多价肺炎球菌?acyw135脑膜炎球菌联合疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种多价肺炎球菌?ACYW135脑膜炎球菌联合疫苗，其中每剂量含肺炎球菌荚膜糖50～500μg/ml，A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖50～500μg/ml；肺炎球菌的血清型为以下血清型中的一种或多种：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F或23F。与现有技术相比，本发明提供的联合疫苗安全可靠，稳定性好，其应用前景十分广阔。
【专利说明】
多价肺炎球菌-ACYW135脑膜炎球菌联合疫苗
技术领域
[0001] 本发明涉及疫苗，具体说，是涉及一种联合疫苗，尤其是一种多价肺炎球菌-ACYWl 35脑膜炎球菌联合疫苗。
【背景技术】
[0002] 一、细菌性脑膜炎
[0003] 所谓细菌性脑膜炎，可由细菌或病毒感染所致。许多细菌均可引起本病，其中脑膜 炎球菌(也称奈瑟氏脑膜炎球菌)所致者最多，依次为流感杆菌、肺炎球菌、大肠杆菌及其他 革兰阳性杆菌、葡萄球菌、李司忒苗、厌氧菌等。细菌性脑膜炎是中枢神经系统严重的感染 性疾病，成人常见，儿童患者尤多，5岁以下的孩子最容易发生此症。在过去数十年，它通常 都以散发病例出现。婴儿早期阶段的症状包括:嗜睡、发烧、呕吐、拒绝饮食、啼哭增加，睡不 安稳。较大的患儿还可能出现:严重头痛、讨厌强光和巨大声音、肌肉僵硬，特别是颈部。细 菌性脑膜炎通常发病快，要求急症处理，诊断和治疗上的任何拖延都将造成永久性的残废 和死亡。治疗细菌性脑膜炎时等待影像学和脑脊液化验结果后在开始抗菌素治疗是不恰当 的，应作急症头颅CT检查，以排除颅内占位病变;随后立即行诊断腰穿；从开始血培养后就 应立即给予适当的抗菌素。
[0004] 但由于抗生素的应用日渐广泛，导致社区获得性细菌性脑膜炎的病原菌种群经常 在发生改变，以致细菌对抗生素的耐药性越来越强。如将新生儿期以后的所有细菌性脑膜 炎病例考虑在内，20-30年以前的主要病原菌是流感嗜血杆菌(45% )，以后相继为肺炎链球 菌（18 % )和脑膜炎奈瑟菌（14 % )。由于婴儿接种了B型流感嗜血杆菌蛋白一多糖结合疫苗， 细菌性脑膜炎发病率在10年前发生了显著改变。美国B型流感嗜血杆菌疾病的年发病人数 减少了55 %，流感嗜血杆菌性脑膜炎的年发病人数减少了94%。结果肺炎链球菌成为细菌 性脑膜炎的主要病原菌(47% )，以后相继为脑膜炎奈瑟菌(25% )和单核细胞增生李斯特菌 (8% )，这与目前荷兰报告的结果非常相似。故在患者被细菌侵袭前前进行预防，不失为一 种好的应对措施。
[0005] 二、现有技术的局限性
[0006] 疫苗是人类目前可以彻底消灭某一疾病的唯一武器，接种疫苗被认为是最有效、 最经济的疾病预防手段。疫苗是指用各类病原微生物制作的用于预防接种的生物制品。其 中用细菌或螺旋体制作的疫苗亦称为菌苗。疫苗分为活疫苗和死疫苗两种。常用的活疫苗 有卡介苗，脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、鼠疫菌苗等。常用的死疫苗有百日咳菌苗、伤寒菌 苗、流脑菌苗、霍乱菌苗等。接种疫苗是预防和控制传染病最经济、有效的公共卫生干预措 施，对于家庭来说也是减少成员疾病发生、减少医疗费用的有效手段。据估计，免疫接种每 年能避免200万至300万例因白喉、破伤风、百日咳和麻疹导致的死亡。随着疫苗的种类不断 增加，为减少接种次数以及减轻痛苦，人类又开发出了联合疫苗。联合疫苗是指由两种或两 种以上独立的抗原通过物理方法混合后制成的单一疫苗制剂，包括多联疫苗和多价疫苗两 种，这是通过1次接种预防多种传染病或同种但不同血清型传染病的免疫策略，其中多联疫 苗可预防不同的疾病，而多价疫苗可预防不同亚型或血清型的同种疾病。联合疫苗的制备 并不是各种不同抗原成分的简单混合，联合疫苗中各种成分之间所发生的化学或物理相互 作用会导致各类抗原免疫原性发生变化，因此在制备过程中需要解决以下问题：（1)是否会 影响各种抗原的免疫原应答效果；（2)不同抗原间是否存在不相容性或相互干扰；（3)不同 抗原成分之间是否会发生拮抗效应；（4)疫苗其他成分(如佐剂等）与各种抗原的混合比例 是否恰当。将多种抗原联合于同一剂疫苗中，需要在临床试验中证实各种组成成分疫苗的 安全性和免疫原性不会明显降低，而且在一些情况下，必须维持其效力。
[0007] 旁观者干扰效应是指多种多糖结合疫苗同时免疫，会影响未结合的抗原或结合其 他载体蛋白的结合疫苗的免疫作用。可能的机理包括对淋巴结中有限资源(例如抗原的获 得途径、趋化因子、活化信号、滤泡树突细胞和滤泡T辅助细胞等)的竞争，Thl/Th2/Th0平衡 的改变和/或T细胞调控机制的诱导。不同的疫苗所受到旁观者干扰效应的影响不一样，乙 肝病毒和Hib的免疫反应对此作用最敏感。最可能的假设就是对T细胞平衡的要求更严格。 英国自1992年引入Hib结合疫苗以来，几乎消灭了Hib感染所引起的疾病。但从1999年起， Hib结合疫苗在1岁以上儿童中免疫失败的案例逐年增多。在2000年至2002年间，英国以 DTaP-Hib代替DTwPHib，同时增加 MenC-CRM197，这种干扰效应越来越显著。但在免疫程序中 增加 IPV，能够增强Hib和HBV的免疫原性。临床研究结果显示，DTaPIPV-HBV/Hib-TT免疫接 种后，Hib 和 HBV 的血清阳转率比 DTaP-IPV/Hib-TT+HBV 低。DTaP-HBV-IPV/Hib-TT 与 PCV7-CRM197同时接种，比DTaP-HBV-IPV/Hib-TT单独接种的HBV和Hib-TT的血清阳转率和GMC均略 有降低，这是因为受到了同时免疫的CRM 197结合物的影响。对13价肺炎球菌多糖结合疫苗的 临床研究结果显示，与DTaP-IPV/Hib (2、3和4个月）+MenC (2和4个月）一起免疫，PCV13-CRM197 组的Hib血清阳转率比PCV7-CRM197组低。对10价肺炎球菌多糖结合疫苗(PHiD-CV)的临床研 究结果显示，DTaP-HBV-IPV/Hib-TT+PCV7_CRMi97接种的婴儿中，HBV的血清阳转率和GMC普 遍高于 DTaP-HBV-IPV/Hib-TT+PHiD-CV。
[0008] 传统疫苗多数采用油乳制剂，一般需要加入佐剂以发挥其免疫效果。但是这些疫 苗在体内活性浓度维持的时间比较短，不能够实现可控缓释的目的，一般需要重复注射。现 代疫苗是一种利用现代分子生物学技术，使用抗原通过诱发机体产生特异性免疫反应以预 防和治疗疾病或达到某种特定的医学目的生物制剂。现代疫苗比传统疫苗更安全，但是其 缺少免疫原性。因此，急需发展有效和安全的免疫佐剂及疫苗黏膜递送系统，并将其应用于 新一代疫苗中。利用灭活或减毒病原体、细胞组分(如荚膜多糖)或非活性细菌毒素组成的 传统疫苗通常可以诱导机体产生中和抗体来预防感染，免疫佐剂在此过程中发挥着重要的 作用。佐剂是指能增强机体抗原免疫应答或改变免疫应答类型的物质。它主要通过免疫调 节(细胞因子网络的修饰）、抗原递呈(抗原构象的维持）、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导、抗 原靶向和储存等方式诱发机体产生长期、高效的免疫反应，提高机体保护能力，同时又减少 免疫物质的用量，降低疫苗生产成本。传统疫苗多为病原体或其裂解物，免疫原性强。但随 着现代生物技术的发展，基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗等新型疫苗抗原的纯 度越来越高，免疫原性却通常较弱，需要使用佐剂来提高对抗原的保护作用。然而目前获准 用于人体试验的疫苗佐剂并不多，经典的铝盐佐剂就是其中之一。铝盐佐剂在提高抗体水 平和安全方面已获得长期的实践证实，但其与许多重组或合成的多肽疫苗抗原共同免疫时 未能激发有效的免疫应答，使之很难满足新型疫苗发展的需要。因此，对适用于临床应用的 新佐剂的研究与开发势在必行。
[0009] 现有的佐剂主要有两种类型，即疫苗递送系统(免疫刺激复合物、脂质体、可生物 降解的聚酯类微球/纳米粒)和免疫刺激佐剂(脂多糖、单磷酰质体、胞壁酰肽）。目前，抗原 载体递送系统中研究最多、最成功的是可生物降解的聚酯类纳米粒。缓释微球包裹技术开 始于20世纪50年代，首先应用于药物释放系统的研究。直到1979年，Morris等才首次将这项 技术应用在免疫学研究，在制备微球疫苗免疫小鼠时发现，该系统可以持续释放抗原，刺激 抗体产生，而不会诱发免疫耐受，微球佐剂也才开始引起人们极大的关注。由于制备的纳米 粒和病原体大小相当，能穿过组织间隙，可通过机体最小的毛细血管，且纳米粒具有生物相 容性、可生物降解性、低毒性、靶向性、药物定位传递以及能使药物或疫苗抗原长效释放和 表达等特点，这不仅可引起全身的系统免疫反应，还可以产生强的局部黏膜免疫反应，因 此，可生物降解纳米粒已被广泛应用于药物或疫苗递送系统和基因治疗研究中。微球佐剂 作为抗原的一个稳定的隔离载体，发挥着保护抗原蛋白的作用，使抗原在体内免受温度、酸 碱、渗透强度、消化液等因素的破坏，而且微球抗原还能避免母源抗体的中和作用，实现抗 原可控制释放，产生相当于常规疫苗多次接种激发的免疫效果，从而延长疫苗免疫期，减少 免疫次数。目前，常用的可作为纳米载体的高分子材料主要有壳聚糖、透明质酸以及海藻酸 钠等。其中，壳聚糖来源广泛、价格低廉，体内不积蓄，无抗原免疫性，生物相容性优良等特 点，使其成为一种理想的疫苗佐剂载体。国内外已有不少用壳聚糖吸附包裹蛋白、酶和质粒 DNA等的报道，许多抗肿瘤药物和抗炎药物都已被制成壳聚糖微球/纳米粒。研究发现，壳聚 糖/质粒DNA包裹颗粒通过小鼠皮下注射可引起荧光素标记基因的局部表达，且产生长达二 十多天的较高的抗体滴度;据报道，壳聚糖纳米粒作为疫苗的载体可以使给药方法更为简 便，更容易得到广泛应用;Chew等利用复凝聚法制备壳聚糖DNA纳米粒口服疫苗;研究表明， 壳聚糖纳米粒能促进壳聚糖和DNA之间的相互作用，有助于纳米粒进行基因疫苗的黏膜免 疫;颜承云等采用乳化溶剂挥发法制备了 N-琥珀酰壳聚糖纳米粒。
[0010] 但由于免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能非特异性地改变或增强机体对抗 原的特异性免疫应答，以增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身无抗原性 的物质。研究发现，如果免疫佐剂不同合适的疫苗配合应用，那它们将不能发挥作用。因此， 选择合适的疫苗，包括抗原组分、免疫反应类型、免疫接种途径等，可避免负面作用，并可提 高疫苗的稳定性和免疫效果。
【发明内容】
[0011] 针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种免疫原性比现有技术更 好的联合疫苗，使患者一次可接种肺炎球菌和ACYW135脑膜炎球菌疫苗，以达到一次接种， 多次免疫的效果。
[0012] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0013] 多价肺炎球菌-ACYW135脑膜炎球菌联合疫苗，其含有肺炎球菌荚膜糖、A、C、Y、 Wl 35群脑膜炎球菌荚膜糖和载体蛋白，载体蛋白用于与荚膜糖共价结合。
[0014] 优选地，肺炎球菌荚膜糖、A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖和载体蛋白的质量比 为（5~25):(5~25):1。
[0015] 优选地，肺炎球菌荚膜糖含量为50~500μg/ml。
[0016] 更优选地，肺炎球菌荚膜糖含量为100~350μg/ml。
[0017] 更优选地，肺炎球菌荚膜糖含量为200μg/ml。
[0018] 优选地，A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖含量为50~500μg/ml。
[0019] 更优选地，A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖含量为100~350μg/ml。
[0020] 更优选地，A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖含量为200μg/ml。
[0021] 优选地，肺炎球菌的血清型为以下血清型中的一种或多种：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、 9N、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22FS23F。
[0022] 优选地，上述联合疫苗中与荚膜糖共价结合的载体蛋白选自破伤风类毒素(TT)、 白喉类毒素(DT)、白喉毒素突变体交叉反应物质197(CRM 197)、肺炎球菌表面蛋白A(rPspA)、 B群脑膜炎球菌外膜蛋白（MenB-OMP)、流感嗜血杆菌D蛋白（HiD)、绿脓杆菌外毒素 A(PEA)、 大肠杆菌热敏感肠毒素、肺炎球菌溶血素、百日咳毒素、绿脓杆菌菌毛、淋球菌P-3-2菌毛或 乙型肝炎病毒表面抗原。
[0023] 由于重复使用载体蛋白在机体内可能会引起干扰作用或产生竞争抑制作用，将直 接影响疫苗对接种人群的免疫效果，发明人在对现有的载体蛋白进行了大量实验，发现当 使用特定的载体蛋白时，将有效避免上述竞争抑制情况的发生。
[0024]作为一种优选实施方案，上述疫苗的载体为肺炎球菌表面蛋白A(rPspA)。
[0025] 作为一种优选实施方案，上述疫苗的载体为B群脑膜炎球菌外膜蛋白（MenB-OMP)。 作为本发明的另一目的是在于提供上述联合疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0026] 步骤al)制备并分离提纯所选用的载体蛋白；
[0027]步骤bl)向步骤al所得载体蛋白中加入精制A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖，其 中每种血清型的脑膜炎球菌的加入质量相同；
[0028]步骤cl)向步骤bl所得混合物中加入精制肺炎球菌荚膜糖，其中6B型荚膜糖的加 入质量是其余荚膜糖加入质量的2倍；
[0029]步骤dl)分离纯化步骤cl所得多糖-载体蛋白，得多价肺炎球菌-ACYW135脑膜炎球 菌联合疫苗原液。
[0030] 本发明的另一目的，是提供一种多价肺炎球菌-ACYW135脑膜炎球菌联合疫苗，其 含有肺炎球菌荚膜糖、A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖、载体蛋白和辅料，载体蛋白用于与 荚膜糖共价结合。
[0031] 优选地，上述疫苗的辅料选自壳聚糖和/或脂质体。
[0032]更优选地，壳聚糖的脱乙酰度为50%~60%。
[0033] 更优选地，脂质体粒径范围为50nm~lOOOnm。
[0034] 更优选地，壳聚糖或脂质体与荚膜糖的质量比介于5:1和1:5之间。
[0035] 本发明的另一目的在于提供制备上述疫苗的方法，包括如下步骤：
[0036]步骤a2)分别精制A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖和肺炎球菌荚膜糖；
[0037] 步骤b2)制备并所选用的载体蛋白；
[0038] 步骤c2)依次将多糖-壳聚糖偶联体与分离提纯后载体蛋白偶联结合；
[0039]步骤d2)分离纯化步骤c2所得偶联体，得多价肺炎球菌-ACYWl 35脑膜炎球菌联合 疫苗原液。
[0040]本发明的另一目的在于提供上述联合疫苗的冻干保护剂，所述保护剂为单一成分 的蔗糖，且作为疫苗的冻干骨架，换言之，该保护剂中不含有明胶和/或海藻酸盐。
[0041 ]更优选地，蔗糖的初始浓度不小于60%，优选为大于70%。
[0042]更优选地，蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量为不大于20%;较佳地，为4~ 20% ;作为一种较佳的实施方式，根据所需制备的疫苗的不同为7~10%、8~10%、10~ 15%或 12~15%;最佳为7%、8%、10%或 12%。
[0043] 更优选地，蔗糖选用工业级分析纯或药用级。
[0044] 作为本发明的另一目的，是提供疫苗冻干保护剂的制备方法，包括如下步骤：
[0045] 步骤a3)无菌环境下，配制高温灭菌处理的蔗糖母液，将制备完成的疫苗原液加入 蔗糖母液中，混匀制备成含有蔗糖保护剂的疫苗原液半成品；
[0046] 步骤b3)将步骤a3所得半成品进行预冻；
[0047] 步骤c3)将步骤b3所得预冻后半成品进行干燥，即得冻干疫苗。
[0048] 更优选地，步骤b3中预冻时快速降温至-55°C~_50°C，维持4h~8h或15h~20h。
[0049] 更优选地，步骤c3包括第一阶段干燥和第二阶段干燥。
[0050] 进一步，步骤C3中第一阶段干燥时升温至-45 °C~-33 °C维持40h~96h和/或升温 至-40 °C ~-30 °C 维持 12h ~22h。
[0051] 相应地，作为一种较佳实施方式，根据所需制备的疫苗的不同，步骤c23中第一阶 段干燥时升温至-45°C~_40°C，维持50h，再升温至-40°C~-33°C，维持22h;或升温至-42°C ~-33°C，维持96h;或升温至-42°C~_38°C，维持42h，再升温至-35°C~_33°C，维持16h;或 升温至-40 °C~-38 °C，维持44h，再升温至-35 °C~-30 °C，维持14h;亦或升温至-40 °C~-38 。(：，维持40h，再升温至-35°C~_30°C，维持12h。
[0052] 更优选地，步骤c3中第二阶段干燥时设定不同时间内升温至(TC~30°C，不同升温 阶段继续维持18h~32h(根据水的三相性:压强，沸点或熔点，温度是一个相互作用的过程， 不同的升温速率下，热辐射速率不同，最后所得到的剂品外观及水分含量也不相同；同时结 合蔗糖跟不同病毒会产生不同的玻璃化转化温度;通过调节审问速率来实现最优值；因此 此处可根据现有技术中的方法进行调节，下同）。
[0053]与现有技术相比，本发明具有以下优势：
[0054] 1.该联合疫苗是含ACYW135脑膜炎球菌多糖与多价肺炎球菌多糖的免疫缀合物， 其免疫原性与现有的ACYW135脑膜炎球菌疫苗或肺炎球菌疫苗相当，诱发的多糖抗体水平 为单独的疫苗抗体水平之和，可以在更广阔的人群中引起免疫应答；
[0055] 2.由于采用一种载体蛋白，有效地避免在注射过程中出现的副反应；
[0056] 3.脂质体可有效保护抗原直达靶细胞，而疫苗原液在被脂质体包覆后，改性后的 多糖-壳聚糖偶联体上的-CHO可防止脂质体在体内氧化，有效降低疫苗缓释率。
[0057] 4.对本发明提供的联合疫苗的冻干剂型的研制不仅有利于增加疫苗保存时间，也 便于疫苗运输，更为适用于其它联合疫苗的冻干；
[0058] 5.本发明提供的技术方案避免冻干剂型疫苗中含动物源性明胶高分子、食源性海 藻酸盐组分保护剂免疫接种引发过敏反应，提供的冻干疫苗易溶性良好、成本低廉、制备容 易、保存方便，冻干后疫苗的稳定性、复溶性均明显优于现有技术同类产品；
[0059] 6.以蔗糖为疫苗冻干制剂唯一保护剂和成型剂骨架，可利用工业级分析纯或药用 级蔗糖残留杂质，成分可控，完全排除过敏源性；
[0060] 7.疫苗制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。
[0061 ]综上，本发明提供的多价肺炎球菌-ACYWl 35脑膜炎球菌联合疫苗安全可靠，稳定 性好，其应用前景十分广阔。
【具体实施方式】
[0062] 下面结合实施例和对比例对本发明作进一步详细、完整地说明。实施例中出现的 试剂或仪器在【具体实施方式】中无如特殊说明，均为市售，且按照其说明书进行操作，在此不 作赘述。
[0063] 实施例1-1
[0064] 一、制备ACYWl 35脑膜炎球菌荚膜糖
[0065] 1.分别采用CY培养基对A、C、Y、W135群脑膜炎球菌株37°C进行发酵，发酵液经甲醛 灭活，离心取上清后，利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)进行沉淀。然后用0.5~IM的NaCl 对复合物沉淀进行解离，添加冰乙醇至终浓度25% (v/v)，沉淀核酸，然后加冰乙醇至终浓 度75% (v/v)，沉淀得到粗糖。
[0066] 2.上述粗糖用醋酸钠溶液溶解，冷酚抽提5-6次，最后超滤浓缩去除苯酚残留，经 75% (v/v)乙醇沉淀得到精糖，置-20 °C保存备用。
[0067] 二、制备肺炎球菌多糖
[0068] 1.选取7种血清型(4、68、叭、14、18(：、19?、23?)的肺炎球菌培养；
[0069] 2.分别提纯以上各种血清型肺炎球菌中抗原性强的荚膜糖:肺炎球菌灭活后离心 收集上清液，经超滤浓缩，根据各肺炎球菌血清型特性分别加入适量(体积分数为70 %的） 预冷乙醇，离心收集，得粗糖;将粗制多糖溶于乙酸钠溶液中，然后按1:2比例以冷酚混匀， 离心去除蛋白，反复酚提5-6次，收集上清，用蒸馏水透析，透析后液体加2mol/L氯化钙溶 液，加入乙醇搅拌，离心去除核酸，收集上清，补加乙醇(终浓度80 %搅拌），离心收集沉淀， 用乙醇、丙酮洗涤沉淀，脱水干燥后得精制荚膜糖，置-20°C保存备用。
[0070] 三、制备肺炎球菌表面蛋白A(rPspA)
[0071 ]将PspA蛋白克隆至大肠杆菌进行表达并分离纯化，具体包括：
[0072] 1.目的基因的优化和重组表达质粒的构建
[0073] 在GenBank中获取PspA基因序列并进行优化，加上Hi s标签后进行全基因合成，将 合成的序列经SacI和NdeI双酶切后，定向克隆至同样双酶切的表达载体pET_30a( + )中，转 化感受态大肠杆菌BL2 IStar (DE3)，37 °C过夜培养，挑取阳性单克隆菌落，扩增培养后提取 质粒，用NdeI和SacI双酶切鉴定，并送测序，将测序正确的重组表达质粒命名为pET-30a_ rPspA〇
[0074] 2.重组蛋白的诱导表达及纯化
[0075] 复苏工程菌以1:100的比例接种2 X LB培养基，在37 °C，237r/min下扩大培养，当菌 体值约为12时，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，37°C诱导4h，取样进行SDS-PAGE分析离心收 集诱导菌体，加入生理盐水重悬洗涤2次，以1:10(g/mL)的比例加入05mol/LNaC15mmol/L咪 唑20mmol/LPB(pH7.4)的缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，8000 X g离心40min，收集上清， 于镍离子层析柱中进行纯化，按说明书操作纯化产物的及分析将载体pET-30a( + )转化的大 肠杆菌BL21Star(DE3)全菌体(对照)和将上步纯化样品经SDS-PAGE分离后电转移至硝酸纤 维素膜上，用5%脱脂奶粉摇床轻微振荡封闭2h;加入His鼠源单抗（I :800稀释），4°C过夜； TBST清洗3次，加入HRP标记的羊抗鼠 IgG( 1:2000稀释），室温孵育Ih;洗涤3次，DAB显色。
[0076]四、制备多价肺炎球菌-ACYW135脑膜炎球菌联合疫苗
[0077] 1.制备ACYWl35脑膜炎球菌荚膜糖-载体蛋白缀合物
[0078]将步骤一所得精制A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖以质量比15:1的比例加
[0079]入步骤三所得肺炎球菌表面蛋白A中。
[0080] 2.制备多价肺炎球菌-ACYW135脑膜炎球菌联合疫苗原液
[0081] 将精制肺炎球菌荚膜糖以质量比10:1的比例加入上述ACYW135脑膜炎球菌荚膜 糖-载体蛋白缀合物中，肺炎球菌荚膜糖加入质量= ACYWl35脑膜炎球菌荚膜糖加入质量为 1:1〇
[0082] 3.多价肺炎球菌-ACYW135脑膜炎球菌联合疫苗的分离纯化
[0083] 用Superdex200凝胶过滤柱（2.6cmX 60cm)进行分离纯化，洗脱液为20mM的磷酸缓 冲液(PH7.4)，流速为3mL/min。
[0084] 以制备5mL疫苗原液为例，加入荚膜多糖4、利、14、19?及23?各20(^，寡糖18(：10(^ g及多糖6B 400yg，A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖各375yg;PspA蛋白150yg。经过凝胶层 析柱纯化后进行高效液相色谱分析该联合疫苗，结果显示所有血清型均有明显的色谱峰， 相邻两峰之间分离度R>1.5,拖尾因子T的范围为0.95~1.05,并且荚膜糖含量达到《中华 人民共和国药典》2010版及本申请
【发明内容】
中的最低要求含量。
[0085] 需要指出的是，由于肺炎球菌蛋白与肺炎球菌荚膜糖是同源的，因此二者之间具 有协同作用，但本发明中的蛋白与荚膜糖之间的缀合不仅限于上述氨基还原法，只要是能 实现该偶联结果的方法均应包括在本申请的发明范围中。
[0086] 实施例1-2
[0087] 本实施例与实施例1-1的差别仅在于，本实施例中的多糖添加顺序为同时添加肺 炎球菌荚膜糖和A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖。顺序调换后A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚 膜糖无色谱峰，证明按原比例同时加入肺炎球菌荚膜糖和A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖 会形成竞争关系，影响A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖的正常缀合过程，因此无法实现本 技术方案。
[0088] 实施例1-3
[0089] 本实施例与实施例1-1的差别仅在于，本实施例中的多糖添加顺序为先添加肺炎 球菌荚膜糖，后添加 A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖。顺序调换后A、C、Y、W135群脑膜炎球 菌荚膜糖无色谱峰，证明按原比例先加入肺炎球菌荚膜糖和后加入A、C、Y、W135群脑膜炎球 菌荚膜糖会形成竞争关系，影响A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖的正常缀合过程，因此无 法实现本技术方案。
[0090] 实施例1-4
[0091] 本实施例与实施例1-1的差别仅在于，还包括将制备的多价肺炎球菌-A、C、Y、W135 群脑膜炎球菌联合疫苗进行冻干的步骤：
[0092]五、制备冻干疫苗保护剂
[0093] 1.配制浓度为70%、经121°C灭菌处理15min的蔗糖母液；
[0094] 2.将实施例1-1所得分离纯化的多价肺炎球菌-ACYW135脑膜炎球菌联合疫苗置于 无菌容器内，加入步骤1配制成的蔗糖母液，使蔗糖浓度至10%，得混匀制备成含有蔗糖保 护剂的疫苗原液半成品，再分别以1.0ml/瓶的规格灌装于西林瓶内以进行后续的冻干工 乙；
[0095] 3.将步骤2所得半成品进行预冻，预冻时快速降温至-55°C，维持15h-20h;
[0096] 4.将步骤4所得预冻后半成品进行第一阶段干燥:升温至-45°C~_40°C维持50h， 升温至-40°C~_33°C维持22h;
[0097] 5.将步骤4所得第一阶段干燥后半成品进行第二阶段干燥:设定不同时间内升温 至(TC~30°C，不同升温阶段继续维持28h;再制备冻干原液中蔗糖浓度为10%的多价肺炎 球菌-ACYW135脑膜炎球菌联合疫苗，冻干疫苗的制备方法可参考现有技术制备，在此不做 赘述。
[0098] 实施例1-5
[0099] 本实施例与实施例1-1的差别仅在于，制备的肺炎球菌荚膜糖的血清型为：1、5、 68、7卩、利、14、18(：、19卩和23卩。
[0100] 实施例1-6
[0101 ]本实施例与实施例1-1的差别仅在于，载体蛋白为B群脑膜炎球菌外膜蛋白，且多 糖添加顺序为先添加肺炎球菌荚膜糖，后添加 A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖。
[0102] 实施例2-1
[0103 ]本实施例与实施例1 -1的差别仅在于，步骤四的具体操作为：
[0104] 1.壳聚糖制备
[0105] 制备脱乙酰度为55%的壳聚糖，步骤可参考现有技术，在此不做赘述。
[0106] 2.荚膜糖与壳聚糖共偶联
[0107] 0.1MTBS溶液缓冲液下，4°C、pH8.55-8.60下，将制备的肺炎球菌荚膜糖与A、C、Y、 W135群脑膜炎球菌荚膜糖分别与脱乙酰度55%的壳聚糖共反应20小时，为保证疫苗有效 性，荚膜糖与壳聚糖质量比为1:1)，反应结束后用透析袋充分透析，除去未反应壳聚糖，收 集多价肺炎球菌-ACYWl 35脑膜炎球菌联合疫苗原液。
[0108] 3.偶联体改性
[0109]取步骤2荚膜糖-壳聚糖偶联体30mL，搅拌条件下缓慢滴加2mL25%戊二酸，200r/ min搅拌反应6小时;反应完毕后，用0.0IMPBS洗三次后，定容至30mL，使荚膜糖-壳聚糖偶联 体表面未与荚膜糖反应的-OH改性为-CHO; N2、4 °C保存备用。
[0110] 4.与PspA载体蛋白共偶联
[0111] 〇. IMTBS溶液缓冲液下，4 °C、pH4.0-9.0下，将步骤3所得多价肺炎球菌荚膜糖-壳 聚糖偶联体与ACYWl 35脑膜炎球菌荚膜糖-壳聚糖偶联体与PspA蛋白共反应24小时，其中多 价肺炎球菌荚膜糖-壳聚糖偶联体:A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖-壳聚糖偶联体:PspA 蛋白质量比为5:5:2。
[0112] 5.多价肺炎球菌-A、C、Y、W135群脑膜炎球菌联合疫苗的分离纯化
[0?13] 用Superdex200凝胶过滤柱(2.6cmX 60cm)进行分离纯化，洗脱液为20mM的磷酸缓 冲液(PH7.4)，流速为3mL/min。
[0114]经过凝胶层析柱纯化后进行高效液相色谱分析该联合疫苗，结果显示所有血清型 均有明显的色谱峰，相邻两峰之间分离度R> 1.5，拖尾因子T的范围为0.95~1.05，并且荚 膜糖含量达到《中华人民共和国药典》2010版及本申请
【发明内容】
中的最低要求含量。
[0115] 实施例2-2
[0116] 本实施例与实施例2-1的差别仅在于，还包括将制备的多价肺炎球菌-ACYW135脑 膜炎球菌联合疫苗进行冻干。
[0117] 实施例2-3
[0118] 本实施例与实施例2-1的差别仅在于，制备的肺炎球菌荚膜糖的血清型为：1、5、 68、7卩、利、14、18(：、19卩和23卩。
[0119] 实施例2-4
[0120] 本实施例与实施例2-1的差别仅在于，载体蛋白为B群脑膜炎球菌外膜蛋白。
[0121] 实施例3-1
[0122] 本实施例与实施例2-1的差别仅在于，步骤四还制备脂质体，具体操作可参考现有 技术，在此不做赘述。使用前取IOOyg脂质体与多价肺炎球菌-ACYW135脑膜炎球菌联合疫苗 原液混合均匀后皮下注射。
[0123] 实施例3-2
[0124] 本实施例与实施例3-1的差别仅在于，制备的肺炎球菌荚膜糖的血清型为：1、5、 68、7?、利、14、18(：、19?和23?。使用前取10(^8脂质体与多价肺炎球菌40￥1135脑膜炎球菌 联合疫苗原液混合均匀后皮下注射。
[0125] 实施例3-3
[0126] 本实施例与实施例3-1的差别仅在于，载体蛋白为B群脑膜炎球菌外膜蛋白。
[0127] 保护及免疫原性试验
[0128] 将上述实施例制备的联合疫苗(冻干疫苗冷藏保存12个月后）以人用剂量稀释100 倍免疫14-18g的NIH小鼠，每组10只，每一试验疫苗用两组，皮下注射结联合疫苗，阴性对照 组注射0.5ml无菌生理盐水，每2周免疫1次，每次0.5ml，共3次。初次免疫后，按照中国药典 2005版，采用杯法测定平均累计释放度（％ )，结果如表1所示;第4周采血，采用ELISA方法检 测血清抗上述所有荚膜糖的免疫原性;第8周以肺炎球菌和A、C、Y、W135群脑膜炎球菌灌胃 攻击，计算疫苗保护率，疫苗保护率（％ )=(对照组发病率-免疫组发病率）X 100%。所得阳 转率结果见表2，滴度见表3，疫苗保护率见表4。
[0129] 弄1
[0137] 注:实施例1-4、1-6和实施例2-2、2_4以及实施例3-3分别与实施例1-1和实施例2-1以及实施例3-1数据无显著性差异(P>0.05)，在此不做赘述。
[0138] 表4
[0140]综上可知，本发明提供的联合疫苗同时具备多种抗原，且阳转率达到了85%以上， 因此采用本发明提供的技术方案得到的联合疫苗可显著诱导脑膜炎球菌荚膜糖、肺炎球菌 荚膜糖抗体的产生，保护率高，免疫应答效果好。且实施例3提供的联合疫苗的抗体释放度 明显慢于其他实施例，具有较好的缓释效果。
【主权项】
1. 多价肺炎球菌-ACYW135脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于:含有肺炎球菌荚膜糖、A、 C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖和载体蛋白，载体蛋白用于与荚膜糖共价结合。2. 权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于:肺炎球菌荚膜糖、ACYW135脑膜炎球菌荚膜 糖和载体蛋白的质量比为(5~25): (5~25): 1。3. 权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于:肺炎球菌的血清型为以下血清型中的一种 或多种：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22FS23F。4. 权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于:所述疫苗中与两种荚膜糖共价结合的载体 蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素突变体交叉反应物质197、肺炎球菌表面蛋 白A、B群脑膜炎球菌外膜蛋白、流感嗜血杆菌D蛋白、绿脓杆菌外毒素 A、革兰氏阴性细菌外 膜蛋白、大肠杆菌热敏感肠毒素、肺炎球菌溶血素、百日咳毒素、绿脓杆菌菌毛、淋球菌P-3-2菌毛或乙型肝炎病毒表面抗原。5. 权利要求4所述的联合疫苗，其特征在于:疫苗的载体为肺炎球菌表面蛋白A。6. -种制备权利要求1~5任一所述的联合疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤al)制备并分离提纯载体蛋白； 步骤bl)向步骤al所得载体蛋白中加入精制A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖，其中每 种血清型的脑膜炎球菌的加入质量相同； 步骤c 1)向步骤b 1所得混合物中加入精制肺炎球菌荚膜糖，其中6B型荚膜糖的加入质 量是其余荚膜糖加入质量的2倍； 步骤dl)分离纯化步骤cl所得荚膜糖-载体蛋白，得多价肺炎球菌-ACYW135脑膜炎球菌 联合疫苗原液。7. 多价肺炎球菌-ACYW135脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于:含有肺炎球菌荚膜糖、A、 C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖、载体蛋白和辅料，载体蛋白用于与荚膜糖共价结合。8. 权利要求7所述的联合疫苗，其特征在于:辅料选自壳聚糖和/或脂质体。9. 权利要求7所述的联合疫苗，其特征在于:壳聚糖或脂质体与荚膜糖的质量比介于5: 1和1:5之间。10. -种制备权利要求7~9任一所述的联合疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤a2)分别精制A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖和肺炎球菌荚膜糖； 步骤b2)制备并分离提纯载体蛋白； 步骤c2)依次将荚膜糖-壳聚糖偶联体与步骤b2所得载体蛋白偶联结合； 步骤d2)分离纯化步骤c2所得偶联体，得多价肺炎球菌-ACYW135脑膜炎球菌联合疫苗 原液。
【文档编号】A61K39/39GK106075430SQ201610511431
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】艾智武, 李津, 程超, 吴克
【申请人】武汉博沃生物科技有限公司