向实验:实验分两组:HepG2肝癌细胞组、L02正常肝细胞对照组，在HepG2、L02细胞培养板中分别加入等量的实施例4制得的肝癌靶向光热治疗剂，37°C孵育2小时，再用PBS液洗涤3次，最后采用激光共聚焦显微镜观察纳米微泡复合体与肝癌细胞及正常肝细胞的偶联情况。结果如图5所示，HepG2肝癌细胞组实验结果如图5的a图、b图所示，激光共聚焦显微镜下，带绿色荧光的肝癌靶向光热治疗剂与肝癌细胞紧密结合，PBS冲洗未能将其分离，证明该治疗剂与肝癌细胞靶向结合紧密，具有良好的靶向能力;L02正常肝细胞对照组实验结果如图c，d所示，激光共聚焦显微镜下，只有较少绿色荧光与正常肝细胞结合(或者为肝细胞的正常内吞作用，导致该治疗剂进入细胞胞质内)，证明本发明的肝癌靶向光热治疗剂具有肝癌特异性靶向结合能力。
[0068]实施例6本发明的肝癌靶向光热治疗剂的治疗效果检测
[0069]①治疗后肝癌细胞迀移能力实验:
[0070]在HepG2细胞培养板内加入实施例4制得的肝癌靶向光热治疗剂，之后以808nm近红外光进行光热治疗。取治疗后的HepG2细胞与未经治疗的HepG2细胞进行实验。分别将IX 14个治疗前后的HepG2溶于10yL无血清DMEM完全培养液，将10yL该细胞液接种在Transwell小室的上室(Costar公司，美国)，之后在Transwell小室的下室加入800yL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液。之后在含5 %的C02、37 °C的孵箱中培养12小时。再使用0.5 %结晶紫染料对Transwell小室的上室下壁进行染色，之后再光学显微镜下分别观察细胞数量并记录。结果如图6的a图，b图所示，b图中的细胞数要少于a图中的，显示经过光热治疗的HepG2细胞与未经治疗的HepG2细胞相比，穿过TranswelI小室的细胞减少，证明经过光热治疗的细胞迀移能力明显减弱。
[0071 ]②治疗后肝癌细胞侵袭能力实验:
[0072]将基质胶(BD公司，美国)以1:7的比例与无血清的DMEM完全培养液混匀，用以模拟细胞基质，检测肝癌细胞侵袭能力。分别将5 X 10 4个治疗前后HepG2细胞溶于200yL无血清DMEM完全培养液，将200yL该细胞液接种由基质胶处理后的Transwell小室的上室(Costar公司，美国)，之后在Transwell小室的下室加入800yL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液。之后在含5 %的⑶2、37 °C的孵箱中培养24小时。再使用0.5 %结晶紫染料对Transwe 11小室的上室下壁进行染色，之后再光学显微镜下分别观察细胞数量并记录。结果如图6的c图，d图所示，d图中的细胞数要少于c图中的，显示经过光热治疗的HepG2细胞与未经治疗的HepG2细胞相比，穿过含基质胶的Transwell小室的细胞减少，证明经过光热治疗的细胞侵袭能力明显减弱。
[0073]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种肝癌靶向光热治疗剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)制备生物素化纳米微泡； (2)制备Cy7荧光标记的生物素化抗GPC3抗体； (3)制备生物素化还原性氧化石墨烯； (4)通过生物素-亲和素系统将上述三个步骤制得的产物偶联得到肝癌靶向光热治疗剂。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)制备生物素化纳米微泡是将DSPC、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-b1tin的混合物溶解于氯仿和甲醇的混合溶液中，蒸干，加入PBS缓冲液复溶，密封，将内部空气置换为温室气体;振荡、水浴、超声匀质器处理、温育后继续超声处理，静置浮集上层微球即为生物素化纳米微泡。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，DSPC、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-b1tin的混合物是指将二者按照质量比为18:1: I混合;氯仿和甲醇的混合溶液是指二者的体积比为2-2.5:1;所述I3BS缓冲液pH值为7.4，浓度为0.15mol/l;所述水浴的温度为50-60°C ;水浴后的超声匀质器处理时间不超过30秒;温育温度为50-60°C，继续超声处理的时间为1-2.5分钟。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，DSPC'DSPE-PEGSOOCKDSPE-PEGSOOO-b1tin 的混合物是指二者的质量比为 18:1: I ;氯仿和甲醇的混合溶液是指二者的体积比为2:1;所述PBS缓冲液pH值为7.4，浓度为0.15mol/l;所述水浴的温度为55°C ;水浴后的超声匀质器处理时间20秒;温育温度为55°C，继续超声处理的时间为2分钟。5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的生物素化还原性氧化石墨烯通过以下方法制备得到，将生物素化聚乙二醇与2mg/mL还原性氧化石墨烯溶液按照质量比1:10比例混合后超声处理80-100!^11，然后离心去除不稳定的1^0，取上清液，用滤膜过滤去除多余的生物素化聚乙二醇，得到具有生物相容性的生物素化还原性氧化石墨烯RGO-PEG-B1tin06.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，超声处理时间为90min。7.如权利要求1-6任一所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)的偶联方法包括以下步骤: ①调整步骤(I)制得的生物素化纳米微泡浓度为IX 108-3 X 108/ml，加入过量的链霉亲和素，混匀，37 °C下反应30min，得到溶液I ； ②再将步骤(2)制得的Cy7荧光标记的生物素化抗GPC3抗体调整至浓度l-1.5mg/ml后，逐滴加入溶液I中，前后二者的体积比为4:1，混匀，37°C下反应30min;离心，吸取下层清液，洗去未结合的抗体得到溶液2 ； ③然后在溶液2中加入过量RG0-PEG-B1tin，4°C静置30分钟； ④用I3BS冲洗，洗去未结合的RGO-PEG-B1tin，形成携载抗GPC3抗体和RGO-PEG-B1tin的纳米级超声微泡，即为肝癌靶向光热治疗剂。8.权利要求1-7任一所述的制备方法制备得到的肝癌靶向光热治疗剂。9.权利要求8所述的肝癌靶向光热治疗剂在制备治疗或诊断肝癌药物中的应用。10.—种治疗肝癌的药物，其特征在于，含有权利要求8所述的肝癌靶向光热治疗剂。
【文档编号】A61P35/00GK106075440SQ201610457458
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】程文
【申请人】哈尔滨医科大学