专利名称：植物来源的重组生长因子在皮肤护理中的应用的制作方法
技术领域：
总的来说，本发明涉及包含用于皮肤护理的生长因子的美容和药物组合物以及制造美容产品的方法。尤其是，本发明涉及从转基因植物获得的重组非植物生长因子、优选为人类或哺乳动物生长因子，以及它们在美容和药物产品中的应用。
背景技术：
皮肤是人体的最大器官，执行各种不同的功能，例如保护、阻隔、温度控制、排泄和呼吸。它执行各种不同的功能，例如保护、阻隔、温度控制、排泄和呼吸。随着时间和衰老， 这些功能快速下降，并且皮肤发生各种生理变化。这些变化表现为皮肤的主要组分表皮、真皮和皮下组织的厚度减小。脂类组成的变化削弱了脂类层的水分阻隔功能，并导致皮肤干燥。此外，随着衰老，老年斑、雀斑、色素沉着和各种皮肤病损的发生也增加。环境成分例如污染和UV射线能够加速皮肤的衰老。反应性氧物质和自由基以及某些生理状态例如疲劳或紧张，对蛋白质、核酸和膜脂特别有害，导致皮肤的衰老。因此，对于皱纹、老年斑或雀斑、 皮肤弹性丧失、色素沉着和皮肤干燥的出现，已进行了许多研究。已经开发了多种美容组合物以便阻止或减缓皮肤衰老和皮肤皱纹的问题，其目的在于改善皱纹、松弛和由日光引起的皮肤弹性降低。日本专利公开号Hei 5-M6838公开了通过合成胶原蛋白改善皮肤皱纹的方法。它教导了降解胶原蛋白以促进胶原蛋白代谢的胶原酶的活性可能随着衰老而降低，导致交联型胶原蛋白的增加和皮肤皱纹的增加。生长因子是调控细胞增殖与分化的关键参与者，并参与受伤或损伤后表皮和基底层的重构。它们对于细胞的更新也是重要的，因此能够抵抗衰老的几个方面。生长因子是维持组织完整性和细胞与细胞通讯的关键参与者，因此在对抗表皮组织的退化中发挥保护性作用。成纤维细胞生长因子对上皮细胞具有增殖效应，并已被发现在动物模型中加速骨和伤口愈合。成纤维细胞生长因子4在胚胎四肢发育过程中发挥中心作用；在体外，FGF-4对于成纤维细胞和内皮细胞是促有丝分裂的，并且已显示它在体内是强有力的血管发生促进剂。成纤维细胞生长因子5在胎儿期发育和出生后生长以及各种组织的再生过程中发挥主要作用，促进细胞增殖和分化；尤其是在毛发生长周期的调控中发挥作用。成纤维细胞生长因子6通过促进细胞增殖和分化在各种组织的生长和再生中发挥中心作用；作为成纤维细胞的强有力的有丝分裂原，它对骨骼肌再生是重要的，并可能具有血管发生活性。成纤维细胞生长因子8通过促进细胞增殖和分化在各种组织的生长和再生中发挥中心作用，并介导上皮-间充质转变。成纤维细胞生长因子9在胚胎发育和出生后生长以及各种组织的再生过程中发挥主要作用，促进细胞增殖和分化。结合肝素的EGF样生长因子通过EGF受体传导信号，并刺激平滑肌细胞、成纤维细胞、上皮细胞和角质细胞的增殖；其在单核细胞和巨噬细胞中产生。它可能在伤口愈合中发挥重要作用。白介素4是抗炎性和免疫抑制性细胞因子，并对细胞外基质降解表现出保护效应。IL-4和IL-10的组合用于治疗患有关节炎的小鼠，显示出明显保护了软骨破坏。白介素-15显示出作为NK细胞的特异性成熟因子的功能；其刺激已建立的T-细胞系CTLL-2的增殖，并且⑶8 (+)记忆性T-细胞的增殖需要IL15。头蛋白被设想在出生后皮肤中新发生长高潮的引发以及正常皮肤中凋亡驱动的毛囊退化中发挥重要作用；外源引入头蛋白能够在lama5(-/-)皮肤中恢复毛囊发育。胎盘生长因子是强有力的血管发生因子，其刺激血管发生而不显著增加血管渗漏和炎症；它在皮肤伤口愈合过程中表达，并通过增强血管发生改进伤口愈合。SCF在人类和动物中的表达与毛乳头细胞诱导毛囊再生的能力相关。毛发色素沉着受到几种因素的调控，所述因素包括SCF与其III类受体酪氨酸激酶c-kit的相互作用。Flt3配体是FLT3酪氨酸激酶受体的配体，并属于一小类调控早期造血细胞增殖的生长因子。已经鉴定到Flt3配体的多种同种型。Flt3配体与表达酪氨酸激酶受体Flt3 的细胞结合。单独的Flt3配体不能刺激增殖，但是与其他CSF和白介素很好地协同诱导生长和分化，因此适合于添加到含有一种或多种生长因子的组合物中。生长因子能够促进细胞更新和增殖，是伤口愈合过程的天然组分。在此以其全文引为参考的美国专利No. 5，618，544公开了包含EGF、TGF_ α和FGF 的美容组合物，用于减少皮肤衰老并改善皮肤外观。美国专利No. 6，589，540教导了 EGF显著增加在美容品中使用的视黄醇的效应，并且也有效减轻视黄醇的皮肤刺激。已经认识到，生长因子可能对多种皮肤障碍和皮肤损伤具有有益效果，并抵消作为保护机制在细胞水平上的受损或降低的结果而引起的衰老效应。生长因子在凝血阶段中释放到创伤位点，并作为中性粒细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的化学吸引剂。这些细胞在杀死细菌和移除创伤位点的坏死残片中发挥重要作用。活化的巨噬细胞反过来释放生长因子，所述生长因子促进血管发生并与B-细胞和T-细胞介导的免疫应答相关。巨噬细胞分泌的生长因子刺激成纤维细胞产生新的细胞外基质，并刺激血管发生。上皮随着角质细胞分裂不断形成，并覆盖伤口床(mnmd bed)。表皮生长因子刺激成纤维细胞和角质细胞的增殖。因此，已经确立生长因子是愈合过程的重要介导物，并且研究显示，某些生长因子可能对感染的糖尿病性溃疡的治疗是有益的。从动物组织或血液分离到的生长因子带有不想要的污染物和可传播因子、所述可传播因子例如但不限于病毒、病毒粒子、朊病毒、其他共纯化的生长因子的风险。在通过生物技术手段在动物或人类细胞中生产的生长因子中，也存在同样的污染可传播因子和内源生长因子的风险。使用生物技术手段在细菌中生产的生长因子，引起携带已知是热原并干扰免疫系统的细菌内毒素的风险。此外，细菌不能使蛋白糖基化，这在若干情况下已知使其不稳定并更易于被蛋白酶降解。可传播因子、内毒素或污染物的风险，显然是使用在细菌、 酵母或动物细胞中生产的生长因子治疗开放性创伤时所顾虑的。对于以例如最小化或消除上述问题和缺点的方式制备的高质量的生长因子和其他生物活性蛋白，存在着持续不断的需求。
发明内容
在植物中生产的重组生长因子和细胞因子不含例如动物或人类病毒、病毒粒子和朊病毒以及细菌内毒素的可传播的传染性因子。与大量动物疾病能够感染人类相反，还没有报道植物疾病能够在人类中引起疾病的案例。因此，与上面提到的用于生产生长因子的细胞类型相比，植物构成了安全得多的生产生物体。植物缺少与动物相当的需要作为信号传导元件的生长因子的作用和参与的免疫系统。植物自身不产生与动物或人类生长因子类似的生长因子。植物也能对蛋白糖基化，其改进了那些蛋白的稳定性，并能影响它们的活性，因此植物系统能够生产与在细菌中生产的相比更优良的生长因子。按照本发明使用生物技术手段在植物中生产生长因子，克服了这些安全性和纯度问题。因此，植物来源的生长因子，不论在提取物中还是在纯化形式下，对于在美容品或局部治疗学中的应用来说，都比使用现有生产方法生产的生长因子更加安全和清洁。植物生产大量蛋白，其在植物中发挥保护性作用，并缓解由非生物和生物因素引起例如脱水和氧化胁迫的胁迫。这些蛋白中几种在包括包括细胞组织脱水的种子成熟后特异性积累在植物种子中。脱水素是一类对胁迫例如干旱做出响应或作为成熟过程例如种子发育的一部分而积累的蛋白质。因此，通过在转基因植物中表达并从所述植物制备含有所述生长因子的植物提取物以向美容品提供生长因子，提取物不仅通过无生物风险的过程提供有益的生长因子，而且也在基质中提供了生长因子，它们能够作为额外效应提供源自于同样的转基因植物的同样植物提取物中来自植物的其他有益组分。本发明的目的是提供可以具有美容或治疗任一或两种用途的用于皮肤护理的组合物，其包含含有重组生长因子的转基因植物提取物、或从转基因植物纯化的重组生长因子、或作为提取物或纯化形式的来自转基因植物的生长因子的混合物，用于局部治疗学和美容品中。重要的是，本发明制造了可用于美容和局部治疗的更安全的生长因子。这些植物来源的生长因子，当它们在其氨基酸骨架中带有糖基化位点时可以在植物中糖基化，这种特点已知能够改进蛋白的稳定性，并可能影响它们的生物活性。正如上面提到的，其他表达系统例如原核生物表达系统的缺点，在于那些系统缺少用于被表达的异源蛋白的糖基化的机制。植物不仅能够对异源蛋白糖基化，而且糖基化的基质与在动物例如人类中发现的不同。尽管这在某些临床应用中可能是不利的，但它对于许多其他应用来说并无临床关联性，并事实上可能促成本发明的来自植物来源的异源蛋白的相当令人吃惊的稳定性。在美容品中敏感性生物材料、特别是生长因子的实践应用的关键问题，是这些材料是不稳定的。消费者一般希望美容品具有合理长的储存期限，并希望将这些产品储存在室温下，即如果美容产品需要冷冻储存，在商业上是明显不利的。美容品生产者已经开始用储存期限标记物标记他们的产品，但是通常只提供很少或不提供关于优选储存条件的信息。正如在随附的实施例中所示，本发明提供的生长因子和生长因子提取物显示出即使是在相对极端的条件下的惊人的良好稳定性。为美容性和/或治疗性局部应用的组合物生产活性成分例如生长因子，通过本发明变得更加经济。植物表达系统允许大规模生产目标重组蛋白，并且简单粗放的纯化流程可用于从纤维质植物材料提取蛋白，以提供有用的植物提取物。在许多情况下，蛋白不是必须彻底纯化的，因为在这样的植物提取物中许多增量(bulk)组分对皮肤不是有害的，甚至如上所述可能是有益的。在某些有用的实施方案中，在本发明的组合物中使用的植物提取物包含以提取物的总蛋白含量的计约0.01%到70%范围内的所需生长因子，例如在总蛋白的约0. 1到约30%范围内，包括总蛋白的子范围0. 1-1%和0. 1-5%、1-10%、 1-30%,以及适合的中间值，例如但不限于提取物中总蛋白的约0. 或约1%。在其他实施方案中，提取物可以更显著地纯化，并含有高达约90%或以上的生长因子蛋白，例如为提取物中总蛋白含量的约95%或以上，或99%或以上。因此，在某些实施方案中，本发明的提取物一般可以包含以总蛋白的％计，约0.01%到约99. 9%范围内的所述生长因子、优选约 0. 1到约99. 9%范围内、包括子范围例如从约0. 01到约70%和约0. 1到约40%，以及约40 到约70%范围的生长因子。更具体来说，本发明的目的是提供美容和/或治疗用皮肤护理组合物，所述组合物包含重组生长因子、更优选任何本文中列出的生长因子，以及任选在组合物中包含其他天然存在的基于植物的有益多肽，所述有益多肽例如为提取物中的脱水素和球蛋白。这些种子蛋白在植物的细胞和生物化学水平上具有保护性功能，并且在与生长因子的独特组合中，作为本发明的目的，它们提供了营养和愈合条件，并在细胞水平上减轻脱水和氧化胁迫。此外，本发明的目的是提供皮肤护理组合物，其适用于痤疮的美容或临床治疗、皮肤皱纹、老年斑、雀斑、红斑或其他色素沉着的改善，以及皮肤的润湿和伤口愈合。另一方面，本发明提供了制造局部美容和/或治疗性产品的方法，包括提供包含重组的异源生长因子的转基因植物提取物。植物产生的非植物来源的重组生长因子可以选自表皮生长因子(EGF)、血管上皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)^l 细胞生成素(Epo)、成纤维细胞生长因子4、5、6、8和9(FGF4、FGF5、FGF6、FGF8和FGF9)、 成纤维细胞生长因子a和b、Flt3配体、肝素结合性EGF(Hb-EGF)、胰岛素样生长因子-I (IGF-I)、胰岛素样生长因子-II (IGF-II)、白介素_1 (IL-1，包括IL-I α和IL-I β )、 白介素-2 (IL-2)、白介素-4 (IL-4)、白介素_7 (IL-7)、白介素_6 (IL-6)、白介素_8 (IL-8)、 白介素-10 (IL-10)、白介素-15 (IL-15)、白介素-18 (IL-18)、白介素-20 (IL-20)、白血病抑制因子(LIF)、头蛋白、胎盘生长因子-l(PIGF-l)、干细胞因子(SCF)、包括TGF-β 3 的转化生长因子α和β (TGF- α和TGF-β )、肿瘤坏死因子-α (TNF-α )、肿瘤坏死因子-β (TNF-β)、干扰素-γ (INF-γ)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、角质细胞生长因子(KGF)、骨形态发生蛋白(ΒΜΡ-4)和胸腺素β 4。在某些优选实施方案中，转基因植物提取物是大麦种子提取物。所生产的生长因子特别可用于制造美容组合物。另一方面，本发明提供了从转基因植物分离的一种或多种重组的异源生长因子。 生长因子也可用于本领域的技术人员所知的其他应用中。在本发明的另一方面，提供了包含生长因子的新的植物提取物用于美容和/或治疗目的，并在例如愈合软膏或其他形式的局部药物组合物中作为活性成分。
图1显示了具有含有mSCF的转基因植物提取物和从转基因植物提取物分离的mSCF的染色的凝胶和免疫印迹(参见实施例2)。图2显示了用针对岩藻糖的第一抗体处理过的在植物和细菌中生产的重组干扰素1的Western印迹(参见实施例3)。图3显示了用针对木糖的第一抗体处理过的在植物和细菌中生产的重组干扰素-Y的Wfestern印迹(参见实施例3)。图4显示了具有在不同温度下温育并储存不同时间的植物产生的IL-I α (冷冻干燥并复溶的)的染色的凝胶(参见实施例4)。发明详述在本文中使用时，“植物来源的”生长因子或“来自植物的生长因子”是指从转基因植物或转基因植物的后代获得的重组生长因子。本发明的生长因子一般是异源的非植物来源的生长因子，并优选可以是任何人类或非人类生长因子，例如优选为哺乳动物生长因子， 其基因已优选使用重组技术导入到所述转基因植物或植物的祖先中。分离到的生长因子可以在美容组合物或治疗性局部用组合物中用作活性成分。用于在植物中导入和表达外来基因的方法在本技术领域中是熟知的。可以被遗传转化的植物，是异源DNA序列、包括编码区的DNA序列可以在其中导入、表达、稳定维持并传递给后代的后续世代的植物。遗传操作和转化方法已被用于生产使用杀虫剂抗性包括例如双丙氨磷或basta抗性、或抗生素抗性例如潮霉素作为可选择标志物的大麦植物。选择适合的栽培品种并选择适合的用于导入外来基因的方法。术语“转化”或“遗传转化”是指将核酸分子转移到宿主生物体的基因组中，产生遗传学稳定的遗传。含有被转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因”生物体。本发明的“转基因植物宿主细胞”含有稳定整合在基因组中的至少一个外来的、优选两个外来的核酸分子。植物转化方法的实例包括农杆菌介导的转化(De Blaere等，1987)和粒子轰击或“基因枪”转化技术(Klein 等(1987)；美国专利 No. 4，945，050)。WO 2006/016381描述了特别有用的适合于转化的大麦栽培品种，并详细描述了适合的转化方法。该文献在此以其全文引为参考。WO 2005/021762公开了通过制造易于大规模纯化的嵌合蛋白以在植物表达系统中生产修饰蛋白的方法。该文献也在此以其全文引为参考。适合地按照本发明生产和使用的生长因子，可以选自任何上面提到的生长因子， 更优选选自成纤维细胞生长因子4、5、6、8和9 (FGF4、FGF5、FGF6、FGF8和FGF9)、Flt3配体、 肝素结合性EGF(Hb-EGF)、白介素4和15 (IL-4、IL-15)、白细胞抑制因子(LIF)、头蛋白、胎盘生长因子-I (PIGF-I)、干细胞因子(SCF)、转化生长因子-β 3 (TGF- β 3)。在本发明的某些实施方案中，在转基因植物中生产的目标多肽在多肽的N-端或 C-端或在两个末端含有亲和标签。这样的标签可以包括重复HQ序列、聚组氨酸尾、GST (谷胱甘肽S-转移酶)、CBM(糖类结合模块)或简化异源肽的纯化，允许亲和纯化的任何其他有用的亲和标签。正如上面所提到的，植物中的糖基化机制与在动物例如哺乳动物中发现的不同， 也与另一个常用于异源重组蛋白产物的表达系统——酵母的糖基化系统不同。植物能够生产带有复杂的N-连接聚糖的蛋白。植物糖蛋白具有复杂的N-连接聚糖，其含有在哺乳动物中没有发现的α-1，3连接的核心岩藻糖和β-1，2连接的木糖残基。植物糖蛋白缺少在哺乳动物中发现的特征性的含有复杂的N-聚糖的半乳糖(NeuAc α 2,6Gal β 1，4)，因为植物不含β (1，4)_半乳糖基转移酶，也不含α (2,6)唾液酸基转移酶。此外，从未发现α 1， 6连接的核心岩藻糖。因此，在实施方案中，本发明涵盖了如上所述的含有植物提取物的美容和/或治疗性组合物，所述提取物包含重组的非植物来源的生长因子，所述生长因子被一种或多种植物特异性聚糖糖基化，所述聚糖包括含有α-1，3连接的岩藻糖和/或β-1，2连接的木糖的聚糖。MM 本发明的美容或治疗活性成分的适合剂量，对于局部美容和/或治疗性应用来说，异源生长因子蛋白的量典型地在组合物的0.01到100ppm(yg/克)的范围内。用于治疗皮肤衰老或脱发的局部美容组合物，优选在组合物中包含0. 1到5ppm的活性物质。治疗时间的长短随着病状或所需效果而变。在硬皮病治疗的情况下，施用根据病状的严重性在1天到12个月的范围内。在治疗皮肤的自然或早期衰老的情况下，施用可以在1到400天的范围内，优选至少30天。同样地，在进行防止脱发或促进毛发再生长的治疗的情况下，施用优选在1到400天的范围内。优选情况下，转基因植物提取物从含有所述名单中的任一种蛋白、它们的模拟物或至少其能够结合并活化生长因子受体的结构域的大麦谷粒中制备。下面包括的说明性实例显示了含有不同生长因子、包括Hb-EGF、mSCF、FGF5、IL4和FGF6的转基因大麦提取物。在本技术领域中已知大量用于美容和药物组合物的局部施用的介质。参见例如 《Remington 药物学》(第 20 版)(Remington' s Pharmaceutical Sciences,Gennaro, A R 主编，20th版，2000 =Williams and Wilkins PA, USA)。可以使用所有常用于局部给药美容组合物的组合物，例如霜剂、洗剂、凝胶、敷料、香波、酊剂、糊剂、软膏、油膏、粉末、液体或半液体制剂、贴片、脂质体制剂、溶液、悬液、脂质体悬液、油包水(W/0)或水包油(0/W)乳液、 润发脂和糊剂等。如果适合，所述组合物的施用可以通过气溶胶例如使用例如氮气、二氧化碳、氟利昂的推进剂或不使用推进剂例如泵喷射、滴液、洗液或半固体例如可以通过拭子施加的增稠组合物。在具体的组合物中，半固体组合物例如油膏、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶、软膏等，将便于使用。本发明的组合物可供肠胃外、系统性或局部使用，包括溶液、悬液、脂质体悬液W/ 0(油包水)或0/W(水包油)乳液。在优选实施方案中，活性物质被配制成冷冻干燥形式， 与适合的冷冻干燥添加剂混合，以备使用治疗可接受的稀释剂复溶。有用的冷冻干燥添加剂是缓冲剂、多糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、肌醇、多肽、氨基酸以及任何其他与活性物质相容的添加剂。适合用于肠胃外使用的稀释剂是水、生理溶液、糖溶液、水性醇溶液、油性稀释剂、多元醇例如甘油、乙二醇或丙二醇，或在无菌性、PH、离子强度和粘度方面与给药方法相容的任何其他稀释剂。在乳液或悬液的情况下，组合物可以包含适合的在药物配制中常用的非离子、两性离子、阴离子或阳离子型表面活性剂。水包油(0/W)亲水性乳液对于肠胃外系统性使用来说是优选的，而油包水(W/0)亲脂性乳液对于局部或局部(topic)使用来说是优选的。此外，本发明的组合物可以包含任选的添加剂，例如诸如糖和多元醇的等渗剂、缓冲剂、螯合剂、抗氧化剂、抗细菌剂。本发明的液体形式可以包含溶液或洗剂。它们可以是水性、水醇性例如乙醇/水或醇性的，并通过将冷冻干燥的物质溶解来获得。或者，活性物质溶液可以通过添加已知的胶凝剂配制成凝胶形式，所述胶凝剂例如淀粉、甘油、聚乙烯、戊二醇、聚丙二醇、聚(甲基)丙烯酸酯、异丙醇和羟基硬脂酸酯。其他类型的用于局部使用的组合物是采用润发脂、糊剂、霜剂形式的乳液或悬液。 W/0乳液是优选的，其提供较快的吸收。亲脂性赋形剂的实例是液体石蜡、无水羊毛脂、白凡士林、鲸蜡醇、硬脂醇、植物油、矿物油。有利情况下，可以使用增加皮肤渗透性从而促进吸收的药剂。这样的药剂的实例是生理可接受的添加剂，例如聚乙烯醇、聚乙二醇或二甲基亚砜(DMSO)。在局部组合物中使用的其他添加剂是等渗剂，例如糖或多元醇、缓冲剂、螯合剂、 抗氧化剂、抗细菌剂、增稠剂、分散剂。此外，制剂还可以包含常用于本文所述制剂中的常规组分，所述常规组分包括油类、脂肪、蜡、表面活性剂、保湿剂、增稠剂、抗氧化剂、粘度稳定剂、螯合剂、缓冲剂、防腐剂、
香料、着色剂、短链烷醇等。用于局部或系统性使用的延迟释放组合物可能是有用的，并包含聚合物，例如聚乙酸酯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基纤维素和本技术领域已知的其他物质。基于例如聚乙酸酯或其他生物可降解聚合物的皮下植入物形式的延迟释放组合物，也可能是有用的。尽管活性物质优选包装成冷冻干燥并因此稳定的形式，但有利情况下，药物组合物包含将植物来源的异源生长因子稳定在有活性的单、二或多聚体形式下的物质。这样的稳定剂抑制分子间二硫键的形成，从而阻止活性物质的聚合。但是，稳定剂的量应该被仔细计算，以便同时防止活性物质还原成无活性形式。这样的物质的实例是半胱氨酸、半胱胺或还原型谷胱甘肽。油类的非限制性实例包括脂肪和油类，例如橄榄油和氢化油类；蜡，例如蜂蜡和羊毛脂；烃类，例如液体石蜡、地蜡和鲨烯；脂肪酸，例如硬脂酸和油酸；醇类，例如鲸蜡醇、 1,2-己二醇、硬脂醇、羊毛脂醇、氨基甲基丙醇和十六醇；以及酯类，例如肉豆蔻酸异丙酯、 棕榈酸异丙酯和硬脂酸丁酯。作为表面活性剂的实例，可以提到的是阴离子表面活性剂， 例如硬脂酸钠、鲸蜡基硫酸钠、磷酸聚氧乙烯月桂基醚、N-酰基谷氨酸钠；阳离子表面活性剂，例如硬脂基二甲基苯甲基氯化铵和硬脂基三甲基氯化铵；两性表面活性剂，例如烷基氨基乙基甘氨酸盐酸溶液和卵磷脂；以及非离子表面活性剂，例如单硬脂酸甘油酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、蔗糖脂肪酸酯、丙二醇、戊二醇、单硬脂酸酯、聚氧乙烯油烯基醚、聚乙二醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯椰子油脂肪酸单乙醇酰胺、聚氧丙二醇(例如以注册商标“Pluronic”销售的材料)、聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯羊毛脂。保湿剂的实例包括甘油、1，3_ 丁二醇、1，2_己二醇、辛酰基二醇和丙二醇；短链醇的实例包括乙醇和异丙醇；增稠剂的实例包括黄原胶、羟丙基纤维素、丙烯酸酯/丙烯酸 C10-30烷基酯交联聚合物、羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇、戊二醇和羧甲基纤维素钠；抗氧化剂的实例包括丁基化羟基甲苯、丁基化羟基茴香醚、没食子酸丙酯、柠檬酸和乙氧基喹； 螯合剂的实例包括配位基二钠盐(disodium dentate)和乙基羟二磷酸盐(ethanehydroxy diphosphate)；缓冲剂的实例包括柠檬酸、硼酸、硼砂和磷酸氢二钠；防腐剂的实例是对羟基苯甲酸甲酯、环庚三烯酚酮、对羟基苯甲酸乙酯、二氢乙酸、水杨酸和苯甲酸。这些物质仅仅是示例性的，本领域的技术人员将会认识到可以用其他物质代替而不丧失功能性。本发明还提供了用于制造本文描述的组合物的方法，所述方法一般来说包含提供来自表达本文所述的异源生长因子、优选为上面列出的生长因子的转基因植物的植物提取物，以及将所述提取物与至少一种美容可接受的赋形剂、优选为一种或多种上面提到的赋形剂组合。方法还可以包含收获转基因植物，从植物材料分离生长因子以及从其提取含有生长因子的植物提取物的步骤。在其种子中表达异源生长因子的优选植物的情况下，分离可以适合地包括收集种子的步骤，所述种子可以方便地长时间储存而不严重影响生长因子的活性。
实施例实施例1 含有重组牛长因子和脱水素的部分纯化的转基因棺物提取物通过将收获的含有重组生长因子鼠干细胞因子(mSCF)的转基因大麦种子在研磨机中碾磨以获得细粉(面粉)，来制备转基因植物提取物。以5/1的提取缓冲液与碾磨面粉的体积/重量比，向碾磨过的大麦面粉加入提取缓冲液(50mM磷酸钾，pH 7.0)。将得到的溶液在4°C下搅拌60分钟。通过离心力，在冷冻离心机(Heraeus Primo R)中以8300rpm 或以上离心15分钟，将固形物与液体提取物分离，并将上清液倾倒到新的小瓶中。提取物的生长因子含量通过SDS-PAGE和使用特异性抗体的Western印迹法进行分析。在本实验中，mSCF的含量约为未纯化的提取物的蛋白含量的0. 1%。通过向提取物加入有效结合mSCF的IMAC层析树脂，将从实施例1得到的转基因大麦种子提取物进行进一步加工。将提取物与树脂的混合物在PH7. 0的50mM磷酸钾、0. 5M NaCl、50mM咪唑中，在+4°C下搅拌60分钟。通过以5000xg离心15分钟将IMAC树脂与液体分离开。倒出液体相，并将树脂重悬浮在清洗缓冲液(50mM磷酸钾，0.5M NaCl，50mM咪唑；PH7.0)中，旋转沉降，并将液相从树脂上倒出。清洗重复三次。将树脂重悬浮在含有咪唑的洗脱缓冲液(50mM磷酸钾，0. 5MNaCl,500mM咪唑；pH7. 0)中，将mSCF从树脂上洗脱下来，在离心后将上清液从树脂上倒出，并通过凝胶过滤层析(脱盐)进行缓冲液变换。得到的蛋白峰在SDS-PAGE和Wfestern印迹上进行分析。在这种情况下，mSCF以蛋白提取物的约40%存在。部分纯化的提取物显示在图1中标为PE的道中。实施例2 从转基因大麦种子提取物纯化的重组生长因子mSCF的纯化为了进一步分离纯化形式的生长因子将来自实施例1的IMAC洗脱液在使用凝胶过滤进行缓冲液变换后，施加到离子交换柱kpharose FF上，并通过增加洗脱缓冲液的 NaCl含量进行逐级洗脱，来分离提取物中的蛋白。通过这种方式，能够成功地将生长因子与脱水素分离开。由于mSCF的糖基化使条带模糊。正如图1所示，通过这种方式，可以将生长因子纯化到> 95%的高纯度(第6道)，产生从转基因植物提取物分离和纯化到的分离和纯化的mSCF。图1显示了转基因植物提取物以及从转基因植物提取物纯化和分离鼠干细胞因子(mSCF)。A)对提取物中和不同纯化步骤时存在的总蛋白进行染色的考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE 凝胶。B)含有mSCF的提取物的Western印迹。
道1和7是大小标准品；2，3 :IMAC洗脱液；4 脱盐的IMAC洗脱液；5 来自IEC的 50% NaCl 洗脱液；6 100% NaCl 洗脱液。PE 部分纯化的植物提取物P 纯化的蛋白；D 脱水素；mSCF 鼠干细胞因子。棚列3湘膽喊汰白_目姊化人类Y-干扰素表达在大麦中，总蛋白的提取在还原条件下、在170mM NaCl U % 2-巯基乙醇、IOmM Tris-HCl pH 8. 0和1 %聚乙烯吡咯烷酮(MW 360. 000)存在下进行。在将样品碾磨后，向提取瓶加入5ml提取缓冲液。通过在4°C下以4000rpm离心10分钟使提取物澄清，然后在Ultrafree-4浓缩器中使用5kDa分子量截留值(UFV4BCC00_MiIlipore Corp. Bedford, MA, USA)进行10倍的离心浓缩。将100 μ 1澄清并浓缩的提取物样品加入到100 μ 1 &样品缓冲液中，并将混合物在沸水浴中放置5分钟。冷却后，将10 μ 1样品上样到12%聚丙烯酰胺凝胶上，通过SDS-PAGE进行分离。比较例的结果用在植物和细菌中生产的重组IFN-γ，在通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并电转印到PVDF膜上后进行 Western印迹来说明(参见图幻。膜用抗植物特异性1_3岩藻糖的第一抗体进行处理。这显示出IFN-Y (显示了两条差异糖基化的条带)带有1-3岩藻糖，而在相邻道中的细菌生产的IFN-Y没有显示信号。Western印迹使用抗岩藻糖第一抗体制造，暴露时间为5秒。上样的样品如下第 1道丽梯，第2道植物产生的IFN- Y，第3道细菌产生的IFN- Y，第4到植物提取物 (阳性对照)。相同样品的第二次印迹使用抗木糖抗体进行。图3显示了在植物和细菌中生产的重组IFN- Y，在通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并电转印到PVDF膜上进行的Western 印迹。膜用抗植物特异性木糖的第一抗体进行处理。这显示出IFN-Y (显示了两条差异糖基化的条带)带有木糖，而在相邻道中的细菌生产的IFN-Y由于缺少糖基化而没有显示信号。图3中显示的印迹与抗木糖第一抗体具有5秒的暴露时间。上样的样品如下第 1道丽梯，第2道植物的IFN- Y，第3道细菌的IFN- Y，第4到植物提取物(阳性对照)。实施例4 在植物中表达的重组生长因子的稳定性在本实施例中，对纯化的、复溶的冷冻干燥的、植物制造的白介素Ia(IL-Ia)(含有一个N-糖基化位点)，进行了在+4°C冷藏、+37°C和室温(RT)的各种不同温度下温育高达3周的稳定性测试。图4中描述的结果显示出生长因子在37°C、RT和+4°C下在几周内的出色稳定性。根据细菌(E. coli)制造的IL-Ia的制造商的描述，复溶的、来自细菌的纯化形式的未糖基化的IL-la，在2°C -4°C下只能稳定1周(参见http //www, cellsciences. com/ PDFZCRI132.pdf)。本实施例显示，植物制造的生长因子、在本例中是IL_la，明显比在细菌系统中表达的同样的生长因子更稳定。实施例5 植物来源的生长因子在组合物中的使用下面的实施例描述了本发明的美容组合物的配制，但是不打算以任何方式限制本发明。配方1 柔肤剂(润肤水)0090]成分含量(以I■量计的％0091]0092]Hb-EGF (来自转基因植物)0. 00010093]1，3_ 丁二醇6. 00094]甘油4. 00095]油醇0. 10096]聚山梨酸酯200. 50097]乙醇15. 00098]二苯酮-90. 050099]香料0. 20100]对羟基苯甲酸甲酯0. 20101]咪唑烷基脲0. 20102]纯水适量0103]配方2:营养乳液(乳状洗剂)0104]成分含量(以I■量计的％0105]0106]mSCF (来自转基因植物)0. 00020107]丙二醇6. 00108]甘油4. 00109]三乙醇胺1. 20110]乙酸生育酚酯3. 00111]液体石蜡5. 00112]鲨烯3. 00113]澳洲胡桃油(makadamia nut oil)2. 00114]聚山梨酸酯601. 50115]失水山梨糖醇倍半油酸酯1. 00116]羧乙烯基聚合物1. 00117]香料0. 20118]对羟基苯甲酸甲酯0. 20119]咪唑烷基脲0. 20120]纯水适量0121]配方3:营养霜0122]成分含量(以I■量计的％0123]0124]FGF5(来自转基因植物)0. 00050125]凡士林7. 00126]液体石蜡10. 00127]蜡2. 00128]聚山梨酸酯602. 00129]失水山梨糖醇倍半油酸酯2. 50130]鲨烯3. 00131]丙二醇6. 00132]甘油4. 00133]三乙醇胺0. 50134]羧乙烯基聚合物0. 50135]乙酸生育酚酯0. 10136]香料0. 20137]对羟基苯甲酸甲酯0. 20138]咪唑烷基脲0. 20139]纯水适量0140]配方4 按摩霜0141]成分含量(以I■量计的％0142]0143]IL4(来自转基因植物)0. 00020144]丙二醇6. 00145]甘油4. 00146]三乙醇胺0. 50147]蜡2. 00148]乙酸生育酚酯0. 10149]聚山梨酸酯603. 00150]失水山梨糖醇倍半油酸酯2. 50151]鲸蜡硬脂醇2. 00152]液体石蜡30. 00153]羧乙烯基聚合物0. 50154]香料0. 20155]对羟基苯甲酸甲酯0. 20156]咪唑烷基脲0. 20157]纯水适量0158]配方5:面膜0159]成分含量(以I■量计的％0160]0161]FGF6(来自转基因植物)0. 00050162]丙二醇2. 00163]甘油4. 00164]羧乙烯基聚合物0. 30165]乙醇7. 00166]PEG-40氢化蓖麻油0. 80167]三乙醇胺0. 3
香料0.2对羟基苯甲酸甲酯0.2咪唑烷基脲0.2纯水适量配方1-5同样可以使用选自详细描述中列出的任何可选生长因子进行配制。配方6 用于肠胃外使用的溶液将含有25 μ g活性物质和33mg磷酸盐缓冲剂(IOmg NaH2P04/H20和23mg Na2HP04/2H20)的58mg冷冻干燥物以及约125ml用于肠胃外使用的生理溶液，分别包装在预置的细颈瓶中，用于在临使用前将冷冻干燥产品与稀释剂进行混合。活性物质溶解后的浓度约为0.2yg/ml。活性物质可以适合地选自在说明书中列出的任何生长因子，所述生长因子如本文中所述在植物中转基因表达并从其分离。配方7 用于局部施用的W/0乳液将一定量的含有20 μ g活性物质的冷冻干燥物加入到5ml含有10% DMSO的10% 乙醇的水醇性溶液中。使用适用于W/0乳液的具有< 10HLB的系数的表面活性剂，将溶液在用于皮肤施用的无菌植物油中乳化。乳液含有等于约2 μ g/g组合物的活性物质。活性物质是植物来源的重组生长因子，所述生长因子选自说明书中列出并从宿主植物中分离的生长因子。配方8:0/W乳液将一定量的含有约20 μ g活性物质的冷冻干燥物溶解在5ml含有30 % DMSO的水醇性溶液中，并用适合的表面活性剂在基于植物油的亲脂性溶剂中乳化。得到的0/W乳液含有约为3 μ g/g组合物浓度的活性物质。活性物质是植物来源的重组生长因子，所述生长因子选自说明书中列出并从宿主植物中分离的生长因子。配方9 凝胶形式的局部用组合物将一定量的含有IOyg活性物质的冷冻干燥物加入到20ml的10%乙醇的水醇性溶液中。然后，向溶液中加入戊二醇、氨基甲基丙醇和丙烯酸酯、辛酰基二醇和环庚三烯酚酮的混合物。活性物质以等于0.2 μ g/g组合物的量存在。凝胶适用于美容应用。活性物质是植物来源的重组生长因子，所述生长因子选自说明书中列出并从宿主植物中分离的生长因子。
配方10 含有卡波姆(Carbomer) (1% )的局部用凝胶制剂成分含量(以重量计的％)
Hb-EGF (来自转基因植物)
卡波姆934P
对羟基苯甲酸甲酯
丙二醇
氢氧化钠
注射用蒸馏水
总计
5μ g Ig 0. 2g 20g 适量适量 IOOg
制剂使用给定量的上面提到的组分按照常规方法制备。具体来说，将对羟基苯甲酸甲酯溶解在适量注射用蒸馏水中，向溶液加入卡波姆934P，并经搅拌分散在其中。使用氢氧化钠控制溶液的PH，将溶液与丙二醇混合，并通过加热除菌。然后向其加入Hb-EGF在注射用蒸馏水中的过滤和除菌溶液，以获得IOOg制剂。配方10 含有泊洛沙姆(20% )的局部用制剂成分含量(以重量计的％)_Hb-EGF5μ g
泊洛沙姆40720g
对羟基苯甲酸甲酯0. 2g
磷酸氢钠272. 18mg
氯化钠666.22mg
磷酸适量
丙二醇20g
注射用蒸馏水适量
总计IOOg
制剂使用给定量的上面提到的组分按照常规方法制备。具体来说，通过使用给定量的磷酸氢钠、氯化钠和磷酸制备磷酸缓冲液。将作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯溶解在磷酸缓冲液中。向溶液加入泊洛沙姆407 (BASF，德国)，并经搅拌分散在其中。然后将溶液与丙二醇混合，经搅拌分散在其中。然后使用氢氧化钠控制溶液的PH，将溶液与丙二醇混合，并通过加热除菌。然后向其加入Hb-EGF在注射用蒸馏水中的过滤和除菌溶液，以获得IOOg制剂。
配方11 含有卡波姆(0.)的霜剂制剂
成分含量(以重量计的％)
Hb-EGF0. 05mg
甘油4. 5g
对羟基苯甲酸甲酯0. 15g
对羟基苯甲酸丙酯0. 05g
卡波姆9400. Ig
硬脂醇1.75g
鲸蜡醇4. OOg
Span#600. 50g
聚氧乙烯#40硬脂酸酯2. OOg
三乙醇胺适量
[0218 [0219 [0220
注射用蒸馏水总计
适量 IOOg
通过使用给定量的上面提到的组分按照常规方法制备了制剂。具体来说，将甘油和对羟基苯甲酸甲酯溶解在适量注射用蒸馏水中，向溶液加入卡波姆940 (BF Goodrich, U. S. A.)，并经搅拌分散在其中。然后，向溶液加入对羟基苯甲酸丙酯和其他物质，并经融化进行乳化。然后，在用三乙醇胺控制PH后将溶液灭菌，并与在植物中表达并从植物分离的重组Hb-EGF在注射用蒸馏水的过滤和除菌溶液混合，以获得IOOg制剂。
权利要求
1.一种美容和/或治疗性组合物，其包含源自转基因植物的重组的、非植物的异源生长因子。
2.权利要求1的组合物，其是用于向皮肤施用的局部用组合物。
3.权利要求1的组合物，其中生长因子被提供为包含在美容组合物中的转基因植物提取物的组分。
4.权利要求3的组合物，其中转基因植物提取物中存在的生长因子的量在总蛋白含量的约0. 01 %到约70%的范围内。
5.权利要求3的组合物，其中转基因植物提取物中存在的生长因子的量，更优选在总蛋白含量的约0. 到约30%的范围内。
6.权利要求1的组合物，其包含一种以上源自转基因植物的生长因子。
7.权利要求6的组合物，其中所述一种以上生长因子作为来自转基因植物的提取物混合物的组分存在。
8.一种美容和/或治疗性组合物，其包含来自表达重组异源非植物生长因子的转基因植物的植物提取物。
9.权利要求1的组合物，其是用于向皮肤施用的局部用组合物。
10.权利要求8的组合物，其中所述植物提取物包含约0.01%到约99. 9%范围内的所述生长因子，优选在约0. 1到约99. 9%的范围内的所述生长因子。
11.权利要求8的组合物，其中所述植物提取物包含约0.01%到约70%范围内的所述生长因子，例如约0. 1 %到约40%范围内或约40%到约70%范围内的所述生长因子。
12.权利要求8的组合物，其中一种或多种植物来源的纯化的非植物生长因子被添加到已经含有非植物生长因子的所述植物提取物中。
13.权利要求8的组合物，其中所述生长因子被植物特异性糖基化所糖基化。
14.上述权利要求任一项的组合物，其中生长因子选自表皮生长因子(EGF)、血管上皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、红细胞生成素(Epo)、成纤维细胞生长因子4、5、6、8和9 (FGF4、FGF5、FGF6、FGF8和FGF9)、成纤维细胞生长因子a和b、Flt3配体、 肝素结合性EGF(Hb-EGF)、胰岛素样生长因子_I (IGF-I)、胰岛素样生长因子-II (IGF-II)、 白介素-^仏-^包括仏-^和IL-I β的)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-7 (IL-7)、白介素-6 (IL-6)、白介素 _8 (IL-8)、白介素-10 (IL-10)、白介素-15 (IL-15)、 白介素-18(IL-18)、白介素-20(IL-20)、白血病抑制因子(LIF)、头蛋白、胎盘生长因子-I(PIGF-I)、干细胞因子(SCF)、包括TGF-03的转化生长因子α和β (TGF-α和 TGF-β )、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、肿瘤坏死因子_b (TNF-b)、干扰素-g(INF-g)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)、神经生长因子(NGF)、角质细胞生长因子(KGF)、骨形态发生蛋白(BMP-4)和胸腺素β4。
15.上述权利要求任一项的组合物，其中所述植物提取物包含源自于被提取植物的蛋白，所述蛋白选自脱水素、球蛋白和其他种子蛋白。
16.权利要求1或14的美容组合物，其中组合物采用选自下列的剂型霜剂、洗剂、凝胶、敷料、香波、酊剂、糊剂、软膏、油膏、粉末、液体或半液体制剂、贴片、脂质体制剂、溶液、 悬液、脂质体悬液、油包水或水包油乳液、软膏、润发脂和糊剂，以及柔肤霜、面膜、按摩霜和营养霜或营养乳液。
17.—种制造局部用皮肤护理产品的方法，所述方法包括提供来自表达异源非植物生长因子的转基因植物的植物提取物，以及与至少一种美容可接受的赋形剂组合。
18.权利要求17的方法，其中所述方法还包括收获表达所述异源生长因子的转基因植物，从植物原料提取所述植物提取物。
19.权利要求17的方法，其中所述植物提取物包含在约0.01wt%到约70wt%范围的所述异源生长因子。
20.权利要求17的方法，其中所述植物提取物包含源自于被提取植物的蛋白，所述蛋白选自脱水素、球蛋白和其他种子蛋白。
21.权利要求17的方法，其中所述转基因植物提取物是大麦种子提取物。
22.权利要求17到21任一项的方法，其中所述异源生长因子选自转化生长因子-b(或 β ) (TGF-b 或 TGF-β )、转化生长因子 _a(或 α ) (TGF-a 或 TGF-α )、TNF-α、 表皮生长因子(EGF)、ΒΜΡ-4、血小板源性生长因子(PDGF)、KGF、成纤维细胞生长因子a和MaFGF和bFGF)、血管上皮生长因子(VEGF)、红细胞生成素(Epo)、胰岛素样生长因子-^见？-工入胰岛素样生长因子-工^见？^^包括仏-^和IL-Ιβ的白介素-1 (IL-I)、白介素-2 (IL-2)、白介素-7 (IL-7)、白介素_6 (IL-6)、白介素_8 (IL-8)、白介素-10 (IL-10)、白介素-18 (IL-18)、白介素-20 (IL-20)、肿瘤坏死因子-a (TNF-a)、肿瘤坏死因子-b(TNF-b)、干扰素-g(INF-g)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、角质细胞生长因子(KGF)、骨形态发生蛋白(BMP-4)和胸腺素β 4。
23.权利要求17到22任一项的方法，其还包括从所述转基因植物提取物分离所述异源生长因子。
24.权利要求23的方法，其中所述分离步骤包括使用亲和层析。
25.权利要求23的方法，其中所述分离步骤包括使用离子交换层析。
全文摘要
本发明提供了用于皮肤护理的美容和治疗性组合物，其包括含有生长因子的转基因植物提取物、或从转基因植物纯化的生长因子、或作为提取物或纯化形式的来自转基因植物的生长因子的混合物，用于局部治疗和/或美容应用中。重要的是，本发明制造了可用于美容和局部治疗的更安全的生长因子。这些生长因子不带有可能来自于动物或基于动物细胞的表达系统的不想要的污染物和可传播因子的风险，并且植物表达系统提供的重组生长因子是翻译后修饰的蛋白。
文档编号A61Q19/08GK102307561SQ200980125451
公开日2012年1月4日 申请日期2009年6月30日 优先权日2008年6月30日
发明者埃纳尔·门蒂莱, 比约恩·拉鲁斯·奥瓦尔 申请人:奥夫莱夫塔埃克尼公司