专利名称：在双室包装中含有类维生素a、类维生素a增效剂和植物雌激素的皮肤护理产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及在双室包装的第一室内含有类维生素A和在第二室内含有类维生素A增效体系和植物雌激素的稳定的皮肤护理组合物。
背景技术：
类维生素A(例如视黄醇和视黄基酯)是化妆品中常用的成分。视黄醇(维生素A)是一种人体内天然产生的内源性化合物并且对于正常的上皮细胞分化是必须的。天然和合成维生素A衍生物已经广泛用于治疗多种皮肤疾病并且已经用作皮肤修复或再生剂。视黄酸已经用于治疗多种皮肤疾病，例如痤疮、皱纹、牛皮癣、老年斑和变色。参见例如Vahlquist，A等，J.Invest.Dermatol.，Vol.94，Holland D.B.和Cunliffe，W.J.(1990)，pp.496-498；Ellis，C.N.等，″Pharmacology of retinols in Skin，″Basel，Karger，Vol.3，(1989)，pp.249-252；和PCT专利申请WO 93/19743。
但是类维生素A的代谢可以导致类维生素A转化为不利的副产物，由此使得对治疗皮肤疾病有利的视黄酸的产量降低。因此一些现有技术的文献建议使用各种天然活性剂以协助治疗皮肤疾病如痤疮、皱纹、牛皮癣、老年斑和变色。例如，植物雌激素(即具有雌激素样活性并且在植物中发现的天然化合物)已经迅速用于美容和治疗目的。已知雌激素和作用类似雌激素的合成化合物会增加真皮层的厚度和减少老化皮肤上的皱纹形成。皮肤的变化如皮肤干燥、皮肤的弹性损失和绝经期后产生的肥胖归因于缺乏雌激素产生。雌激素疗法可以防止或延缓与老化皮肤相关的许多变化(Creidi等，″Effect of aConjugated Oestrogen Cream(Premarin)on Aging FacialSkin″，Maturitas，19，p.211-213，1994)。
在现有技术中已经公开了一些用于美容效果的植物雌激素。例如，美国专利5,728,726建议使用染料木黄酮来抑制酪氨酸激酶活性。美国专利5,847,003和5,834,513(受让与Avon)公开了使用含氧酸和含氧二酸与类维生素A结合。这两篇Avon的专利公开了使用抗氧化剂生物类黄酮，如染料木黄酮和大豆黄素作为任选成分。
但是已经发现植物雌激素诱导视黄醇的氧化，因此会引起视黄醇的降解。尽管在现有技术中已经描述了用于释放组合物的多室体系，但是没有公开需要将植物雌激素和类维生素A分开。例如，美国专利5,914,116(本发明的申请人)描述了用于将两种不同皮肤活性剂分开的两个分离的容器以提供双皮肤增益，其中一个室含有类维生素A和第二个室含有一种提供第二和不同效果的第二活性剂。
因此，仍然需要提供类维生素A的皮肤增益，同时提供植物雌激素的类维生素A增强效果的组合物。
发明内容
本发明提供一种稳定的皮肤护理产品，含有一种含有约0.001％-约10％类维生素A的第一组合物；一种含有0.0001％-约50％至少一种类维生素A增效剂和约0.001％-约10％植物雌激素的第二组合物；第一室用于储存第一组合物；并且第二室用于储存第二组合物，第一和第二室彼此结合在一起。
本文所使用的术语“包含”是指包括、由......组成和/或基本上由......组成。除在实施例和对比实施例中之外，或者另外明确指明，说明书中所有表示物质含量或比例、或反应条件、物质的物理性能和/或用途的数值应理解为用“约”来修饰。
作为一种优选成分，本发明组合物含有类维生素A，选自视黄基酯、视黄醇、视黄醛和视黄酸，优选视黄醇或视黄基酯。术语“视黄醇”包括视黄醇的下列异构体全反式视黄醇，13-顺式-视黄醇，11-顺式-视黄醇，9-顺式-视黄醇，3，4-二脱氢-视黄醇，3，4-二脱氢-13-顺式-视黄醇；3，4-二脱氢-11-顺式-视黄醇；3，4-二脱氢-9-顺式-视黄醇。优选的异构体是全反式视黄醇，13-顺式-视黄醇，3，4-二脱氢-视黄醇，9-顺式-视黄醇。最优选的是全反式视黄醇，这是因为它广泛的商业来源。
视黄基酯是视黄醇的一种酯。术语“视黄醇”已经如上所定义。适用于本发明的视黄基酯是视黄醇的C1-C30酯，优选C2-C20酯，并且最优选C2、C3和C16酯，因为它们更容易得到。视黄基酯的例子包括但不限于视黄基棕榈酸酯、视黄基甲酸酯、视黄基乙酸酯、视黄基丙酸酯、视黄基丁酸酯、视黄基戊酸酯、视黄基异戊酸酯、视黄基己酸酯、视黄基庚酸酯、视黄基辛酸酯、视黄基壬酸酯、视黄基癸酸酯、视黄基十一酸酯、视黄基月桂酸酯、视黄基十三酸酯、视黄基肉豆蔻酸酯、视黄基十五酸酯、视黄基十七酸酯、视黄基硬脂酸酯、视黄基异硬脂酸酯、视黄基十九酸酯、视黄基花生四烯酸酯、视黄基山嵛酸酯、视黄基亚油酸酯、视黄基油酸酯。
用于本发明的优选酯选自视黄基棕榈酸酯、视黄基乙酸酯和视黄基丙酸酯，因为这些酯最容易得到且因此而最便宜。还优选视黄基亚油酸酯和视黄基油酸酯，这是因为它们的效果好。
在本发明的组合物中视黄醇或视黄基酯的用量为约0.001％-约10％，优选用量为约0.01％-约1％，最优选用量为约0.01％-约0.5％。
相信类维生素A按照表1所述的机理在皮肤中通过酶作用而转化为视黄酸。
视黄醇在表皮中的代谢酶作用 ARAT/LRAT＝酰基辅酶A(CoA)∶视黄醇酰基转移酶/卵磷脂∶视黄醇酰基转移酶CRABPII＝细胞视黄酸结合蛋白II令人惊奇的是已经发现某些化合物抑制ARAT/LRAT、视黄醛还原酶、CRABPII和视黄酸氧化(后者由细胞色素P450体系催化)，而某些其他化合物促进视黄醇脱氢酶。这些化合物在本文中总体命名为“增效剂”并且编号为组B1-B5，如上述表1中所示。单独或者彼此之间组合使用的增效剂通过增加用于转化为视黄酸的视黄醇的量并抑制视黄酸的降解而加强了类维生素A的作用。增效剂与类维生素A(例如视黄醇、视黄基酯、视黄醛、视黄酸)联合作用，后者原生存在于皮肤中。但是优选的组合物在其中包括类维生素A与增效剂共同存在以使性能最优化。
本发明部分地包括一种第二组合物，含有占组合物重量的约0.0001％-约50％，优选约0.001％-约10％，最优选约0.001％-约5％至少一种增效剂化合物，其中在体内转谷酰胺酶试验中，该化合物或者单独或者以组合浓度为10mM抑制转谷酰胺酶达到50％以上，以及一种美容可接受的载体。
本发明组合物中包括的增效剂选自(a)双增效剂，其中两者都选自相同的B2；B3；B4；(b)增效剂的二元组合，选自B1/B2、B1/B3、B1/B4、B1/B5、B2/B3、B2/B4、B2/B5、B3/B4、B3/B5、B4/B5；(c)增效剂的三元组合，选自B1/B2/B3、B1/B2/B4、B1/B2/B5、B1/B3/B4、B1/B3/B5、B1/B4/B5、B2/B3/B4、B2/B3/B5、B2/B4/B5、B3/B4/B5；(d)增效剂的四元组合，选自1B1/B2/B3/B4、B1/B2/B3/B5、B1/B2/B4/B5、B1/B3/B4/B5、B2/B3/B4/B5和(e)五组增效剂的组合B1/B2/B3/B4/B5。
优选的组合物包括至少一种来自不同组的增效剂(即上述组(b)-(e))。但是选自不同组的增效剂的任意组合也可以用于本发明的组合物以得到所需的增效效果。
包括在本发明中作为增效剂的化合物首先基于下列原则选择这些化合物以表A中所列的某种浓度经过下文2.1-2.7部分所述的特定酶的体外Microsomal试验的能力。化合物(单独或与另一种增效剂组合)随后进行下述的体外转谷酰胺酶试验，单独或组合浓度为10mM。如果这种组合抑制转谷酰胺酶到超过50％，那么它就适用于本发明。如果单独测试一种增效剂，并经过转谷酰胺酶试验，那么它可以与另一种经过转谷酰胺酶试验的增效剂或增效剂组合进行组合。
本发明优选的组合物含有单独浓度为10mM时抑制转谷酰胺酶到超过50％的增效剂的组合。
如本文所使用的术语“护理”是指预防和治疗干燥皮肤、痤疮、光损伤皮肤、皱纹、老年斑、老化皮肤、提高角质层弹性、优化皮肤色泽、控制皮脂分泌并通常提高皮肤的质量。该组合物可以用来改进皮肤脱屑和表皮分化。
增效剂是一种经过下文2.1-2.7部分所述的体外Microsomal试验的化合物。本发明的化合物以表A中所列的浓度抑制或增强一种酶到至少表A中所列的一般％，然后进行(单独或与另一种化合物组合)体外转谷酰胺酶试验以测定其是否适用于包括在本发明的组合物中。
表A增效剂测试浓度和％抑制/提高ARAT/LRAT试验 (鉴定B1增效剂)
视黄醇脱氢酶试验 (鉴定B2增效剂)
视黄醛还原酶试验 (鉴定B3增效剂)
CRABPII拮抗剂试验 (鉴定B4增效剂)
视黄酸氧化试验 (鉴定B5增效剂)
用于测定化合物是否适用于包括在本发明组合物中的体外Microsomal试验如下1.原料全反式视黄醇，全反式视黄酸，棕榈酰基辅酶A，二月桂酰基磷脂酰胆碱，NAD和NADPH，购于Sigma化学品公司。用于Microsomal试验的类维生素A储存液在HPLC级乙腈中制备。所有用于HPLC分析的类维生素A标准储存液在乙醇中制备，储存在-70℃液氮中，并且在不储存时于黄色光下保持在冰上。其他化学品和抑制剂购于美容材料供应商或化学品公司，如Aldrich或国际香精和香料公司。
2.方法2.1 RPE微粒体的分离(修改自J.C.Saari和D.L.Bredberg，″CoA and Non-CoA Dependent Retinol Esterification inRetinal Pigment Epithelium″，J.Bill Chem.263，8084-8090(1988))。
50个移走视网膜和眼房水的冷冻对切牛视杯从美国W.L.Lawson公司，Lincoln，NE获得。眼睛过夜解冻并且用镊子剥除彩色的虹膜。每只视杯用2×0.5mL冷缓冲液洗涤(0.1M PO4/1mM DTT/0.25M蔗糖，pH7)，方法是用美术刷或橡胶刮棒刮刷暗色细胞。细胞悬浮液加入到虹膜，并且悬浮液用Teflon搅拌子在烧杯中搅拌几分钟。通过粗滤器过滤悬浮液(Spectra/Por，925μm孔径的聚乙烯筛网)以除去大颗粒，并且所得暗色悬浮液用Glas-Col(带有一个马达驱动的Teflon均质器)均质化。细胞匀浆在20,000g离心30分钟(Sorvaal模式RC-5B离心机，带有SS34马达，在2.5×10cm管中，14,000 RPM)。所得上清液进一步在150,000g离心60分钟(Beckman L80超速离心机，带有SW50.1马达，在13×51mm管中，40,000RPM)。所得丸粒采用加热体系分散在约5mL 0.1M PO4/5mM DTT，pH7缓冲液中(Ultrasonics公司，W185D超声波细胞破碎机)，所得微粒体分散液分装在小管中并储存在-70℃。微粒体的蛋白质浓度采用BioRad染色结合试验测定，BSA用作标准物。
2.2鼠肝微粒体的分离(修改自R.Martini&M.Murray，″Participation of P450 3A Enzymes in Rat HepaticMicrosomal Renitoic Acid 4-Hydroxylatiod′，Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993))。
大约6克冷冻的鼠肝脏(来自Harlan Sprague Dawley鼠，Accurate Chemical and Scientific公司)在3倍体积的0.1Mtris/0.1M KCl/1mM EDTA/0.25M蔗糖，pH7.4缓冲液中采用BrinkmannPolytron均质化。所得组织悬浮液在上述马达驱动的Teflon均质器中进一步均质化。所得匀浆连续离心在10,000g 30分钟、在20,000g30分钟、在30,000g 15分钟，所得上清液在105,000g高速离心80分钟。丸粒如上所述超声波离解在约5mL 0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mMMgCl2，pH7.4缓冲液中，并且分装储存在-70℃。蛋白质浓度如上所述进行测定。
2.3 ARAT和LRAT活性的测试(鉴定B1)下述程序是描述于J.C.Saari&D.L.Bredberg，″ARAT&LRATActivities of Bovine Retinal Pigment Epithelial Microsomes″，Methods Enzymol.190，156-163(1990)中的方法的改进。制备以下缓冲液并储存在4℃0.1M PO4/5mM二硫苏糖醇，pH7.0(PO4/DTT)中。在试验时加入2mg BSA/mL缓冲液以得到PO4/DTT/BSA工作缓冲液。1mM视黄醇底物在乙腈中制备并储存于-20℃氮气下的棕色瓶中。制备4mM棕榈酰基辅酶A在工作缓冲液中的溶液(分装储存)和4mM二月桂酰基磷脂酰胆碱在乙醇中的溶液并储存于-20℃。抑制剂制备成10mM在水、乙醇、乙腈或DMSO中的储存溶液。采用含有50μg/mL丁基化羟基甲苯(BHT)的纯乙醇制备灭活溶液，并且含有50μg/mL BHT的己烷溶液用作提取液。
向2打兰玻璃小瓶中依次加入下述物质PO4/DTT/BSA缓冲液以使总体积为500μL，5μL酰基供体(4mM棕榈酰基辅酶A和/或二月桂酰基磷脂酰胆碱)，5μL抑制剂或溶剂空白液(10mM储存液或进一步稀释)，然后是大约15μg RPE微粒体蛋白(大约15μL约1mg/mL微粒体蛋白分装液)。在37℃孵育5分钟以使反应温度平衡并随后加入5μL 1mM视黄醇。将小瓶盖上盖子，旋涡振动5秒，在37℃孵育30-90分钟。加入0.5mL乙醇/BHT使反应猝灭。加入3mL己烷/BHT以抽提类维生素A，数次旋涡振动小管若干秒并且在低速离心小管5分钟以快速将层分离。将上面的己烷层转移在清洁的小瓶中，并用如上所述的另外3mL己烷/BHT再次抽提水性层。合并己烷层并通过在37℃于氮气流中用加热的铝块干燥来蒸发己烷。在-20℃储存干燥后的残余物直到HPLC分析。如下所述通过整合HPLC信号分别定量视黄基棕榈酸酯和视黄基月桂酸酯以测定ARAT和LRAT活性。
注意孵育溶液含有40μM酰基供体、100μM或更少的抑制剂、10μM视黄醇、大约30μg/mL微粒体蛋白和约0.1M PO4，pH7/5mM DTT/2mg/mLBSA。加入视黄醇之后的所有步骤都在暗室或棕色光下进行。
2.4视黄醇脱氢酶活性的测试(鉴定B2)制备下列储存溶液50mM KH2PO4，pH7.4缓冲液，无菌过滤。
10mM全反式视黄醇(Sigma R7632)，于DMSO中。
200mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐(NADP)(Sigma N0505)，于无菌水中。
40mM测试化合物，于适当溶剂中(水、缓冲液、乙醇、氯仿或DMSO)。
鼠肝微粒体的1∶10稀释液，于50mM KH2PO4，pH7.4缓冲液(4μg/μl)。
向带有螺旋盖的2打兰玻璃小瓶中依次加入下列物质缓冲液以使最终体积为400μl25μl稀释的微粒体(最终＝100μg)，煮沸的微粒体作为对照物，普通的微粒体作为测试样品。
4μl 200mM NADP(最终＝2mM)1μl 40mM测试化合物(最终＝100μM)
8μl 10mM视黄醇(最终＝200μM)将小瓶在37℃振动水浴中孵育45分钟。向每个小瓶中加入500μl冰冷却的乙醇以使反应猝灭。用冰冷却的己烷抽提类维生素A两次(每次抽提2.7ml)。在第一次抽提期间将视黄基乙酸酯(5μl 900μM储存液)加入到每个小管中作为在每个样品中监测抽提效果的方法。旋涡振动样品10秒，然后在1000rpm、5℃于Beckman GS-6R离心机中轻柔离心5分钟。在每次抽提后，将含有类维生素A的己烷上层从水性层中转移到清洁的2打兰小瓶中。在轻柔的氮气流下蒸发掉己烷。在-20℃储存干燥后的残余物直到HPLC分析。
2.5视黄醛还原酶活性的测试(鉴定B3)如上所述使用下列替代物质制备所有的储存溶液10mM全反式视黄醛(Sigma R2500)，DMSO中。替代视黄醇。
200mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸四钠盐，还原形式(NADPH)(Sigma N7505)，无菌水中。替代NADP。
向带有螺旋盖的2打兰玻璃小瓶中依次加入下列物质缓冲液以使最终体积为400μl25μl稀释的微粒体(最终＝100μg)，煮沸的微粒体作为对照物，普通的微粒体作为测试样品。
4μl 200mM NADPH(最终＝2mM)1μl 40mM测试化合物(最终＝100μM)3μl 10mM视黄醛(最终＝75μM)接下来进行与上述相同的孵育和抽提操作。
2.6测试CRABPII拮抗剂(鉴定B4)2.6.1合成CRABPIIa.表达体系在pET 29a-c(+)质粒(Novagen)上克隆CRABPII基因。克隆的基因被强噬菌体T7转录和翻译信号控制。T7聚合酶源由宿主细胞大肠杆菌BLR(DE3)pLysS(Novagen)提供。后者在lacUV5控制下含有T7聚合酶的染色体拷贝，由存在的IPTG诱导。质粒按照制造商说明手册(Novagen)转化进大肠杆菌BLR(DE3)pLysS细胞。
b.诱导转化后细胞的过夜培养物在含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的2xYT中稀释到1∶100。细胞在37℃振荡生长，直到600nm处的OD值达到0.6-0.8。然后加入IPTG，终浓度为1mM。培养物再孵育2小时。在室温下5000g离心10分钟收集细胞。丸粒储存在-20℃。
2.6.2纯化按照Norris和Li，1997所述的方法进行纯化。
a.裂解冷冻的丸粒在室温解冻并重新悬浮于1-2倍丸粒体积的新鲜制备裂解缓冲液中(50mM Tris/HCl，pH8，10％(w/v)蔗糖，1mM EDTA，0.05％(w/v)叠氮化钠，0.5mM DTT，10mM MnCl2，2.5mM苯甲基磺酰氟，2.5mM苯甲脒，6μg/mL DNA酶)。溶解产物在室温孵育30分钟。进一步用超声波进行裂解(在10,000psi下六次30秒，期间在冰上放置五次30秒)。裂解产物的不溶部分在4℃于15000rpm离心1小时除去，上清液储存在-20℃。
b.在Sephacryl S300上的凝胶过滤来自步骤a.的上清液在室温下装入2.5×100cm sephacryl S-300(Pharmacia)柱中。洗脱缓冲液是20mM Tris-HCl，pH8，0.5mM DTT，0.05％叠氮化钠(缓冲液A)。流动速率是2mL/min。收集的2mL级份用280nm处的紫外吸光度来检测。用SDS-page测定级份代表的峰，以检测CRABPII的存在。
c.阴离子交换色谱2mL含有CRABPII的凝胶过滤级份装入季铵阴离子交换柱FPLC(快速蛋白质液相色谱)，型号monoQ(Pharmacia)。使用梯度缓冲液室温下在20分钟内洗脱CRABPII，从100％缓冲液A到30％缓冲液B(100％缓冲液B＝缓冲液A+250mM NaCl)。每分钟收集1mL级份。再次用SDSpage检测CRABPII的存在。CRABPII储存在4℃，之后用带有小瓶平台附件的Micromodulyo 1.5K冷冻干燥(Edwards High VacuumInternational)。粉末状样品储存在室温，直到它们用于结合试验。
d.检测CRABPII的存在CRABPII的表达和纯化采用变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)在7-15％聚丙烯酰胺凝胶(Biorad)上分析。10μl样品与10μl 2X缓冲液(100mM Tris-HCl，pH6.8，4％SDS，0.2％BPB，20％甘油，1mM DTT)混合并通过加热失活(80℃，2分钟)。将样品加载到凝胶上，浸泡在1X Tris-甘氨酸缓冲液(Biorad)中，在室温下施加恒定电流(25mA)1小时。考马斯蓝染色后，根据用Benchmark预染蛋白质梯度带(GibcoBRL)测定的分子量来鉴定蛋白质。
采用蛋白印迹来证实CRABPII的存在。在SDS-PAGE中分离的蛋白质使用Biorad暗盒转移到Immobilon-P转移膜(Millipore)上。转移在1X Tris-甘氨酸缓冲液(Biorad)+10％甲醇中进行。施加电流(60mA)3小时以使蛋白质迁移到膜中。此后，室温下将膜用5％干乳在1X TBS中封闭1小时，并在相同的缓冲液中于4℃用CRABPII的一抗标记(鼠抗克隆5-CRA-B3的1/1000稀释液)过夜。接下来，膜用PBS(3×5分钟)洗涤，然后与二抗，结合过氧化物酶的抗鼠抗体(ECLTM，Amersham)的1∶2000稀释液在室温孵育1小时。
膜用1xPBS(3×5分钟)洗涤，根据制造商的使用指南采用ECL检测试剂盒(Amersham)检测蛋白质。纯化后的CRABPII浓度使用BSA试剂盒(Pierce)测定。
2.6.3放射活性结合试验220pmol CRABPII在20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中与15pmol放射活性全反式视黄酸(NEN)(总体积为70μL)孵育。为了进行竞争性试验，过量的另一种配体(6670∶1、670∶1或70∶1)加入到混合物中。反应在室温下于暗处进行1小时。为了将未结合的全反式视黄酸与结合的全反式视黄酸分离，使用6kD短切微型色谱柱(Biorad)。使用Microplex多道移液器根据制造商的使用指南(Pharmacia)将储存缓冲液弃去。将样品装入柱中，在30分钟内利用重力进行分离。结合CRABPII的视黄酸(RA)出现在滤液中，而游离的RA残留在柱中。滤液的放射活性采用闪烁计数器来测定。
2.7 NADPH依赖型视黄酸氧化的试验(鉴定B5)下述程序是描述于R.Martini&M.Murray，″Participation ofP450 3A Enzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4-Hydroxylation″，Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993)中的方法的改进。制备下列试验缓冲液并且储存在4℃0.1MPO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2，pH7.4。试验时，在缓冲液中制备60mMNADPH溶液。如上所述制备抑制剂储存液、酸化乙醇/BHT猝灭溶液和己烷/BHT。1mM视黄酸工作溶液通过用乙醇稀释15mM储存液(在DMSO中)来制备。
向2打兰小瓶中依次加入下列物质试验缓冲液以使最终体积为500μl，20μl 60mM NADPH，5μl抑制剂或溶剂空白液，然后是大约2mg鼠肝脏微粒体蛋白。在37℃孵育5分钟，随后加入5μl 1mM视黄酸工作溶液。在37℃连续孵育60分钟(不盖盖子，因为氧化过程需要氧分子加入到NADPH中)。如上所述用酸化乙醇/BHT猝灭，并用己烷/BHT抽提。如下所述通过整合HPLC信号来定量并快速洗脱极性视黄酸代谢物(假定是4-氧代视黄酸)。
注意加入视黄酸之后的所有步骤都在暗室或棕色光下进行。最终孵育溶液含有2.4mM NADPH、100μM或更少的抑制剂、10μM视黄酸、大约4mg/mL鼠肝脏微粒体蛋白和大约0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mMMgCl2。
单独的类维生素A的HPLC分析用HPLC定量的类维生素A样品通过将每个小瓶中的残余物用100μl甲醇溶解来制备。溶液转移到1mL加盖小瓶内的150μl玻璃圆锥管中，紧密盖紧，并且置于Waters 715自动取样器内。立即注射60μl等份样品并且分析类维生素A含量。
色谱仪由Waters 600梯度控制器/泵、Waters 996光电二极管阵列检测器和Waters 474扫描荧光检测器组成。两种HPLC方案用于类维生素A分析。对于ARAT和LRAT试验，视黄醇和视黄醇酯的分离用Waters 3.9×300mm C18 Novapak反相分析柱和Waters SentryNovaPak C18保护柱，采用调节到流速为1mL/min的80∶20(v/v)甲醇/THF作为流动相进行10分钟。监测洗脱液在325nm的吸光度和在325ex/480em的荧光。较短的Waters 3.9×150mm C18 Novapak反相分析柱和Waters Sentry NovaPak C18保护柱用于分离视黄醇和视黄酸氧化试验中的酸和醇，采用描述于A.B.Barua，″Analysis ofWater-Soluble CompoundsGlucoronides″，Methods Enzymol.189，136-145(1990)中的梯度体系的改进方法。该体系包括从含有10mM乙酸铵的68∶32(v/v)甲醇/水到4∶1(v/v)甲醇∶二氯甲烷的20分钟线性梯度，随后是在流速为1mL/min保持5分钟。柱洗脱液在300nm-400nm监测。
根据清楚地分辨每个试验中相关视黄酸、醇、醛和/或酯的能力和分离的相对快速来选择这些方案。用HPLC鉴定各种类维生素A是根据未知峰的驻留时间与购买的已知类维生素A标准物之间的确切匹配，未知峰的UV光谱分析(300-400nm)与购买的已知类维生素A之间进行比较。
在转谷酰胺酶试验中适用于进一步检测的增效剂包括但不限于列于下表B1-B5的增效剂。
ARAT/LRAT抑制剂(B1)分类 化合物 ％ 总体 ％ ％％ ％总体抑制 TG(IC 50) 抑制 抑制 抑制 抑制TGARAT(10μm) ARAT(100μm) LRAT(10μm) LRAT(100μm)(-ROH/RE)类胡萝卜素 藏红花酸 3.75E-05 15％ 34％ 015％脂肪酸酰胺& 乙酰基鞘氨醇 6.78E-06 19％+/-12 62％+/-11 10％+/-10 50％+/-18其他表面活性剂脂肪酸酰胺& Cl3 β-羟基酸/酰胺 17％ 28％25％其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 蓖麻油MEA 3.25E-05其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 椰油酰氨基丙基甜菜碱 25％其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 椰油羟乙基咪唑啉 2.84E-07 68％68％其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 椰油酰胺-MEA(或椰油酰基单 11％ 13％34％其他表面活性剂乙醇酰胺)脂肪酸酰胺& 甘油基-PCA-油酸酯 41％+/-658％+/-2其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 己酰胺 20％其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 己酰基鞘氨醇 9.99E-05 28％+/-437％+/-9其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 羟乙基-2-羟基-C12酰胺 3.29E-05 35％35％其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 羟乙基-2-羟基-C16酰胺25％30％其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 月桂酰基肌氨酸 20％其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 利多卡因 12％ 0其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 亚油酰胺-DEA(或亚油酰基59％ 12％+/-13 43％+/-3 11％+/-9 51％+/-15其他表面活性剂 二乙醇酰胺)脂肪酸酰胺& 亚油酰胺-MEA(或亚油酰基单1.61E-05 14％ 35％20％+/-835％其他表面活性剂乙醇酰胺)脂肪酸酰胺& 亚油酰氨基丙基二甲基胺 69％+/-18 75％+/-4其他表面活性剂分类化合物 总体％ ％％ ％％ TG(IC 50)抑制 抑制 抑制 抑制总体抑制ARAT(10μm) ARAT(100μm) LRAT(10μm) LRAT(100μm)(-ROH/RE)脂肪酸酰胺& Melin酰胺 64％+/-15 43％+/2 21其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 肉豆蔻酰基肌氨酸41％+/-14 11％+/-11其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 油酰基甜菜碱2.80E-05 47％其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 棕榈酰胺-MEA 6％ 23％ 12％ 33％其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 硬脂基羟基酰胺10％ 10％其他表面活性剂脂肪酸酰胺& Utrecht-1 21％ 43％ 54％ 51％ 48％+/-6其他表面活性剂脂肪酸酰胺& Utrecht-2 3.47E-06 42％ 83％+/-951％ 92％+/-3其他表面活性剂类黄酮 柑桔黄素 33％ 14％香料 烯丙基α-紫罗兰酮 16％+/-1422％+/-23 17％+/-1036％/-7香料 α-大马酮 3.35E-04 67％+/-2783％+/-12 87％+/-6 98％+/-1香料 α-紫罗兰酮 9.27E-0445％+/-27 49％+/-30香料 α-甲基紫罗兰酮 67％ 77％香料 α-萜品醇 26％ 25％香料 β-大马酮45％ 84％ 52％ 92％香料 婆罗醇70％ 75％香料 大马烯酮 23％ 70％ 29％ 79％香料 δ-大马酮58％ 87％ 64％ 95％香料 二氢α-紫罗兰酮 13％ 18％香料 藏红花酸乙酯 51％ 49％香料 小茴香醇 12％ 4％香料 γ-甲基紫罗兰酮 21％ 38％香料 异丁基紫罗兰酮8％45％香料 异环香叶醇18％ 16％
分类化合物总体％ ％％ ％％ TG(IC 50) 抑制 抑制 抑制 抑制总体抑制ARAT(10μm) ARAT(100μm) LRAT(10μm) LRAT(100μm)(-ROH/RE)香料异大马酮80％ 92％香料Lyral 1.27E-04 76％ 71％香料檀香酮 23％ 12％香料檀香醇 15％ 43％香料Timberol34％ 33％香料Tonalid 50％ 33％香料Traseolide 41％ 21％杂项椰油基三甲基氯化铵 27％杂项Urosolic Acid 1.46E-06 21％ 28％非环香料柠檬醛 20％非环香料香茅醇 30％ 0非环香料金合欢醇 9.35E-05 23％+/-18 53％+/-18 10％+/-7 53％+/-19非环香料香叶醇7.83E-0313％ 32％非环香料香叶基香叶醇 38％+/-12 81％+/-616％+/-9 77％+/-13非环香料里呐醇 28％ 0非环香料壬二烯醇20％非环香料Pseudoionone12％ 37％磷脂二辛基磷脂酰乙醇胺23％ 50％+/-2 0 17％+/-17脲 二甲基咪唑烷酮 22％脲 咪唑烷基脲 35％
视黄醇脱氢酶活化剂(B2)％视黄醇脱分类 化合物 氢酶的增加磷脂 磷脂酰胆碱 21％增加磷脂鞘磷脂 26％增加视黄醛还原酶抑制剂(B3)总 ％视黄醛还原分类化合物 TG(IC 50) 酶的抑制醛 香草醛 9.70E-03 6％脂肪酸 花生酸 20％脂肪酸 花生酸 49％脂肪酸 亚油酸 1.63E-04 62％+/-2脂肪酸 亚麻酸 1.34E-04 54％+/-16脂肪酸 肉豆蔻酸1.72E-05 26％杂项 胺苯丫啶6.26E-06 22％+/-8杂项 氢琥珀酸甘草次酸3.61E-07 26％+/-2杂项 Glycyrretinic 8.64E-06 38％＝/-1Acid磷脂 磷脂酰乙醇胺 37％CRABPII拮抗剂(B4)总 CRABPII抑制％分类 化合物 TG(IC 50)脂肪酸反油酸 6.50E-05 ＞50％脂肪酸 十六烷二酸 1.30E-04 ＞50％脂肪酸 12-羟基硬脂酸 2.91E-05 ＞50％脂肪酸 异硬脂酸 6.88E-05 ＞50％脂肪酸亚麻油＞50％
视黄酸氧化抑制剂(B5)分类 化合物 总体 ％视黄酸抑制 ％视黄酸抑制TG(IC 50) (10μM) (100μM)咪唑 联苯苄唑 89％100％咪唑 氯咪巴唑4.47E-06 80％92％咪唑克霉唑 76％85％咪唑益康唑 88％100％咪唑酮康唑 1.85E-07 84％84％咪唑咪康唑 2.78E-07 74％86％脂肪酸酰胺&月桂基羟乙基咪唑啉 4.67E-07其他表面活性剂脂肪酸酰胺& 油基羟乙基咪唑啉3.02E-05 54％80％其他表面活性剂类黄酮 柑桔黄素6.29E-05 40％74％香豆素 香豆素喹啉(7H-苯并咪唑[2，1-a]苯并[二]-异喹啉-7-酮8.59E-07喹啉羟基喹啉3.64E-04喹啉 甲吡酮(2-甲基-1，2-二-3-吡啶基-1-丙烷) 47％
增效剂或其组合以10mM的浓度在下述转谷酰胺酶试验中抑制转谷酰胺酶到至少50％。转谷酰胺酶试验
转谷酰胺酶试验和角质化细胞分化在表皮的最终分化过程中，15nm厚的蛋白质层，称之为角质外壳(CE)形成于细胞外周的内表面。CE由许多不同的蛋白质组成，这些蛋白质已经通过形成Nε-(Y-谷氨酰基)赖氨酸异二肽键交联在一起，由至少两种在表皮中表达的不同转谷酰胺酶催化。转谷酰胺酶I在表皮的分化层中表达丰富，特别是颗粒层，而在未分化基础表皮中较少。因此转谷酰胺酶I是一种有用的表皮角质化细胞分化标记物，高转谷酰胺酶I水平表明更加分化的状态。在下面的例子中，采用转谷酰胺酶I抗体的ELISA转谷酰胺酶I试验用于评价培养的角质化细胞的分化状态。
角质化细胞(如上所述培养)以4,000-5,000细胞/孔的密度接种在96孔培养板的200μl培养基中。孵育2-3天后，或者到细胞长满约50％后，将培养基换作含有测试化合物的培养基(每个样品重复五次)。细胞接着培养96小时，此后吸出培养基并且将培养板储存在-70℃。培养板从冷柜中取出，细胞用200μl 1xPBS洗涤两次。细胞在室温用TBS/5％BSA(洗涤缓冲液，牛血清白蛋白)孵育1小时。接着加入转谷酰胺酶一抗50μl单克隆抗转谷酰胺酶I Ab B.C.在洗涤缓冲液中稀释到1∶2000。一抗在37℃孵育2小时并随后用洗涤缓冲液清洗6次。细胞随后在37℃用50μl二抗(Fab片段，结合过氧化物酶的抗鼠IgG，来自Amersham)在洗涤缓冲液中稀释到1∶4,000孵育2小时，然后用洗涤缓冲液清洗3次。用洗涤缓冲液清洗之后，细胞用PBS洗涤3次。为了进行比色分析，细胞用100μl底物溶液(4mg邻亚苯基二胺和3.3μl 30％H2O2在10ml 0.1M柠檬酸盐缓冲液中，pH5.0)在室温下于暗处严格孵育5分钟(铝箔下)。通过加入50μl 4N H2SO4使反应终止。在UV分光光度计中读出96孔培养板中样品在492nm处的吸光度。在五组平行测定中，四组采用两种抗体进行处理，第五组用作转谷酰胺酶背景对照。测定转谷酰胺酶水平并且表示为％对照。
测定转谷酰胺酶水平并在上述表B1-B5中分别表示为(i)％(增效剂+视黄醇抑制/对照抑制)-％(ROH抑制/对照抑制)，测量增效剂+视黄醇诱导转谷酰胺酶抑制与单独视黄醇相比的增加效应，或(ii)当检测多个增效剂浓度的抑制效果时的IC50值-假定增效剂的浓度与恒定视黄醇浓度10-7M组合来抑制转谷酰胺酶超过50％。
在本发明中IC50值用作基准。
在转谷酰胺酶试验中测试的最佳增效剂组B1化合物
B2化合物
B3化合物
B4化合物
B5化合物
植物雌激素作为本发明的一部分，已经惊讶地发现植物雌激素与类维生素A协同改进皮肤的效果。本质上，植物雌激素提高皮肤对类维生素A的敏感性。
因此，本发明在第二组合物中含有约0.001％-约10％的至少一种植物雌激素。
植物雌激素包括类黄酮，如雌激素类黄酮、染料木黄酮、大豆黄素、黄豆黄素、鹰嘴豆素甲、7-羟基-4’-甲氧异黄酮和牛尿酚以及它们的混合物，染料木黄酮和大豆黄素的乙酰基和丙二酰基酯，以及染料木黄酮和大豆黄素的糖苷。应该注意前述名单并非排它的，还可以包括本领域技术人员熟知的其他植物雌激素。
双室包装包括类维生素A的组合物通常是不稳定的并且可以经历化学降解。此外，已经惊奇地发现增效剂，尽管有利于增加类维生素A的效果，但还对类维生素A的化学不稳定性有作用。当两种组分包含在单一配方中时，增效剂诱导的视黄醇不稳定化大大地降低了增效的类维生素A组合物的整体效果。因此，为了保护类维生素A不被破坏，同时仍然提供类维生素A增效剂的有益效果，本发明提供了一种双室包装，在第一室中含有包含类维生素A的第一组合物和在第二室中含有包含至少一种类维生素A增效剂的第二组合物。第一组合物为皮肤提供第一益处而第二组合物用来增进或提高第一益处的效果。
作为进一步的类维生素A增益剂，植物雌激素是本发明的一种基本组分。植物雌激素如染料木黄酮和大豆黄素与类维生素A协同作用以传递皮肤益处。但是，植物雌激素对氧化作用有贡献，由此引起类维生素A的降解。因此，本发明的植物雌激素作为双室包装的第二室中第二组合物的一部分，以进一步增进第一益处的效果。
双室包装可以设计成本领域技术人员熟知的各种方式，只要能够实现在两个分离的容器中提供第一和第二组合物的目的。在一个实施方案中，双室包装是两个相互连接的罐或瓶的形式。在第二个实施方案中，双室包装是单个瓶/罐的形式，由一个分隔装置将瓶/罐的内部分为第一和第二室。其他实施方案也包括在本发明的范围内，只要组合物保持分离。
美容可接受的载体本发明的产品还包含一种美容可接受的载体以用作第一和第二组合物之一或两者中的活性组分的稀释剂、分散剂、或载体，从而当组合物施用于皮肤上时有利于它们的分布。
非水或除水之外的载体可以包括液体或固体润肤剂、溶剂、保湿剂、增稠剂和粉末。一种特别优选的非水性载体是聚二甲基硅氧烷和/或聚二甲基苯基硅氧烷。本发明的硅氧烷可以是25℃时的粘度范围是约10-10,000,000厘沲的任意硅氧烷。特别优选的是低和高粘度硅氧烷的混合物。这些硅氧烷可以购于通用公司，商品名为Vicasil、SE和SF，以及购于Dow Corning公司，商品名为200和550系列。本发明组合物中硅氧烷的用量范围可以是组合物重量的5-95％，优选25-90％。
任选的皮肤增益材料和美容助剂在本发明的第一和第二组合物之一或两者中，可以存在一种油或油性材料，同时还有一种乳化剂以提供水包油乳液或油包水乳液，很大程度上取决于所使用的乳化剂的平均亲水亲油平衡(HLB)。
各种类型的活性成分可以存在于本发明的第一和第二美容组合物之一或两者中，并且如下所描述。活性成分定义为除润肤剂和只改进组合物物理性能的其他成分之外的皮肤或头发增益剂。尽管不限于此范畴，但通常的例子包括防晒剂、皮肤增白剂、鞣剂。
防晒剂包括那些通常用来阻挡紫外线的材料。举例的化合物有PABA的衍生物、肉桂酸酯和水杨酸酯。例如，可以使用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羟基-4-甲氧基苯甲酮。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羟基-4-甲氧基苯甲酮分别可以商品名Parsol MCX和Benzophenone-3购买。
乳液中防晒剂的实际用量可以根据所需的防止日光中紫外线辐射的程度而变化。
另一种优选的任选成分选自基本脂肪酸(EFA)，即那些对于所有细胞的质膜形成都是必须的脂肪酸。在角质细胞中，EFA缺失会使细胞过度增殖。提供EFA可以矫正过度增殖。EFA还增强表皮的脂质生物合成并且为表皮的阻透层形成提供脂质。基本脂肪酸优选选自亚油酸、γ-亚麻酸、均-γ-亚麻酸、columbinic acid、二十-(n-6，9，13)-三烯酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十碳六烯酸及其混合物。
润肤剂通常结合到本发明的美容组合物中。这些润肤剂的用量范围可以是组合物总重量的约0.5％-约50％，优选约5％-30％。可以归类于这些通用化学品范畴内的润肤剂是酯、脂肪酸和醇、多元醇和烃。
酯可以是一元或二元酯。脂肪酸二酯的可接受例子包括己二酸二丁酯、己二酸二乙酯、癸二酸二乙酯、癸二酸二异丙酯和琥珀酸二辛酯。可接受的支链脂肪酸酯包括肉豆蔻酸2-乙基-己基酯、硬脂酸异丙酯和棕榈酸异硬脂基酯。可接受的三元酸酯包括三亚油酸三异丙酯和柠檬酸三月桂基酯。可接受的直链脂肪酸酯包括棕榈酸月桂基酯、乳酸肉豆蔻基酯、oleyl eurcate和油酸硬脂基酯。优选的酯包括椰油辛酸/己酸酯(椰油辛酸酯和椰油己酸酯的混合物)，丙二醇肉豆蔻基醚乙酸酯，己二酸二异丙酯和辛酸十六烷基酯。
合适的脂肪醇和酸包括那些含有10-20个碳原子的化合物。特别优选的是这些化合物，如十六烷基、肉豆蔻基、棕榈基或硬脂基醇和酸。
可以用作润肤剂的多元醇有线形或支链烷基多羟基化合物。例如优选丙二醇、山梨糖醇和甘油。还可以使用聚合多元醇如聚丙二醇和聚乙二醇。丁二醇和丙二醇还特别优选作为渗透增强剂。
可以用作润肤剂的烃是那些具有12-30个碳原子的烃链的化合物。具体例子包括矿物油、凡士林油、角鲨烯和异石蜡烃。
在本发明的美容组合物中使用的另一种功能成分是增稠剂。增稠剂的通常用量为组合物重量的0.1-20％，优选约0.5％-10％。增稠剂的例子有交联的聚丙烯酸酯，商品名为Carbopol，购自B.F.Goodrich公司。可以使用树胶如黄原胶、角叉菜胶、明胶、刺梧桐树胶、果胶和洋槐豆胶。在某些情况下可以使用硅氧烷或润肤剂来实现增稠作用。例如粘度大于10厘沲的硅氧烷胶和如具有双官能度的硬脂酸甘油酯的酯。
粉末可以加入到本发明美容产品的第一和第二美容组合物之一或两者中。这些粉末包括白垩、滑石、漂白土、高岭土、淀粉、蒙脱石、化学改性铝硅酸镁、有机改性蒙脱粘土、水合铝硅酸盐、煅烧二氧化硅、琥珀酸辛基铝淀粉及其混合物。
其他少量辅助成分还可以加入到本发明美容产品的第一和第二组合物之一或两者中。这些成分可以包括着色剂、遮光剂和香料。这些物质的用量范围可以是组合物重量的0.001％-20％。
本发明美容产品的第一和第二组合物主要作为局部施用于人皮肤上的产品，特别是作为调节和润滑皮肤、防止或减少出现皱纹或老化皮肤的制剂。
在使用时，少量的第一组合物，例如1-5ml，从合适的容器或施涂器中施用到皮肤的暴露区域，并且如果必要，随后用手或手指或合适的装置喷洒和/或涂抹到皮肤上。同时将少量的第二组合物，例如1-5ml，从合适的容器或施涂器中施用到皮肤的暴露区域，并且如果必要，也可以用手或手指或合适的装置喷洒和/或涂抹到皮肤上。因此，取决于所需的处理程度，第一和第二组合物可以单独使用、同时使用或依次连续使用。
产品形式和包装本发明的局部皮肤处理组合物可以配制成洗液、流体乳膏、乳膏或凝胶。
具体实施例方式
实施例1方法视黄醇(在tween 80中，50％)溶解在大约50％的乙醇水溶液中以提供一种当以200μl体积在96孔板中采用标准的96孔分光光度计测量时在360nm处的OD值约为0.6的溶液。
增效剂分子以大约0.1％的浓度加入，并且在暗室如上所述立即测量在360nm处的OD值，以及室温下60小时后的OD值。60小时后校准OD值(除以0.85)以计算由于溶剂从板中蒸发而增加的视黄醇浓度。
结果表1
测试的增效剂导致视黄醇不稳定性的显著增长。
这将使得与需要单独使用视黄醇相比，当使用增效剂时必须使用为视黄醇提供更佳稳定性的制剂/包装。
实施例2为了确定B1-B5活性化合物与视黄醇的组合是否协同抑制转谷酰胺酶的表达，必须要确定在视黄醇存在下单独测试时活性化合物的剂量响应曲线(包括IC50值)。该数据用于确定每种活性化合物适当的次-最大抑制浓度，使得可以鉴定在视黄醇存在下活性化合物的混合物的协同效应。为了证实两种化合物的协同作用，有必要选择最大IC20的测试浓度，换句话说就是单独促进视黄醇抑制转谷酰胺酶的表达为20％的化合物浓度。这两种化合物应该具有叠加抑制40％。采用这种方式来确定浓度使得有40-100％的进一步转谷酰胺酶抑制，以测定两种待测化合物的协同作用。更优选的浓度标准可以是选择单独表现出不促进视黄醇对转谷酰胺酶抑制的化合物的浓度。但是在此研究中我们选择甚至更优选的标准。我们选择的化合物浓度比最低的有效转谷酰胺酶抑制浓度低10倍和100倍。采用这样很低的浓度来鉴定协同结合作用将意味着鉴定最有效的协同结合作用。
下表中的数据代表比最小抑制化合物浓度低2个数量级的化合物浓度。这些是用于B1/B5结合作用研究的浓度。
表2
为了检测B1和B5活性化合物与视黄醇结合来协同抑制转谷酰胺酶表达，测试了下表给出浓度的所选择化合物组合。得到下面的数据
表3
B1/B5组合的效果分为两类特别有效的组合(上表中的粗体字)和无效的组合(不是粗体)。意外的是某些B1/B5组合表现出比其他组合更好。那些无效的组合是(i)脂肪酸酰胺+唑；(ii)羟基脂肪酸酰胺+唑和(iii)柑桔黄素/槲皮酮+唑。含有B1增效剂结合B5增效剂的有效组合选自下列类脂肪族羟乙基咪唑啉表面活性剂、环脂肪族不饱和化合物、多环三萜、n-取代的脂肪酸酰胺。
实施例3本实施例表明类维生素A和植物雌激素的协同作用(a)细胞培养方法在此使用从25-30岁女性志愿者的内臂得到的人成年成纤维细胞。细胞在含有10％FBS的1∶1 DMEM/Hams F12培养基中于37℃在5％CO2气氛常压下生长。第三代成年成纤维细胞生长在12孔培养板含10％FBS的DMEM培养基中，接种密度为2500细胞/ml/孔。细胞长满80％时用无血清和无酚红(PRF)的DMEM培养基洗涤两次。用植物雌激素化合物进行预处理4小时并随后加入类维生素A，孵育48小时。孵育后用1XPBS洗涤培养板的孔两次，将细胞单层收获在100μL细胞裂解缓冲液中(含有1XPBS，1％Triton X，0.5％脱氧胆酸钠，含有蛋白酶抑制剂的0.1％SDS(在异丙醇中的10mmg/ml PMSF，10μL/ml)。悬浮液在14000rpm离心10分钟，收集上清液并将上清液的一份用于蛋白质定量。蛋白浓度采用Pierce蛋白试剂盒测定。100μL上清液(细胞裂解产物)的残余物在40μL样品缓冲液(NOVEX)和0.5％β-巯基乙醇(BME)的混合物中通过煮沸样品5分钟使之失活。等量的蛋白质随后加入到16％Tris-甘氨酸凝胶中通过SDS电泳和Western免疫印迹进行蛋白质分析以分析CRABP-2蛋白质表达。
(b)检测细胞视黄酸结合蛋白2(CRABP-2)在细胞内部，视黄醇和视黄酸结合特定的细胞结合蛋白，两种主要的蛋白质是CRABP-1和2(Roos等，Pharmacological reviews50，315-333，1998)。这些蛋白质的作用是通过储存或转运类维生素A代谢中的蛋白质来调节细胞内类维生素A的浓度。类维生素A的高或低水平导致细胞损伤，包括细胞死亡，因此调节类维生素A及其结合蛋白的恒定水平对于细胞生存极为重要。该蛋白质的水平通过细胞内视黄酸的含量来调节。类维生素A的较高细胞水平会增加CRABP-2的表达。因此，该蛋白质在细胞中的含量是细胞的类维生素A活性标准。皮肤细胞在表皮和真皮中都含有高水平的CRABP-2。CRABP-2对成纤维细胞中类维生素A水平的体外反应用作类维生素A生物活性的可复制标准，可以预测人皮肤的反应(Elder等，J.Invest.Dermatol.106∶517-521，1996)。CRABP-2的增加也与增加的表皮分化和真皮类维生素A作用有关。因此，在这些研究中我们采用成纤维细胞的CRABP2表达作为类维生素A活性的标准，类维生素A导致表皮分化增加(皮肤调节和干皮肤)和真皮胶原以及胞外基质合成(抗老化、抗皱纹效果)。
为了测量成纤维细胞中CRABP-2的水平，等量的细胞上清液蛋白质如制造说明书所述加入到点印迹仪器的硝基纤维素膜上，并且使用抗CRABP-2的单克隆抗体按照标准程序进行免疫染色。在点印迹中使用化学荧光系统观察到CRABP-2蛋白质带，该系统来自Santa CruzBiotechnology(SantaCruz，CA)。膜中的条带采用扫描定量，从三个平行样品得到的数据计算作％对照并在下表中表示为％增加/对照(以对照为100％)+/-三个平行样品的标准偏差。
实施例4本实施例表示在植物雌激素类黄酮存在时视黄醇的稳定性。
视黄醇溶解在水性乙醇中作为10％溶液(1∶1水∶乙醇)。该溶液稀释到0.001％(大约30μM)。该溶液在96孔分光光度计中于360nm得到的吸光度OD约为0.35。
染料木黄酮、大豆黄素的水性乙醇储存液制备成0.1％、0.01％或0.001％。向96孔培养板中200μL的0.001％视黄醇溶液中加入20μL类黄酮(即稀释1-10倍)，使类黄酮的终浓度为0.01、0.001和0.0001％。混合培养板并且设定在360nm处读取初始OD值。培养板在室温下于暗室孵育2天，并且随后在8、24和48小时读取OD值。在这些时间点的OD值归一化为0时间点读数。视黄醇稳定性表示为在0时间点的％视黄醇(OD值)。数据见实施例5。
实施例5在下列2个表中，测试了染料木黄酮、大豆黄素和类维生素A之间的协同作用。在这两项研究中，染料木黄酮以在DMSO乙醇中的可溶形式释放到细胞中。1μM染料木黄酮单独明显刺激CRABP-2。染料木黄酮和大豆黄素以协同方式刺激类维生素A活性。测试了所有类维生素A，除视黄基乙酸酯外都表现出与染料木黄酮和大豆黄素的协同作用。这些数据支持我们的观点，即植物雌激素类黄酮染料木黄酮和大豆黄素，当以可溶形式供应给细胞时，协同增强了类维生素A的活性。
表4染料木黄酮和类维生素A之间的协同作用
表5大豆黄素和类维生素A之间的协同作用
实施例6实施例5下列表格表示染料木黄酮和大豆黄素对于使视黄醇去稳定化的效果。试验按照方法部分所述进行。将平行测定的OD值平均化并如下给出。
表6染料木黄酮存在时的视黄醇稳定性
表7大豆黄素存在时的视黄醇稳定性
在没有任何其他试剂的情况下视黄醇单独缓慢降解(8小时8％，24小时14％和48小时19％)。但是，在存在染料木黄酮和大豆黄素时加速了视黄醇的降解。存在这些类黄酮时早在8小时视黄醇就降解了16-18％。这表明染料木黄酮和大豆黄素导致视黄醇不稳定性的明显增加。这将使得必须在含有类维生素A和类黄酮的产品中采用特殊的包装，一个室用于视黄醇而另一个室用于类黄酮。
尽管在此已经具体地描述了本发明，并且参考了某些优选的实施方案，但本领域的技术人员将会理解可以作出各种变化、改进和替换方案，并且在本发明的精神和范围之内。应该理解所有这些实施方案和变化都在本发明的范围内并且概括在如下的权利要求书中，本发明仅仅由下述权利要求来限制，这些权利要求应该解释为合理的尺度。在本申请全文中引述了各种出版物。这些出版物以其全部内容包括于此作为参考。
权利要求
1.一种稳定的皮肤护理产品，含有第一组合物，包含约0.001％-约10％类维生素A；第二组合物，包含约0.0001％-约50％至少一种类维生素A增效剂和约0.001％-约10％至少一种植物雌激素；用于储存第一组合物的第一室；和用于储存第二组合物的第二室，第一室和第二室彼此连接在一起。
2.权利要求1的稳定的皮肤护理产品，其中第二组合物含有至少两种类维生素A增效剂，含量为约0.0001％-约50％。
3.权利要求1或2的稳定的皮肤护理产品，其中类维生素A提供第一种益处，增效剂和植物雌激素促进该第一种益处。
4.一种护理皮肤的方法，该方法包括将权利要求1-3中任意之一的产品局部施用到皮肤上。
5.一种模拟视黄酸对皮肤的效果的方法，该方法包括将权利要求1-3中任意之一的产品施用到皮肤上。
6.权利要求1-3中任意之一的稳定的皮肤护理产品在制备用于改进皮肤脱屑的药物的用途。
7.权利要求1-3中任意之一的稳定的皮肤护理产品在制备用于改进表皮分化的药物的用途。
8.权利要求1-3中任意之一的稳定的皮肤护理产品在制备用于治疗皮肤干燥、痤疮、光损伤皮肤、皱纹外观、老年斑和/或老化皮肤；增加角质层组织弹性；增加皮肤颜色光泽；和/或控制皮脂分泌的药物的用途。
9.权利要求1-3中任意之一的稳定的皮肤护理产品，用于治疗皮肤干燥、痤疮、光损伤皮肤、皱纹外观、老年斑和/或老化皮肤；增加角质层组织弹性；增加皮肤颜色光泽；控制皮脂分泌；改进皮肤脱屑；和/或改进表皮分化。
全文摘要
一种稳定的皮肤护理产品，含有第一组合物，包含约0.001％－约10％类维生素A；第二组合物，包含约0.0001％－约50％至少一种类维生素A增效剂和约0.001％－约10％至少一种植物雌激素；用于储存第一组合物的第一室；和用于储存第二组合物的第二室，第一室和第二室彼此连接在一起。
文档编号A61Q19/02GK1482899SQ01821441
公开日2004年3月17日 申请日期2001年12月6日 优先权日2000年12月28日
发明者S·皮莱, S·P·格兰格尔, I·R·斯科特, D·J·波卡利科, S 皮莱, 斯科特, 格兰格尔, 波卡利科 申请人:荷兰联合利华有限公司