上皮蛋白(Epithclins)新的富含半胱氨酸的生长调节蛋白质的制作方法

专利名称：上皮蛋白(Epithclins)新的富含半胱氨酸的生长调节蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一族新的申请人称之为“上皮蛋白”(Epithelins)的生长调节蛋白质，它的制备方法以及它们在诊断和治疗方面的应用。申请人已经从天然细胞源中纯化了上皮蛋白中的两个成员，上皮蛋白1和上皮蛋白2，并且分离了编有几种不同上皮蛋白的cDNAs。上皮蛋白1和上皮蛋白2具有基本相似的结构，然而却是功能不同的蛋白质。上皮蛋白1是双功能生长调节剂，具有促进一些细胞型生长同时抑制另外细胞型生长的作用。上皮蛋白2在生长抑制生物活性方面与上皮蛋白1功能相似。然而相反，上皮蛋白2明显不具有上皮蛋白1的诱发生长促进活性的特性并且事实上对上皮蛋白1的这种活性起反作用。
细胞的生长和分化似乎是可以通过促进剂，抑制剂和协同因子及激素的多种作用来起动，加速，维持和调节。细胞内环境稳定机制的变化和/或破坏似乎是导致有关疾病生长，包括瘤形成的基本因素。生长调节因素牵涉很宽的病理学及生理学过程，包括信号转导，细胞传染，生长和发展，胚胎发生，免疫应答，血细胞形成，细胞存活和分化，炎症，组织修复和重建，动脉粥样硬化和癌症。
表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-α(TGFα)，血小板衍生生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，神经生长因子(NGF)，转化生长因子-β(TFGβ)，胰岛素生长因子Ⅰ和Ⅱ(IGFⅠ，IGFⅡ)，造血生长因子如促红细胞生成素，集落促进因子(CSF1和2)，白细胞间素(IL-1到8)，干扰素(IFN，α，β，γ，)，肿瘤坏死因子α和β(TNFα和β)，leukoregulin，制瘤素M，amphiregulin AR，和其它限定较少的因子是由许多细胞型在正常生理条件下或响应外源性刺激产生的生长及分化调节蛋白质，这些因子的大多数具有自体收缩(autocrine)和异体收缩(paracrine)作用。(参看Goustin et al.，1986，Cancer Res. 461015-1029;Rozengurt，1986，Science 234161-166;Pardee，1987，Cancer Res.471488-1491;Sachs，1986，Sci.Amer.25440-47;Marshall，1987，Cell 505-6;Melcher and Anderson，1987，Cell 30715-720;Namen et al.，1988，J.Exp.Med.167988-1002;Baggiolini et al.，1989，J.Clin.Invest. 841045-1049;Clemens and McNurlan，1985，Biochem，J.226345-360;Nathan，1987，J.Clin.Invest.79319-326;Sporn and Roberts，1986，J.Clin.Invest.78329-332;Old，1987，Nature 326330-331;Beutler and Cerami，1987，New Engl.J.Med.316379-385;Weinstein，1987，J.Cell.Biochem.33213-224;Zarling et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 839739-9744;Shoyab et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，856528-6532;Shoyab et al.，1989，Science 2431074-1076;Sporn and Todaro，1985，N.Engl.J.Med.303878-880;Sporn and Roberts，1985，Nature 313745-747).
由于它们在癌症的诊断，预测和治疗方面的潜在的应用，人们对生长调节因子的分离，特性以及确定功能机制很感兴趣。此外，获得有关这些因子的知识能帮助我们理解癌细胞中正常的生长控制及其失控的基本机制。
本发明涉及上皮蛋白，一族新的低分子量，富含半胱氨酸显示双功能生长调节活性的蛋白质，它在诊断和治疗人类疾病方面的应用以及制备生物活性的上皮蛋白的方法。上皮蛋白族中的两个成员上皮蛋白1和上皮蛋白2已经被鉴定并纯化得到了近似均一体，申请人由此可以确定这些新的生长调节剂的初级结构，物理性质及功能特点。上皮蛋白族中的几个其它成员已经由cDNA克隆鉴定。上皮蛋白1是含56个氨基酸的多肽，而上皮蛋白2是含57个氨基酸的多肽。在结构上，上皮蛋白1和上皮蛋白2共用47%的同源氨基酸并且分别含12个相同位置的半胱氨酸残基。
上皮蛋白可以从天然资源中分离并纯化得到，也可以用化学合成以及重组DNA技术得到。更具体地说，根据本发明，如这里实施例所做的更全面的描述(下面，第6节)，上皮蛋白1和上皮蛋白2可以从大鼠的肾组织中分离并随后用硅胶渗析和反相高效液相色谱(HPLC)结合方法纯化得到近似的均一体。如下面中进一步描述的那样，申请人已经完全确定了纯上皮蛋白Ⅰ和Ⅱ的结构，物理，化学及功能特性。


图1.粗提取物的制备性硅胶渗析HPLC。
图2.从图1的28次中得到的组份25-28的制备性反相HPLC。
图3.从图2中得到的组份55-59的半制备反相HPLC。
图4.从前一次中得到的池1b的分析用反相HPLC。
图5.从图3中得到的池2b的分析用反相HPLC。
图6.从图4中得到的浓缩组份51(A)和52(B)的分析用硅胶渗析层析。
图7.从图5中得到的浓缩组份44(A)和45(B)的分析用硅胶渗析层析。
图8.从图2中得到的组份50-54半制备用反相HPLC。
图9.从前一次中得到的组份18-23的分析用反相HPLC。
图10.从图9中得到的组份的分析用硅胶渗析层析。层析如下面第6.1节描述的那样进行。(A)浓缩组份36的HPLC;(B)浓缩组份37的HPLC;(C)浓缩组份38的HPLC;(D)从A-C中得到的组份48和49的再层析，然后浓缩。
图11.上皮蛋白1和上皮蛋白2的Tricene-SDS-PAGE分析。18%的微胶(0.75mm×10cm×7cm)在室温及90伏的恒压下在一个Bio-Rad微蛋白质Ⅱ电泳装置中运行4.5hr。将干燥后的样品悬浮于10μl样品缓冲液中(50nM Tris pH6.8，12%甘油(w/v)，4%SDS，4%巯基乙醇(v/v)和0.01% serva blue G)在95℃恒温5分钟，然后加到硅胶上。从被溴化氰分裂的马心肌红蛋白中得到的分子量标志是5个多肽(Sigma Chem.Co)。(A)上皮蛋白1;(B)上皮蛋白2。
图12.氨基酸序列和从大鼠肾中纯化得到的上皮蛋白1和上皮蛋白2的排列。用于氨基酸标准的标记单个字母是丙氨酸(A);精氨酸(R);天冬酰胺(N);天冬氨酸(D);半胱氨酸(C);谷氨酰胺(Q);谷氨酸(E);甘氨酸(G);组氨酸(H);异亮氨酸(L);赖氨酸(K);甲硫氨酸(M);苯丙氨酸(F);脯氨酸(P);丝氨酸(S);苏氨酸(T);色氨酸(W);酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)。在用于确定低聚核苷酸引物和探子的肽序列的下面划线。
图13.上皮蛋白1和2的水疗法分析(kyte和Doolittle)，-，上皮蛋白1;……上皮蛋白2。
图14.上皮蛋白1和上皮蛋白2对并入A431细胞的DNA中的125Ⅰ-脱氧尿苷的抑制作用的剂量反应曲线。·，上皮蛋白1;o，上皮蛋白2。
图15.(A)上皮蛋白1和上皮蛋白2对并入鼠角质细胞系Balb/MK DNA中的125Ⅰ-脱氧尿苷的促进作用的效果。将2000-4000个细胞沉积在含96个井盘的5%渗析过的FBS低钙介质的每个井中。然后如下面描述的那样进行GSA鉴定，·，上皮蛋白1;o，上皮蛋白2。(B)各种浓度的上皮蛋白2对上皮蛋白1(20ng/ml)诱导的掺入Balb/Mk细胞DNA中的125Ⅰ-脱氧尿苷的效果。
图16.(A)上皮蛋白1和表皮生长因子(EGF)对Balb/Mk细胞生长的作用效果。如下面第6.2节描述的那样进行鉴定。·，上皮蛋白1;o，EGF。(B)各种浓度的上皮蛋白2对上皮蛋白1(20ng/ml)诱导的鼠角质细胞生长的效果。
图17.上皮蛋白1和上皮蛋白2对有TFGβ(1ng/ml)存在下软琼脂中NRK-SA6细胞落形成的效果。用下面第6.2.3节描述的方法进行集落形成鉴定。实体棒，上皮蛋白1;点状棒，表皮生长因子;空白棒，上皮蛋白2;影线棒，20ng/ml上皮蛋白1加500ng/ml上皮蛋白2。
图18.大鼠上皮蛋白前体cDNA和演绎的氨基酸序列。
图19.589氨基酸鼠上皮蛋白前体与其自身比较的点基质排列。每个点均代表一条从十个相同残基中出来的5个。
图20.(A)大鼠上皮蛋白前体的复合二级结构分析。(B)大鼠上皮蛋白前体的水疗法。
图21.(A)从cDNA克隆演绎得到的人，大鼠及小鼠上皮蛋白前体的蛋白质序列比较。序列用标有小点的代表相同残基的单个字母表示。引入间隙来表示最适当的排列并用长划线表示。在预测的大鼠上皮蛋白信号序列下面划线并将七种富含半胱氨酸的型主用框框起来。每一序列代表一种从人、大鼠或小鼠肾RNA分离出的相同的cDNA及PCR克隆。箭头标出234bp外显子的区域，一个大鼠cDNA克隆中缺少的区域。(B)大鼠，小鼠和人上皮蛋白的氨基酸序列。(C)保存于上皮蛋白中的同样的半胱氨酸型主。(D)蕃茄(Lycopersicon esculentum)硫醇蛋白酶的C-端范围(氨基酸254-315)与上皮蛋白1和上皮蛋白2的排列。
图22.人上皮蛋白前体的核苷酸和演绎的氨基酸序列。序列是以人肾髓质RNA的PCR克隆为基础的。
图23.小鼠上皮蛋白前体的核苷酸和演绎的氨基酸序列。PCR克隆是从成年小鼠肾RNA得到的。
图24.牛上皮蛋白前体的核苷酸和演绎的氨基酸序列(部份序列)。序列是以牛精巢RNA的PCR克隆为基础的。
图25.鸡上皮蛋白前体的核苷酸和演绎的氨基酸序列(部份序列)。序列是以鸡输卵管RNA PCR克隆为基础的。
图26.COS细胞中重组体上皮蛋白的表达。(A)从与下列CDM8基表达结构转染的COS细胞得到的35S-半胱氨酸标记上清液第1行，含全部大鼠上皮蛋白密码的crEPN1.6;第2行，crEPN1.4含大鼠上皮蛋白cDNA异体而不含234bp外显子;第3行，伪转染控制。(B)从与下列CDM8表达结构转染的COS细胞中得到的35S-半胱氨酸标记的上清液第1行，cβrEPN1，含猿TGF-β1信号序列，该序列位于成熟大鼠上皮蛋白1密码区域之前;第2行，cβrEPN2，一种相似的基于大鼠上皮蛋白2的质粒。
图表27从鼠，小鼠和人源中得到的上皮蛋白富含半胱氨酸的部分之间的一组分析的树状图的代表。下面是一个上皮蛋白前体图。该图显示出前体中7个型主的位置。28个富含半胱氨酸的型主用CLUSTAL多重排列程序排列在PC-GENE上(Intellignetics Inc. Mountain View，CA)。一对相似性点被转化成不同基质，该基质用Ward的一组分析方法(SPSS/PC+，Chicago，IL)进行分析。这种方法用平方Eclidean距离排列分支点。
本发明涉及一族新的命名为“上皮蛋白”(Epithelins)的生长调节蛋白质。该上皮蛋白含有几种共有重要结构同源的不同成员。上皮蛋白族中的两个成员上皮蛋白1如上皮蛋白2已从天然来源中纯化得到，并且编码这些及上皮蛋白族中的几个其它成员的cDNA已经从大鼠，人，牛，鼠及鸡，以及其它细胞源中分离得到。
更进一步说，本发明涉及上皮蛋白族中每个单个成员，上皮蛋白衍生物及类似物，上皮蛋白编码的核酸分子(如cDNAs，染色体DNAS，RNAS，反义RNA等)常规的及重组的DNA是基于上皮蛋白制备方法，重组上皮蛋白表达媒介物和用成熟的及前体上皮蛋白，上皮蛋白编码的核酸分子，抗上皮蛋白抗体及上皮蛋白受体的诊断和/或治疗方面的应用。
上皮蛋白的制备单个上皮蛋白可以用几种常规手段制备，包括从天然来源中分离，固相肽的合成以及重组DNA技术。
从天然细胞源中分离和纯化上皮蛋白申请人所做的DNA克隆方面的成就已揭示出编有不同上皮蛋白的信息RNAs是以许多代表很宽物种范围的不同细胞型表达的。因此，申请人预测上皮蛋白族的单个成员可以从多种器官，组织和/或其它细胞来源中分离得到。上皮蛋白可以用本领域已知的各种分离和纯化技术相互分开并从这些细胞源中纯化，这些技术包括，但并不限于此，层析技术(如反相液相，硅胶渗析，液体交换，离子交换，体积排阻和亲和性层析)，离心，电泳方法，区别溶解等。
本发明的特殊情况，如下面中所做的更为详细的描述，上皮蛋白族中的两个成员(上皮蛋白1和2)可以从大鼠肾组织中分离并且继而用硅胶渗析和反相高效液相色谱(HPLC)的联合方法纯化得到近似均一体。用这种纯化得到的上皮蛋白1和2分别是含56和57个氨基酸残基的单链多肽，并具有共用重要结构的特性。在功能上，上皮蛋白1似乎是一个真正的双功能生长调节剂，可以促进和抑制细胞生长。上皮蛋白2显示出功能的独特性，因为它可以对上皮蛋白1诱导的细胞生长促进活性产生反作用。如上皮蛋白1，上皮蛋白2通常以较低程度抑制细胞的生长。上皮蛋白1和上皮蛋白2的功能，结构，物理及其它性质已经确定并在下面加以描述。下面描述的制备纯化的上皮蛋白1和上皮蛋白2的六步法和/或它的修饰也可以用于分离上皮蛋白族中的其它成员。
上皮蛋白的化学合成上皮蛋白族中的单成员可以用化学方法制备以合成全部或部分相应的氨基酸序列。例如，上皮蛋白可以用固相技术合成(Stewart and Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd edition，1984)。用这种方法合成的上皮蛋白的纯化和/或重新折叠成生物活性构造可以用本领域中各种已知技术完成。合成的上皮蛋白的氨基酸组成可以用氨基酸分析法确定。
用重组DNA技术合成上皮蛋白生物活性的成熟及前体上皮蛋白可以在重组宿主细胞系中通过上皮蛋白编码DNAs的表达来制备。基因序列分离的一般技术，能够指导编码蛋白质合成的媒介物的组建，表达和/或生物活性重组蛋白的分泌都是本领域中已知技术。
为了便于描述，用重组DNA技术制备上皮蛋白可以分成四步过程(1)对于上皮蛋白的前体或成熟形式密码序列(基因)的分离或产生;(2)具有指导所需上皮蛋白合成作用的表达媒介物的组建;(3)具有复制和表达上皮蛋白基因的适当的宿主细胞的转染或转化和/或制备基因产品以制得所需的上皮蛋白;以及(4)所需上皮蛋白的鉴定和纯化。
大鼠上皮蛋白前体克隆，它的表达和成熟大鼠上皮蛋白1和2的表达已在下面所提供的实施例加以描述。
上皮蛋白基因的分离或生产各种单个上皮蛋白的核苷酸密码序列或其功能等价物可以用于组建重组表达媒介物，该媒介物将指导所需上皮蛋白产品的表达。上皮蛋白编码核苷酸序列可以从许多细胞源中得到，该细胞源产生类似上皮蛋白的活性或表达上皮蛋白编码mRNA。在这点上，申请人已经鉴定了许多适当的人及鼠组织源，这些组织源包括，但不仅限于此，胎盘，结肠，肾，睾丸，肾上腺，乳腺，卵巢，十二指肠，胸腺和肺组织。
上皮蛋白密码序列可以通过cDNA克隆，从RNA的分离和这些细胞源的纯化得到，或通过染色体克隆得到。无论是cDNA或克隆染色体库都可以用本领域的公知技术制备并且可以由上皮蛋白1或2的已知氨基酸序列设计的核苷酸探针来扫描特殊上皮蛋白编码DNAs和/或对上皮蛋白基因任何部分作基本补充。全长克隆，如那些含所需前体或成熟上皮蛋白的所有密码区可以选择用于组建表达媒介物。
同样，上皮蛋白编码DNAs可以用本领域的标准技术通过化学合成来全部或部分合成。
由于核苷酸密码序列的固有退化，实际上，那些标记相同或功能等价氨基酸序列的其它DNA序列可以用于本发明方法中。这种上皮蛋白核苷酸序列的替换包括不同核苷酸的缺失，增加或替代，可以导致一种序列，它编有相同或功能等价的基因产品。这种基因产品可以有序列中氨基酸残基的缺失，增加或替代，它可以导致不活动的变化以产生生物活性产品。这种氨基酸的替换是根据涉及残基的极性，电性，溶解性，疏水性，亲水性和/或亲水脂性质的相似性进行的。例如，负电性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;正电性氨基酸包括赖氨酸和精氨酸;那些有相似亲水性值带有非电性极性端基团或非极性端基团的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸;甘氨酸，丙氨酸;天冬酰胺，谷酰胺;丝氨酸，苏氨酸;苯丙氨酸，酪氨酸。
上皮蛋白表达媒介物的组建为了表达生物活性，各种上皮蛋白的成熟或前体形式应选择一种表达媒介物/宿主系统，它不仅仅提供高水平的转录和翻译而且能提供基因产品的正确进程。由于上皮蛋白的成熟形式似乎是从较大的前体经由细胞内部过程衍生而来的，因此当利用一种上皮蛋白前体所有编码序列表达组建物时，这一点是特别重要的。
许多动物/宿主表达媒介物系统(例如，含有用于指导适当的宿主细胞中上皮蛋白密码序列的复制，转录和翻译所必需的元素的媒介物)可以同样地被技术人员使用。它们包括，但不仅限于此，病毒表达媒介物/哺乳动物宿主细胞系统(例如细胞肥大病毒，牛痘病毒，腺病毒子等等);昆虫病毒表达媒介物/昆虫细胞系统(如杆状病毒)或从哺乳动物细胞的染色体中衍生出来的非病毒促进剂表达系统(如小鼠金属硫堇促进剂)。适当的宿主细胞包括，但并不限于此，哺乳动物细胞。例如，哺乳动物蛋白质的渐进表达可以用一种COS细胞宿主获得，而稳定表达可以用一种CHO细胞宿主获得。
这些媒介物的表达元素在它的长度和特性方面变化。这种变化依赖于所用的宿主/媒介物系统，可以使用任何一种适当的转录和翻译元素。例如，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用从哺乳动物细胞的染色体中分离得到的促进剂(如小鼠金属硫堇促进剂)或从生长于这些细胞中的病毒分离得到的促进剂(牛痘病毒7.5K启动子或Moloney鼠肉瘤病毒长终端重复)。由重组DNA或合成技术制得的促进剂也可以用于提供插入序列的转录。
对于插入蛋白质密码序列的完全翻译也需要特殊起动信号。这些信号包括ATG起动密码子和相邻的序列。如果所有上皮蛋白基因包括它自己的起动密码子和相邻序列插入适当表达媒介物，则不需要附加的翻译控制信号。然而，如果只插入一部分密码序列，必须提供外源性翻译控制信号，包括ATG起动密码子。进一步说，起动密码子必须与上皮蛋白密码序列的阅读框架相同以保证全部插入的翻译。这些外源性翻译控制信号和起动密码子可能是多种多样的起源，自然的或合成的。表达的效果可以由转录衰减序列的内含物，提高元素等提高。
前面描述的将DNA片断插入媒介物的任何方法可以用于组建含有趣的且合适转录/翻译控制信号含上皮蛋白基因的表达媒介物。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术及体内重组。
例如，如果用腺病毒子作为表达媒介物，上皮蛋白基因序列可以连结于一种腺病毒子转录/翻译控制混合物，例如，后期促进剂和三重引导序列。这种嵌合基因可以通过体内或体外重组插入腺病毒子染色体中。插在病毒染色体的非必要区域是可以存活的并且可以在感染宿主中表达上皮蛋白。同样，可以使用牛痘7.5K促进剂。
能用于表达上皮蛋白的另一种表达系统是昆虫系统。在这种系统中，Autographa Californica核多角体病病毒(AcNPV)用作媒介物来表达外来基因。病毒在Spodoptera frugiperda细胞中生长。一种上皮蛋白密码序列可以克隆入病毒的非必须区域(如多面体基因)并在AcNPV促进剂(如多面体促进剂)的控制下。上皮蛋白密码序列的成功插入将导致多面体基因的钝化和非咬合重组病毒(例如，缺少被多面体基因编码的蛋白外衣的病毒)的产生。这些重组病毒再用于感染Spodoptera frugiperda细胞，其中表达了插入基因。
在双变(amphotropic)包细胞系中制得的逆病毒媒介物允许在许多细胞型中以高效表达。这种方法可以评价细胞型的特殊过程，调节或插入蛋白质编码序列的功能。
此外，宿主细胞链可以选择，它调节插入序列的表达或以所需的模式修饰并处理基因产品。在某种诱导剂的存在下可以提高某种促进剂的表达(如锌或钙离子的金属硫堇促进剂)。因此，可以控制遗传工程上皮蛋白的表达。如果克隆的外来基因的蛋白质产品对宿主细胞是致命的，这点就显得很重要。进一步说，蛋白质产品的修饰(例如糖基化)和处理(如分裂)对蛋白质的功能是很重要的。不同的宿主细胞对于译后过程和蛋白质修饰具有独特和特定的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以保证表达外来蛋白质的正确修饰和处理。
表达上皮蛋白基因产品传染子或转化体的鉴定含重组密码序列和表达生物活性的宿主细胞、成熟产品可以通过至少四种一般方法鉴定(a)DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-反义RNA杂交;(b)“标示剂”基因功能的存在与否;(c)通过测量宿主细胞中上皮蛋白mRNA转录的表达来评价转录水平;以及(d)通过免疫及最后它的生物活性测定来检测成熟基因产品。
在第一种方法中，插入表达媒介物中的上皮蛋白密码序列的存在可以用含与上皮蛋白密码序列类似的核苷酸序列的探子通过DNA-RNA杂交来检测。
在第二种方法中，根据某种“标示剂”基因功能的存在与否能鉴定和选择重组表达媒介物/宿主系统(如胸腺激酶活性，抗生剂对抗，氨甲蝶呤抗性，转化表观性，杆状病毒中咬合体的形成等等)。例如，如果一种上皮蛋白密码序列插在媒介物的标示剂基因序列中，则含那些密码序列的重组剂可以通过标示剂基因功能的消失而鉴定。同样，标示剂基因可以在用于控制上皮蛋白密码序列表达的相同或不同的促进剂的控制下与上皮蛋白序列顺序排列。根据诱导或选择的标示剂的表达显示了上皮蛋白密码序列的表达。
在第三种方法中，上皮蛋白密码区的转录活性可以通过杂交鉴定加以评价。例如，多聚腺苷酸化的RNA可以用类似于适当上皮蛋白序列或其特殊部分探子通过Northern blot进行分离和分析。同样，为了杂交这样的探子，可以提取并鉴定宿主细胞所有核酸。
在第四种方法中，成熟蛋白产品的表达可以进行免疫学评价。例如通过Western blot，免疫测定如放射性免疫沉淀，酶连接免疫测定等等。然而，表达系统成功的最终试验包括生物活性上皮蛋白基因产品的检测。宿主细胞分泌基因产品的区域从培养转染子宿主细胞中获得细胞自由媒介物进行上皮蛋白活性鉴定。不分泌基因产品的区域，细胞溶胞产物可以进行这种活性鉴定。在任何一种情况中，可以使用生物学鉴定，如这里所描述的生长抑制及促进的鉴定等等。
上皮蛋白衍生物、类似物和肽涉及上皮蛋白的衍生物，类似物和肽的制备和应用也被预见并且包括在本发明范围之内。这些显示生长调节活性的衍生物、类似物和肽可以，如许多上皮蛋白一样，用在很宽的范围内瘤形成及其它生长相关性疾病的诊断、预后和治疗。这些衍生物、类似物或肽与上皮蛋白本身相比在生物学活性方面有提高或降低和/或扩大或限制了上皮蛋白生长抑制活性(GIA)-而且易感细胞范围也在本发明范围内。同样，显示提高或降低生长促进活性(GSA)和/或能扩大或限制感应上皮蛋白GSA细胞范围的与上皮蛋白相关的衍生物、类似物以及肽的制备和应用可以有许多用途，包括伤口及灼伤的治疗，但并不限于此。
本发明的上皮蛋白相关的衍生物、类似物和肽可以通过本领域中许多已知方法制得。在基因和蛋白质水平上的操作和处理也在本发明范围之内。
采用本领域的已知技术，在蛋白质水平上，可以使用许多化学修饰以产生类似于上皮蛋白的衍生物、类似物和肽，这些化学修饰包括乙酰化，甲酰化，氧化，由肽链内切酶(如溴化氰，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，V8蛋白酶等等)或肽链外切酶进行的特殊化学分裂等，但并不限于此。
抗上皮蛋白抗体在本发明范围内也包括能识别上皮蛋白或相关蛋白质的多克隆及单克隆抗体的制备。
可以采用本领域中已知的各种方法进行对于上皮蛋白抗原决定基的多克隆抗体的制备，为了制备这种抗体，可以通过注射上皮蛋白或合成的上皮蛋白肽使各种宿主动物免疫，动物包括，但并不限于此，兔子，小鼠，大鼠等。根据宿主种类，可以用各种辅剂提高免疫应答，辅剂包括，但不限于此，Freund's佐剂(完全或不完全)，无机胶体(如氢氧化铝)，表面活性物质(如溶血卵磷脂)，普鲁兰尼克多元醇，聚阴离子，油乳液，Keyhole槭形血蓝蛋白，二硝基苯酚和潜在的有用的人体辅剂如BCG(bacille Calmette-Guerin)和棒状杆菌parvum(Corynebacterium parvum)。
对于上皮蛋白抗原决定基的单克隆抗体可以用提供抗体分子制备的任何技术通过培养的连续细胞系制备。它们包括，但并不限于此，最初由Kohler和Milstein(1975，Nature.256，495-497)描述的杂交瘤技术和更接近于人类B-细胞的杂交瘤技术(Kosbor et al.，1983，Immunology Today 472)和EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，Inc.，pp.77-96)。
含分子基因型的抗体片断可以用已知技术生产。例如，这种片断包括，但并不限于此，可由抗体分子胃蛋白酶的消化作用制得的F(ab′)2片断;可通过还原F(ab′)2片断二硫桥制得的Fab′片断和可通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子制得的二个Fab片断。
上皮蛋白抗体可用于成熟上皮蛋白和它们的前体以及亚成份形式的定性检测，上皮蛋白蛋白质的亲和性纯化以及上皮蛋白生物合成代谢功能的解释，上皮蛋白抗体也可用作诊断和治疗剂。
上皮蛋白的生物学描绘申请人最初的cDNA克隆方面的成就表明生长调节蛋白质的上皮蛋白族包含几种结构相似的成员。此外很明显，在很宽范围的脊索动物中用几种组织类型表达上皮蛋白编码mRNA。申请人从这些脊索动物源得到的有关上皮蛋白基因结构的最初数据推测上皮蛋白基因存在并保存了至少250百万年。各种上皮蛋白似乎是单链低分子量蛋白质。所得到的上皮蛋白序列中没有一个与以前已知的蛋白质具有显著相似性。有趣的是，几种上皮蛋白含有与磷脂酶A2的活性部位相似的区段。
从大鼠肾组织中纯化的上皮蛋白1和上皮蛋白2分别含56和57个氨基酸的蛋白质，分别共有47%氨基酸序列同源并有12个相同位置的半胱氨酸残基。这样，两种上皮蛋白的约1/5的氨基酸是半胱氨酸。这12个半胱氨酸残基的定位表明，通过它们之间二硫键的形成，这种模式指导三级结构水平上“半胱氨酸笼”的形成，或许象锌指结构那样。申请人还不知道具有这种特殊的或紧密相连的半胱氨酸模式的其它蛋白质。这种独特的半胱氨酸模式不仅在纯化的上皮蛋白1和2的初级结构中观察到，而且从几种上皮蛋白编码的cDNAs和PCR克隆的序列演绎的结构中观察到。很明显，这种独特的半胱氨酸模式是上皮蛋白族成员的区别特征，因而很可能在功能上起着重要作用。此外，在这两种纯化的上皮蛋白中保存着15种其它氨基酸。
已经分离出了cDNA编码的完整的鼠上皮蛋白前体并测定了它的核苷酸和演绎的氨基酸序列，如图18所示。鼠上皮蛋白前体含有一个含589个氨基酸残基的多肽和氨基端的17个残基，其中含有它的信号肽。很明显，在鼠上皮蛋白前体基因中编有至少7种完全的且不同的上皮蛋白种。如图19所示，用鼠上皮蛋白前体cDNA编码的上皮蛋白间的高水平序列同源可以通过在类似于鼠上皮蛋白前体序列上产生的7.5倍内同源目测到。大鼠上皮蛋白前体的复合二级结构及水疗法分析分别如图20A和图20B所示。大鼠、小鼠和人上皮蛋白前体中的氨基酸序列排列如图21A所示。
申请人已分离出了完整的人，小鼠及大鼠上皮蛋白前体DNA序列。这些上皮蛋白序列的一种复合排列如图21A所示。此外，已经获得了许多编有牛和鸟类源的各种上皮蛋白的PCR克隆(图24，25)。各种序列的分析表明上皮蛋白在不同程度上有共用由高保存半胱氨酸部分(一致)限定的不同结构特征，如图21C所示。这种相同的序列似乎通常是保存在上皮蛋白中，“CCx8CCx6CCx5CC”的半胱氨酸核体几乎完全保存在迄今为止被检测上所有上皮蛋白种中，不管其起源。例外的情况包括其中呈现半胱氨酸到丝氨酸替换的大鼠上皮蛋白前体的第一次完全重复，且型主是“SCx9CCx6CCx5CC”。进一步说，在核体第25位上的组氨酸残基似乎也保存在上皮蛋白物种中。申请人确信核体是所有上皮蛋白的独一无一的特征，因此，意味着本发明包括了具有这种结构特征的所有蛋白质。图21B显示了人，大鼠及小鼠成熟上皮蛋白1-7排列的氨基酸序列。图21C序列代表完全保存在这三种物种中的上皮蛋白2-7。上皮蛋白1的序列仅与这种序列有微小差别。
对于存在的上皮蛋白的转录，申请人已经检测了从许多人，鼠组织及细胞系中得到的RNA，其结果总结在下面的表1中。
表Ⅰ在各种人及鼠的组织及细胞中上皮蛋白转录表达的分布人强+弱+负性(用大鼠探子)胎盘 卵巢 脑结肠 十二指肠 表皮肾髓质 胸腺 肝肾皮质 肺 垂体睾丸 肾 羊膜肾上腺 骨髓乳腺 小脑CRL7386 HBL100CaKi-1 HEPM MCF-7
人强+弱+负性(用大鼠探子)CRL1550 CRO1572 HTB27CaKi-2 HTB132 T47DHUF 1477 CEMA-1CCL137 HSB2U937 Breast CaHTB131 Wilm′s CaBT474小鼠 HTB36强+弱负性胎儿肠 心脏 无胎盘 卵巢肾 胸腺胰腺脑(皮质) 小脑肺胚胎d15胚胎D6肝结肠十二指肠骨骼肌
CCL51CCL51(TPA)纯化的上皮蛋白1和上皮蛋白2的生物特性在下面节作详细的描述。两种蛋白质在用1M乙酸，1M氢氧化铵，6M脲，10mM偏高碘酸钠处理并在56℃加热30分钟后是稳定的。两种蛋白质的生物活性对蛋白水解酶及还原剂特别敏感。很明显至少上皮蛋白结构中的一些二硫键对其生物活性是必须的，低聚糖和/或脂类部分对上皮蛋白1或2的活性都是不明显的。
上皮蛋白1和上皮蛋白2尤其对人体表皮样癌细胞显示生长抑制活性。然而，申请人提供的数据表明上皮蛋白1是更有力的细胞生长抑制剂。例如，纯化后的上皮蛋白1的计算所得的特殊活性几乎是上皮蛋白2的10倍，并且上皮蛋白1在抑制A431细胞生长方面比上皮蛋白2强36倍。此外，在至少一种受试细胞系-人结肠癌细胞系中，上皮蛋白2不具有触发抑制效果，而上皮蛋白1却能被观察到。
更有趣的是上皮蛋白1和上皮蛋白2之间关于细胞生长促进生物活性方面的功能是不同的申请人已经说明上皮蛋白1除了具有生长抑制生物活性外还是几种细胞系的有效的细胞生长促进剂，由此申请人得出结论，上皮蛋白1是一种真正的双功能生长调节剂。相反，申请人所得到的数据表明上皮蛋白2至少在受试细胞系中不具有触发生长促进的效应。
或许其中最有趣的是申请人进一步发现上皮蛋白2明显对由上皮蛋白1产生的促进活性起反作用。虽然目前还不能理解在这些上皮蛋白和/或其它上皮蛋白之间的功能方面的相互关系，但很可能上皮蛋白2是通过控制上皮蛋白1诱发的促进活性而发挥作用的。申请人推测上皮蛋白1和上皮蛋白2之间，和/或上皮蛋白族的其它成员之间的兴奋/缬抗作用关系可以控制或影响正常的和不可抑制的细胞生长和发展间的平衡。从这点看，细胞内环境稳定可以由于失去一种由上皮蛋白提供的关键功能或牵涉到导致不可抑制细胞增殖的这种相互关系的上皮蛋白而有所变化或受到破坏。通过上皮蛋白，抗上皮蛋白抗体和/或上皮蛋白受体的治疗方面的应用，可以调节和/或恢复细胞内环境稳定。
上皮蛋白前体表达单个型主的能力在确定不同过程是否释放其它活性分子方面有所帮助。为了选择候选效应物或阻断物，需对图21A所示的富含半胱氨酸的序列进行排列和一系列分析。其结果由图27的树状图表示。在所有情况中，在其它2个物种前体的相同位置上发现了极少不相似的部分。基于这些发现，原始的上皮蛋白基因可能在啮齿类和人类的趋异性之前进行7重复制。这种分析也表明上皮蛋白前体的第五次重复是与上皮蛋白1最为相近的并且是具有生长促进活性的候选物。此外，第二次重复与上皮蛋白2最为相近并且是上皮蛋白1促进有丝分裂效果的拮抗候选物。
上皮蛋白基因具有几种有趣的特征。基因的随遇性表达表明它在保持正常上皮蛋白细胞生长方面起着作用，且与前面描述的具有更严格分布的分子相反。上皮蛋白前体的高重复性和富含半胱氨酸的结构限定了一种新的且进化保存的型主。进一步说，这些型主中的至少两种可以被蛋白酶制成活性生长调节剂。这种构型与proopiomelanocortin(POMC)，激素原相似，后者是一种以组织特异性方式处理以便释放许多生物活性肽(Smith and Funder，1988，Endocr.Rev. 9159-79)。
上皮蛋白1和上皮蛋白2在上皮蛋白细胞生长方面的相反活性可以使人们联想到那些天然存在的结构相关的分子作为母体分子拮抗剂或抑制剂的其它系统。这种例子包括IL-ira，一种白细胞间素-1受体拮抗剂(Hannum et al.，1990，Nature 343336-40;Eisenberg et al.，1990，Nature 343341-46);Krev-1(Kitayama et al.，1989，Cell 5677-84)，一种抑制大鼠诱导转化作用的蛋白质;和抑制素(Ling et al.，1985，Poc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 827217-21)，一种对抗苯丙酸诺龙生物效应的性腺蛋白质(Ling et al.，1986，Nature 321779-82)。确定上皮蛋白1和2细胞受体的进一步研究需要明确定这些分子是如何传递它们的相反信号的。两种活性是同一转录产品的这一发现引起了人们的兴趣，可以想象，组织-，空间-，或暂时特异性过程是提供一种调节上皮内环境稳定的唯一方法。
上皮蛋白(epithelins)、上皮蛋白编码的核酸分子、抗-上皮蛋白抗体和上皮蛋白受体的应用申请人认为本发明组合物有种类繁多的应用，包括上皮蛋白、上皮蛋白类似物和衍生物、上皮蛋白编码的核酸分子、抗-上皮蛋白抗体和上皮蛋白受体在诊断和/或治疗上的应用。
上皮蛋白上皮蛋白、类似物和衍生物以及含有它们的组合物，可以单独或彼此间结合和/或与其它生物学上的活性生长因子、抑制剂或免疫调节剂在体内和体外调节脊索动物细胞生长和/或发育。
使用不同的上皮蛋白和上皮蛋白组合物，可以达到不同的治疗目的。特别是，在上皮蛋白1和上皮蛋白2之间可观察到的功能差异，申请人认为这两种上皮蛋白可以用于不同的目的。但是，尽管它们功能不同，尽管申请人的原始数据表明上皮蛋白1可能是较强的和/或有效的肿瘤抑制剂，但由于它们二者都表明具有抑制肿瘤细胞生长的能力，上皮蛋白1和上皮蛋白2两者都可以用作抗肿瘤剂。使用上皮蛋白和/或其它因子特殊的结合物，将依赖于所包括的靶细胞的类型以及所要求的特殊目的。
对于体内使用，本发明组合物可以以不同的方式给药，包括但不仅限于注射、输注、皮肤给药、胃肠外给药等。施药可以是在任何生理上可接受的载体中，包括磷酸缓冲液盐水盐水、消毒的水等。上皮蛋白和相关的分子也可以被胶囊包在脂质体中，并可以与抗体结合，该抗体能识别和凝结在瘤或细胞特异性抗原上，因而提供了本发明组合物针对“靶”的方法。
上皮蛋白可以在体内用于诱导肿瘤细胞晚期的分化作用。这种细胞使正常细胞的细胞分化特有的普通过程转向，并具有继续增殖的能力。相反地，在大部分情况下，正常细胞分化成没有能力进一步使细胞分裂的细胞。这样，上皮蛋白对肿瘤中正常细胞分化作用再活化和最终阻止肿瘤继续生长的能力，在肿瘤治疗过程中可找到有价值的应用。
在肿瘤和其它生长有关的疾病的治疗中，上皮蛋白和有关的衍生物、类似物及其肽可以单独用，或与至少一种其它的抗增殖化合物，包括例如干扰素、TFG-β、肿瘤坏死因子等使用。也可以在癌细胞中通过诱导上皮蛋白的产生治疗癌症。
本发明化合物可用于体外抑制细胞或与不敏感细胞有区别的对上皮蛋白敏感的细胞系的生长。这样，异种混合物或细胞系能够免除不需要的细胞，其中不需要的细胞对上皮蛋白生长抑制活性是敏感的。例如，本发明化合物可用于体外从对于自身髓移植的骨髓中消除恶性细胞，并在再次输注之前消除或抑制血液中恶性细胞的增殖。
上皮蛋白抑制所给出的细胞增殖的最有效的浓度，可以通过向感兴趣的肿瘤细胞中加入各种浓度的上皮蛋白并检验抑制细胞增殖的量来测定。单个诱导剂和/或结合的诱导剂的最有效的浓度，可以通过在癌细胞中检验上皮蛋白的生成来测定。
细胞生长的刺激作用，可通过上皮蛋白1、类似上皮蛋白分子或许通过上皮蛋白家族中其它成员诱导。以这种上皮蛋白生物活性为基础的广泛的治疗上的应用已被预想到，包括但不仅限于伤口愈合和组织再造。此外，能够中和上皮蛋白2的上皮蛋白1抑制活性的抗体，在与或不与上皮蛋白1或类似上皮蛋白分子共同施药情况下，也可以用于促进伤口愈合和组织再造。
本发明组合物还可以应用于治疗在正常细胞增殖的人的皮肤疾病，如牛皮癣。虽然牛皮癣的发病机理还不知道，但这种疾病涉及上皮细胞快速增殖和更新。伴随角质化细胞改变角质化的快速更新，这导致这种疾病特征的增厚的表皮和鳞片。由于上皮蛋白1刺激角质化细胞生长和增殖，有效的治疗抑制这种上皮蛋白1诱导的活性可阻止这种疾病的发作和发展。因此，能够抑制牛皮癣患者的可以是内生的或非正常的高水平的上皮蛋白1的组合物可能对治愈这种疾病有效。申请人已经阐明上皮蛋白2特异性地抑制上皮蛋白-Ⅰ诱导的角质化细胞的刺激作用。在这方面，含有上皮蛋白2的组合物尤其是可用于牛皮癣的治疗。相似地，能够中和上皮蛋白1刺激活性的抗体，可用于抑制上皮蛋白1的活性。
申请人还预想到上皮蛋白和类似上皮蛋白分子可用于其它治疗目的，包括但不只限于血管生成的调节、肾的发育、骨吸收、免疫应答、突触和神经元效应基因功能、花生四烯链锁和性腺和生殖功能。
上皮蛋白和相关分子的大量诊断上的应用已被预见到。在本发明实施中，可以将多肽与一标记结合，例如放射性同位素、酶、荧光增白剂、化学发光剂、酶片段、颗粒等，这种化合物可以用来滴定细胞上的上皮蛋白受体的数目。上皮蛋白受体的确定是细胞对上皮蛋白和相关分子的生物学效应的潜在应答的一种表示法。上皮蛋白、上皮蛋白相关分子和/或其抗体可以用于用竞争检测以检查介质中，特别是生理介质中的上皮蛋白。本技术领域已知的各种各样的诊断检测都可以加以使用。
在体液和组织中的上皮蛋白的存在和其水平，可能直接或逆向地与某种癌和其它生长有关的疾病的存在和蔓延有关。能够检查和/或确定上皮蛋白数目的检测方法，可以应用到有关生长疾病的诊断和予后上。
另外，表达上皮蛋白受体的恶性细胞，可通过用受体结合检测法中的标记上皮蛋白或上皮蛋白相关分子，或通过利用对上皮蛋白受体自身的抗体进行检测。根据上皮蛋白受体的存在和其密度可以辨别细胞，从而提供一种予见这种细胞对上皮蛋白生物活性敏感的手段。
上皮蛋白编码的核酸分子上皮蛋白编码的核酸分子或其片段可被用作探针来检查和确定mRNA编码的上皮蛋白数目。在本技术领域利用核酸探针来识别由所有或部分已知的基因序列构成序列的检测是众所周知的。上皮蛋白mRNA的水平可表示肿瘤的出现和/或存在以及包括但不只限于牛皮癣的其它人类疾病的发作和/或进展，因此，能够检查和确定上皮蛋白mRNA数目的检测方法，提供了一种有价值的诊断手段。
反义的上皮蛋白RNA分子可用于治疗上抑制上皮蛋白编码的mRNA的转译，其中治疗的目的包括期望消除所给出的上皮蛋白的存在。例如，上皮蛋白1反义RNA，能够在上皮蛋白1为成因剂疾病治疗中，用作上皮蛋白1对抗剂。另外，上皮蛋白反义RNA可用于解释上皮蛋白作用机理。
上皮蛋白编码的核酸分子可用于重组的上皮蛋白和相关分子的生产，如在上述5.1.3.节中分别讨论的。
实施例由鼠肾中纯化的上皮蛋白1和上皮蛋白2的制备纯化过程酸性乙醇提取由Pel-Freeze(Rogers，Arkansas)中得到鼠肾。将冷冻的鼠肾(湿重430g)悬浮于含2348ml乙醇(98%)、19ml浓HCl、81.5mg苯甲基磺酰基氟和2.8ml抑肽酶(23TIU/ml由牛肺得;Sigma Chemical Co.)的2370ml提取缓冲液中，于4℃令组织融化4-6小时，并将混合物在华林氏混合器(Waring blender)中搅匀。将混合物于4℃搅拌过夜，在Sorvall GS-3旋转器中以9，000rpm(转数/分)离心40分钟，并小心除去上清液(2，200ml)。向上清液中加入氯仿(2，200ml)和220ml酸化的水(375ml水+7.5ml浓HCl)，混合物剧烈搅拌大约1小时，室温静置以分成两相。将上层水相小心除去，并于4℃在3号Spectropore渗析管中对0.1M的17升乙酸渗析(除去分子量大约3，000的)，在大于两天的时间内渗析缓冲液换三次。将保留物retenate)冻干并将称为“粗提物”的冻干物(4.55g)，于-20℃贮藏直至进一步使用。
制备凝胶渗透色谱将Bio-Sil TSK-250柱(21.5×600mm)(Bio Rad)连接成一个高效液相色谱(HPLC)系统(Waters)。将粗提物(25mg/ml)溶解于有0.1%三氟乙酸(TFA)的50%乙腈/水中，注射3ml混合物的等分试样，并用有0.1%TFA的50%乙腈的流动相均匀地(isocratically)进行洗脱，流速为4ml/min和记录纸的速度保持在0.25cm/min。收集6ml个馏分，色谱在室温下进行。将每份的等分试样蒸发，并如下文6.2.1.节所描述(图1)的以一式三份对A431人的表皮样肿瘤细胞进行生长抑制活性(GIA)检测。
较晚洗脱的较低峰(25-28份)含有感兴趣的新活性。从相似的57轮中的25-28份予以混合，浓缩并冻干。冻干物重473mg，并具有总共大约1.1×105GIA单位。
制备TSK-250组分的反相HPLC将冻干的组分(上文6.1.2.节)溶解于240ml0.1%TFA的水中;将混合物离心，小心除去上清液。最终体积约为250ml。将125ml这种混合物均匀地注射到由制备Partisil 10 ODS-3柱(10微米，2.2×25cm;Whatman)附加的HPLC系统。流速保持在4ml/min。一旦样品通过柱子，就将柱子用150ml 0.1%TFA的水洗。一级溶剂，0.1%TFA的水和二级溶剂，含0.1%TFA的乙腈之间呈线性梯度。梯度条件是270分钟0-45%和45分钟45-100%。收集14ml馏分，并将每份的等分试样进行GIA检测，观察到四个活性的宽峰(图2)。第二轮如上述进行。最早的两个洗脱峰，峰a和峰b分别含有上皮蛋白2和上皮蛋白1，并将它们进一步纯化和定性。上皮蛋白1和上皮蛋白2的进一步纯化将在下文单独描述。
利用反相和凝胶渗透HPLC进一步纯化上皮蛋白1将两轮的55-59份(图2)混合，并用0.1%TFA的水稀释两倍。在室温流速为2ml/min情况下，将混合物均匀地注入半制备μ-Bondapak-C18柱(7.8×300mm，Waters)。一级溶剂，含0.1%TFA的水和二级溶剂，含0.1%TFA的乙腈之间的线性梯度条件为1.8分钟0-18%，20分钟18-18%，240分钟18-34%和10分钟34-100%。梯度洗脱始终保持流速为2ml/min;收集7ml馏份。分出等分试样并进行GIA检测。洗脱在乙腈浓度分别大约是24%和25%时观察到两个活性的峰(图3)。
将30-34份混合，向混合的组份中加入45ml 0.1%TFA的水。在室温下流速为1ml/min情况下将混合物均匀地注到μ-Ban-dapak-CN柱(3.9×300mm，Waters)，梯度条件为1分钟0-10%，19分钟10-10%，200分钟10-30%和7分钟30-100%，流速为0.5ml/min并收集1.5ml馏分。由柱上在大约21.5%乙腈浓度时出现大部分活性(图4)。
将36-43份混合，并用0.1%TFA/H2O稀释至最终体积为115ml，并完全按照上述30-34份的情况正好进行色谱分离。当大约22.5%和23.5%乙腈浓度洗脱时，由柱上两个峰(图5)洗脱得大部分活性。
用快速真空浓缩器(speed-vac concentrator)(Savant)将51和52份(图4)单独浓缩，至体积约为70μl，向其中加入等体积的含0.1%TFA的乙腈。将此140μl样品注入到两个一前一后安置的Bio-Sil Tsk-250柱(每支7.5×300mm，Bio-Rad)。室温下用含0.1%TFA的50%乙腈/H2O的流动相均匀地进行洗脱。流速为0.4ml/min和记录纸的速度为0.25cm/min;按每份0.4ml收集，并将等分试样进行GIA检测。51和52份的色谱图像分别如表6A和表6B所示。
将44和45份(图5)单独浓缩至70ml，并然后如上所述进行凝胶渗透色谱分离。色谱图像在图7中给出。
利用反相和凝胶渗透层析进一步纯化上皮蛋白2将两轮中的50-54份(图2)混合，并用0.1%TFA/H2O稀释两倍。在流速为2ml/min情况下将混合物注入到半制备μ-Bondapak-C18柱(7.8×30mm，Waters)。一级溶剂，含0.1%TFA的水和二级溶剂，含0.1%TFA的乙腈之间的线性梯度条件为1.8分钟0-18%，20分钟18-18%，240分钟18-34%和10分钟34-100%。梯度洗脱始终保持流速为2ml/min;收集7ml馏分。分出等分试样并进行GIA检测。色谱图像如表8所示。在大约20.5%乙腈浓度时洗脱出主要活性峰。
将18-23份混合并用0.1%TFA/H2O稀释至最终体积为110ml。在室温流速为1ml/min情况下将混合物注入到μ-Bondapak-CN柱(3.9×300mm，Waters)。梯度条件为1分钟0-10%，19分钟10-10%，200分钟10-30%和7分钟30-100%。流速为0.5ml/min;收集1.5ml馏分。由柱上在大约18%乙腈浓度时出现活性(图9)。
将36-38份(图8)单独浓缩至大约70μl，向其中加入等体积的含0.1%TFA的乙腈。将此140μl样品注入到一前一后安置的两个Bio-Sil TSK-250柱(每支7.5×300mm，Bio-Rad)。用含0.1%TFA的50%乙腈的流动相均匀地进行洗脱，流速为0.4ml/min;收集0.4ml馏分，并将等分试样进行GIA检测。36、37和38份的色谱图像分别如表10A、10B和10C所示。
由图10A-C的48-49份混合，并浓缩至大约70μl，然后如上所述进行凝胶渗透色谱分离。在图10D中表示再色谱图像。
生物鉴定利用125I-脱氧尿苷嵌入DNA的细胞生长抑制活性在平底的96井培养皿(Falcon 3072)上进行细胞生长抑制活性(GIA)的测定。将人的外阴表皮样癌细胞(A431)用作GIA的试验细胞。除外周井外在所有的井中放入在50μl试验介质(附加了5%热灭活的牛胎血清(FBS)、青霉素/链霉素(PS)和谷氨酰胺的DMEM)中的3.5×104个细胞。外周井中放入50μlPBS。三小时后，每个井中加入50μl在试验介质中的试验样品，而对照井中只加入50μl试验介质。三个井用于每种浓度的试验样品。将培养皿于37℃恒温培养2-3天。然后向每个井中加入100μl的125I-碘-2′-125I-脱氧尿苷溶液(在试验介质中125I-IUdR、4Ci/mg-0.5mCi/ml、2μl/ml)，并将培养皿于37℃恒温培养。4-6小时后，由井中抽吸出介质，然后用200μlPBS洗涤一次。然后向每个井中加入200μl甲醇，于室温将培养皿恒温培养10分钟，并通过抽吸除去甲醇。向每个井中加入200μl的1M氢氧化钠，将培养皿于37℃恒温培养30分钟。用titertek填料(Flow Labs)除去氢氧化钠，将填料转移到12×75mm塑料试管中，并在伽马计数器(gamma counter)中计数以确定125I-IUdR的嵌入数目。
利用鼠的角质化细胞测定细胞生长抑制和刺激活性以在1ml低钙介质中(Weissman和Aaronson，1983，Cell 32599-606;Carpenter和Zendegut，1985，Anal.Biochem.153279-282)每井1×104细胞将Balb/MK细胞加到24井Costar培养皿中，并于37℃恒室培养4-6小时。然后除去介质并用1ml一式三份含各种浓度试验化合物的介质取代，对照组只加入没有任何试验物的介质。将培养皿于37℃恒室培养4天，然后除去介质，用1ml磷酸缓冲液盐水将井漂洗两次，并用胰蛋白酶-EDTA将细胞分开并计数。
如上节所述利用125I-脱氧尿苷嵌入DNA，在96井培养皿中，将Balb/MK细胞用作指示细胞以评估试验物的生长抑制活性(GIA)或生长刺激活性(GSA)。
软琼脂菌落测定在含有10%热灭活FBS的DMEM中，将0.38ml的0.5%琼脂基底层(Agar Noble;Difco试验室，Detroit，Michigan)加到24井Costar组织培养皿中。将0.38ml含有相同介质-FBS混合物、6-12×103试验细胞和各种不同浓度的试验蛋白的0.3%琼脂，覆盖在琼脂的基底层上，将培养皿在空气中在5%CO2的潮湿的气氛下于37℃恒温培养。计数脱落和未染色的菌落，并计下7到10天之间的菌落数。菌落定义为至少8个细胞的一簇。
一级结构的测定还原和S-吡啶基乙基化作用将蛋白(10-20μg)在1.5ml微尘(microfuge)聚丙烯试管中干燥，悬浮于100μl 0.05M Tris-HCl(缓血酸胺-HCl)，pH7.5的3M尿素中。然后向混合物中加入4μl2-巯基乙醇，将内容物混合，氮气冲洗，并于25℃恒温培养。2.5小时后，向混合物中加入4.5μl新蒸4-乙烯基吡啶，试管再用氮气冲洗并于25℃恒温培养2.5小时。将反应混合物用10%TFA酸化至pH2.0，利用Partisil 5 ODS-3柱(4.6×100mm，whatman)通过反相HPLC将S-吡啶基乙基化的蛋白纯化。在流速为1ml/min情况下55分钟之内乙腈浓度呈线性增高(1%/min)。一级溶剂为0.1%TFA/H2O。在乙腈大约为25%和23%时分别洗脱S-吡啶基乙基化的上皮蛋白1(SPE-上皮蛋白1)和SPE-上皮蛋白2，与未处理的上皮蛋白相比乙腈浓度大约高2-3%。
SPE-上皮蛋白1和上皮蛋白2的酶裂解在25℃60μl0.1M缓血酸胺乙酸缓冲液(Tris-acetic acid buffer)，pH8.0用肽链内切酶赖氨酸-C和TPCK-胰蛋白酶进行裂解16小时，酶/底物的比率是1-5(w/w)。肽链内切酶-精氨酸和S.aureus V8蛋白酶的消化作用在37℃80μl的0.05M缓血酸胺-HCl(Tris-HCl)，pH8.0，0.1M碳酸氢铵中进行16小时，酶/底物的比率也是1-5。
肽的分离在反相HPLC C18柱(4.6×100mm，Whatman)附加的HPLC系统(Waters)上分离肽。在流速为1min/ml情况下将酸化的样品(pH2.0)应用于用0.1%TFA(一级溶剂)平衡3的柱子上，并将柱子用大约15ml0.1%TFA进一步洗涤。在一级溶剂和二级溶剂(含0.1%TFA的乙腈)间用线性梯度，梯度条件为在流速为0.5ml/min情况下125分钟0-50%。
氨基酸分析在105℃特氟隆密封玻璃水解球(Teflon-sealed glass hydrolysis bulb)(Pierce)中减压下用含1%(v/v)苯酚的恒定的沸腾HCl将干燥的样品水解16小时。水解产物在快速真空浓缩器(Speed Vac Concentrator)(Savant仪器(Savant Instruments))中干燥并在室温下用苯基异硫代氰酸酯诱导(derivitized)20分钟。利用反相HPLC在十八烷基柱(4.5×250mm，IBM)上对苯基硫代氨基甲酰氨基酸衍生物(phenylthio carbamyl amino acid)进行分析。于38℃流速1ml/min下一级溶剂，0.15M乙酸钠pH6.4，用乙酸滴定至pH6.4的0.05%三乙胺和二级溶剂60%乙腈之间进行线性梯度洗脱。
氨基酸序列的确定用所述的(Hewick等，1981，J.Biol.Chem.2567990-7997)实用生化系统模型(Applied Biosystem model)475气相序列仪(gas phase sequencer)确定肽的序列。在样品应用于每一轮之前进行三个Edman降解(Edman degradation)的前期循环(precycle)。用25%TFA将三唑啉衍生物转变成苯基硫代乙内酰脲氨基酸(phenylthiohydantoin amino acid)。在所述的(Hunkapiller和Hood，1983，Science 219650-659)120A型PTH分析仪(适用于生化系统)上在线上进行苯基硫代乙内酰脲氨基酸的鉴定。
一种缓冲剂-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳利用Schager和Gebhard，1987，Biochem.166368-379的方法，在一种缓冲剂/十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺板状凝胶(常规或微型Bio-Rad系统)上进行肽分析。利用银染色(Wray等，1981，Anal.Biochem.118197-203)测定肽。
上皮蛋白1和2的特性物理和化学性质上皮蛋白1和上皮蛋白2对用1M乙酸、1M氢氧化铵、6M尿素、0.01M偏高碘酸钠处理，在56℃加热30分钟处理，和用不同的糖苷酶或脂酶处理有抵抗力。但是，上皮蛋白的活性对还原作用、还原和4-乙烯基吡啶处理以及用如胰蛋白酶、内蛋白酶赖氨酸-C和内蛋白酶谷氨酸-C(V8)的蛋白酶消化作用是敏感的。这些结果表明这些要素是在基本生物活性的二硫键上含有半胱氨酸的蛋白质。这些蛋白质不含有对生物活性必须的低聚糖和/或脂类一部分。
上皮蛋白1和上皮蛋白2的纯化和某些物理性质上皮蛋白1和上皮蛋白2纯化作用的总结分别如表Ⅰ和表Ⅱ所示。通过相似的六步拟定的方法两者因子纯化表现出同性。最初步骤组份对A431细胞有多重生长抑制活性，在最初组份中上皮蛋白1和2只构成总GIA的很小部分，使得在纯化的最初阶段确定它们特异活性的值相当困难。纯化的上皮蛋白1的特异活性大约是2.1×104单位/mg蛋白质，而纯化的上皮蛋白2具有3.8×103单位/mg蛋白质的相当低的特异活性。
表Ⅱ上皮蛋白1(GIA)的纯化总结蛋白质 GIA 特异性活性 产率组份 μg 单位1单位/mg %粗品 4，550，000 1，283，1002282 -制备的TSK-250 473，000 112，2002237 -制备的ODS(b) 17，600 14，100 801 100半制备 C181b 1，510 2，080 1，377 14.82b 3，460 5，460 1，578 38.7氰基分析1b 60 713 11，889 3.42b 73 1，190 16，301 8.4Tsk-250分析1b 41 845 20，609 6.02b 62 1，305 21，048 9.3
11GIA单位是50%抑制125I-标记的脱氧尿苷嵌入A431细胞所需因子的量。
2在这些组分中存在其它生长抑制剂活性。这些数值包括所有活性。
表Ⅲ上皮蛋白2(GIA)的纯化总结蛋白质 GIA 特异性活性 产率组份 μg 单位1单位/mg %粗品 4，550，000 1，283，1002282 -制备的TSK-250 473，000 112，2002237 -制备的ODS(b) 24，500 9，567 432 100半制备 C18 4，760 1，190 250 12.4氰基分析 169 460 2，741 4.8TSK-250分析 37 141 3，810 1.511GIA单位是50%抑制125I-标记的脱氧尿苷嵌入A431细胞所需因子的量。
2在这些组分中存在其它生长抑制剂活性。这些数值包括所有活性。
通过在TSK-250柱上的凝胶渗透色谱测定上皮蛋白1和上皮蛋白2的分子量，分别是～4，500和～3，700(图6、7和10)。通过相似的凝胶渗透色谱测定，SPE-上皮蛋白1或2具有～13，000的分子量。
图11给出了在还原条件下在18%聚丙烯酰胺凝胶中上皮蛋白1和上皮蛋白2的分析结果。上皮蛋白1和上皮蛋白2在分别有大约5，500和6，000中等相对分子量的单一带凝胶上迁移。在非还原条件下当蛋白质进行电泳时得相似的结果。因此，上皮蛋白是单链低分子量的蛋白质。
上皮蛋白1和上皮蛋白2的化学结构上皮蛋白1和上皮蛋白2的氨基酸序列通过S-吡啶基乙基化的蛋白质微序列(microsequence)分析和通过内蛋白酶赖氨酸-C、staphylococcal aureus V8和TPCK胰蛋白酶生成的片段的分析获得。上皮蛋白1和上皮蛋白2的氨基酸序列如图12所示。
上皮蛋白1和上皮蛋白2的蛋白质序列与所有的在国家生物医学研究基金(the National Biomedical Research Foundation)数据库(公布22)、遗传序列数据库(Genetic sequence Data Bank)(Bolt Beranek和Newman，Los Alamos国家试验室;公布61)和欧洲分子生物学试验室(European Moleculor Biology Laboratory)数据库(公布20)中的全部蛋白质进行比较。这些计算机的辅助研究揭示出两种蛋白质是新的，并与三个数据库中的任何蛋白质不分享任何有效的同源性。
上皮蛋白1和上皮蛋白2分别是56和57个氨基酸残基的单链多肽，分别具有6060和6094的计算分子量。上皮蛋白1和上皮蛋白2在氨基酸水平分享47%同源性。两种蛋白质具有4个双半胱氨酸(double cysteine)残基的12个半胱氨酸残基。这样在两种蛋白质中21%的氨基酸残基是半胱氨酸。此外，在上皮蛋白/和上皮蛋白2中单半胱氨酸(single cysteine)残基和双半胱氨酸残基的空间位置完全相同。尽管在这些蛋白质中链内的二硫键的数量或位置现在还然多(A)尾状物，或退火到添加到5′延长的cDNA的合成多(A)轨道上的引物(plowman等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.874905-08)。鼠肾cDNA程序库在λgt10中构成(plowman等，1990，Mol.Cell Biol.101969-81)，并且通过筛选检查2.0×105与PCR产生的上皮蛋白探针的重组体，分离完整长度的鼠上皮蛋白cDNA。这些探针还可用于由小鼠T-细胞基因组程序库获得小鼠上皮蛋白基因(层基因(Stratagene)，La Jolla，CA)。利用与低聚核苷酸引物进行T7聚合酶的方法，来排列几种PCR-生殖克隆、鼠cDNA克隆和小鼠基因组克隆在两个丝条上(Tabor和Richardson 1987.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.844767-71)。
鼠上皮蛋白cDNA的组合序列(图18)是2150bp长，其用鼠肾mRNA通过northern分析法观察到接近大约2.3千碱基转录。此序列预示了一种具有30bp5′-未翻译区和343bp3′-未翻译区的589个残基的前体蛋白(preprotein)。开始的AUG连有一个N-末端疏水性的16个氨基酸的信号肽和具有预见的61，597Mr的573个氨基酸成熟的上皮蛋白前体。此前体无透过膜区、3个潜在的N-连锁的糖基化位点和88个半胱氨酸残基。上皮蛋白前体具有一个含有55-57个氨基酸一致型主的7种一前一后付本的高重复性结构(图19)VXCX5-6CX5CCX8CCX6CCXDX2HCCPX4CX5-6CX2。
其中的两个重复代表着已知活性的分子，上皮蛋白1和上皮蛋白2。小鼠和人上皮蛋白前体预见的氨基酸序列分别含有589和593个残基，并显示其86%(小鼠)和75%(人)序列与鼠蛋白完全一的角质化细胞(Balb/MK细胞)的DNA效果进行调查。数据如图15A所示。上皮蛋白1可以剂量依赖的方式(a dose-dependept manner)刺激125I-脱氧尿苷的嵌入作用，而上皮蛋白2没有表示重要作用。然而上皮蛋白2抑制了上皮蛋白1诱发的把125I-脱氧尿苷嵌入到Balk/MK细胞上的嵌入作用(图15B)。在这方面，观察到在～21nM上皮蛋白2的50%抑制作用。因此，在此系统中上皮蛋白2对上皮蛋白1的作用是起反作用。
鼠角质化细胞系，Balb/MK的继续生长依赖于EGF、TGFα或amphiregulin(AR)。在没有EGF或上皮蛋白1存在下Balk/MK细胞不增殖(图16A)，而上皮蛋白2对这些细胞的生长不具有任何重大作用。但是，在剂量依赖的方式下上皮蛋白2抑制上皮蛋白1诱导的Balk/MK细胞的生长(图16B);在～7nM上皮蛋白2上观察到50%抑制作用。在TFGβ存在下，EGF或TGFα可诱导鼠肾细胞NRK-SA6固定-独立地生长(anchorage-independent growth)(Roberts等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 785339-5344)。在剂量依赖方式下，上皮蛋白1类似EGF可诱导NRK细胞的固定-独立地生长(图17)，而上皮蛋白2则不能。在软琼脂中，上皮蛋白2(在～85nM浓度)可抑制大约50%上皮蛋白1诱导的菌落形成。而且，上皮蛋白1，而不是上皮蛋白2，对单层中NRK细胞上具有促有丝分裂的活性。
无论上皮蛋白1还是上皮蛋白2都不极大影响125IEGF与它的受体结合，这表明上皮蛋白通过EGF受体不传送它们生物作用。
实施例上皮蛋白前体的cDNA克隆和前体的瞬时表达及成熟形式不知道，但估计具有相似或相同的模型。两种蛋白质中还具有大约13%的羟基氨基酸(色氨酸和苏氨酸在一起)。上皮蛋白1和上皮蛋白2的氨基酸排列如图12所示。除半胱氨酸残基保留外，在上皮蛋白1和上皮蛋白2之间还保留着15种其它残基。
上皮蛋白1和上皮蛋白2的水疗法的图像如图13所示。上皮蛋白1的水疗法图像与上皮蛋白2的图象具有一些相似之处，尽管上皮蛋白2较上皮蛋白1表现出较强的亲水性。
上皮蛋白1和上皮蛋白2的生物学性质图14给出了通过不同浓度的纯化上皮蛋白1和上皮蛋白2的方法，125I-脱氧尿苷嵌入人表皮样癌A431细胞DNA的抑制作用。在12.8ng/井上皮蛋白1和450ng/井上皮蛋白2时可观察到50%DNA合成抑制作用。这样，在大约21nM上皮蛋白1浓度和大约0.75μm上皮蛋白2浓度时可发生50%抑制作用。因此，在此种测定中上皮蛋白1较上皮蛋白2的效力高大约36倍。
上皮蛋白对125I-脱氧尿苷嵌入不同肿瘤和非肿瘤人细胞系以及几种非人细胞系的DNA的效果进行调查。上皮蛋白1(20ng/ml，最大试验剂量)可轻度抑制人结肠癌细胞系HCT116的生长，而上皮蛋白2(270ng/ml，最大试验剂量)对这种细胞系不显示任何作用。两种蛋白质可大大地抑制125I-脱氧尿苷对貂肺CCL64细胞和猴肾COSI细胞的DNA的嵌入。在最大试验剂量下(上皮蛋白1 20ng/ml和上皮蛋白2 270ng/ml)无论对人纤维细胞还是几种其它的人肿瘤细胞蛋白质都不具有重要作用。
上皮蛋白1和上皮蛋白2各种不同浓度对125I-脱氧尿苷嵌入鼠
PCR cDNA克隆形成从上皮蛋白2的肽序列KTQCPDD和HCCPQDT为基准，合成两池退化的低聚核苷酸(在意义和反义定向作用下，池中分别含有256和128退化低聚核苷酸)。在带有单一链cDNA模板的40环PCR扩大中，这些低聚核苷酸用作引物，该模板是从用XSCT17已接触抗原的鼠肾RNA中衍生的，低聚核苷酸在其3′末端含T17轨道(Plowman等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.874905-08)。低聚核苷酸探针，以上皮蛋白2序列KYGCCPMP为基准(256倍退化23-mer)用[r-32P]ATP标记，并用于筛选检查PCR产物。
此探针与PCR产物的Southern印迹杂交，揭示出120个碱基对(bp)和600bp的两个主要带和一个325bp较小带。这些片段是亚克隆形成的并且是按顺序排列好的，从而揭示出它们都具有共同的5′-末端编码的上皮蛋白2。325bp片段具有一个开放读码(open reading frame)，以编码上皮蛋白1和2，而600bp带进一步延长3′，并含有另外的富集型主半胱氨酸的付本。因此，上皮蛋白1和2表现出被一前一后地排列单一转录产品(Single transcript)。这些相同的PCR引物被用来分离由人、牛、小鼠和鸡的cDNA的上皮蛋白前体的相似片段，而充分说明富集型主半胱氨酸进化守恒。
由鼠和小鼠和人的来源通过利用PCR原始记录分离具有已知的中央序列的5′和3′末端信息和通过用荧光镜检查λgt10程序库，可获得完整的上皮蛋白cDNA。特别是应用PCR对策，这种对策是定向在3′和5′方向的准确上皮蛋白引物并结合使用，退火到天致(图21A)。另外，由于一个鼠的cDNA克隆缺失234bp(表21A，氨基酸398-475)，维持读数结构的产生嵌合型主(Chimeric motif)，可能还存在上皮蛋白的异形体(isoform)。这种缺失可能是交替接缝的结果，因为它的界限精确划定到在小鼠上皮蛋白基因中的外显子-内含子(exon-intron)结合的位置。
上皮蛋白序列与常用的蛋白质和DNA序列数据库比较，揭示了与已知蛋白质同源性的三个区域。在上皮蛋白前体信息序列之后的第一个41氨基酸，含有6个半胱氨酸残基，这些残基排列的型式与另外7个半胱氨酸富集型主的N-末端相似。序列CPDGQFCPVACC完全保存在人、鼠和小鼠上皮蛋白之间，并与在蛇毒家族中存在的交感图像相符合(Dufton，1984，J.Mol.Evol. 20128-34)。同源性的第二个区域存在鼠上皮蛋白的三个半胱氨酸富集型主内(CCX2HX2C)，并且与包围的磷脂酶A2的活性位置的交感相符合(Gomez等，1989，J.Eur.J.Biochem.18623-33)。最后，延伸的同源物存在于上皮蛋白的12个半胱氨酸基型主和蕃茄硫醇蛋白酶的C-末端调节区之间(图21D)。已经假定此非催化区通过与重金属结合调节蛋白酶活性。在上皮蛋白前体中交替的半胱氨酸和组氨酸残基，使人联想起各种不同的蛋白质的金属结合区，尽管上皮蛋白的型主是与任何已知的金属结合交感不相符合。Northern分析说明2.3千碱基上皮蛋白的转录处处地被表达，并在成年人肾、胎盘、心脏、十二指肠、结肠和大脑皮质中占优势。另外，它存在于各种各样的上皮蛋白肿瘤细胞系中。Southern分析指出通过单链复制基因(single copy gene)对上皮蛋白前体进行编码。这些结果指明了由上皮蛋白前体产生活性分子后转录的机理。
在COS细胞中表达鼠上皮蛋白的生化性质在控制巨细胞病毒早期直接启动基因(immediat-early promotor)情况下，通过将其完整的编码序列嵌入到表达媒介物进行测定(Seed和Aruffo，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.843365-69)。特别是，含有完整鼠上皮蛋白编码序列的1.6kb片段被嵌入到以表达媒介物为基础的cDM8，生成表达媒介物crEPN1.6。由具有单链外显子(exon)缺失(single exon deletion)的上皮蛋白cDNA中通过1.35kb片段的嵌入制备相似结构的crEPN1.4，从而消除氨基酸398-475。分泌质粒、cβrEPN1和cβrEPN2构成是通过把存在于低聚核苷酸上的合成的猿TGF-β1信息序列M P P S G L R L L P L L5′AGCTTCTGCAGGGGCGGGGCCTCCCCC ATGCCGCCCTCCGGGCTGCGGCTGCTGCCGCTGCTG3′ AGACGTCCCCGCCCCGGAGGGGG TACGGCGGGAGGCCCGACGCCGACGACGGCGACGACL P L L W L L V L T P S R P A ACTACCGCTGCTGTGGCTACTGGTGCTGACGCCTAGCCGGCCGGCCGC 3′GATGGCGACGACACCGATGACCACGACTGCGGATCGGCCGGCCGG 5′以及PCR产生的含有上皮蛋白1和上皮蛋白2的编码序列的SacII-XbaI片段连结到用HindIII和XbaI消化了的cDM8SII质粒中。cDM8SII是修改的cDM8媒介物，其中唯一的SacII位置已经用Klenow消除。新的SacII位置放置在带上皮蛋白编码序列结构中的信息序列的最后甘氨酸。表达的质粒在活性MC1061/P3细菌中发育，并用DEAE-葡聚糖的方法插入COS-1细胞(Seed和Aruffo，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.843365-69)。转变感染48小时后，细胞用磷酸缓冲液盐水洗涤，并在补充了250μCi/ml35S-半胱氨酸(1100Ci/mmole，New England Nuclear)无MEM的血清(每100mm培养皿4ml)中标记16小时，标记的上清液对0.1N乙酸透析，干燥，并将1ml等同物经过10%或15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
瞬间表达的蛋白，通过35S-半胱氨酸标记的上清液的SDS-PAGE方法很容易地被检定。重组的蛋白质具有大约75K的分子量，可能是由于糖基化作用(glycosylation)(图26A，道1)，重组的蛋白略多于所预想的62K。而在C-末端区缺乏外显子(e×on)相似结构编码的上皮蛋白异形体以平均68KMr进行迁移，与缺失的78个氨基酸相称。没有前体被加工成较小形状结构的迹象。为了表达发育重组上皮蛋白1和上皮蛋白2，在合成的信息肽序列(分别是cβrEPN1和cβrEPN2)之后，将它们的编码区置于表达媒介物上，这是因为从COS细胞中的6K蛋白的分泌作用的结果(图26B)。与在模拟转变感染上所观察到的完整的单细胞层相比较，用这些结构转变感染的细胞抑制生长并表现出与显示印章戒指外貌的许多细胞的变化了的形态。cβrEPN1转变感染的上清液在Bio-Sil TSK-250柱(Shoyab等，1990，874905-09)部分被纯化，并将组份对A431细胞进行生长抑制活性(GIA)的测定。这些细胞分泌活性上皮蛋白1(大约25GIA单位/100mm培养皿)，而模拟转变感染细胞的上清液没有检测出活性(1GIA单位相当于50%细胞生长抑制作用需要的原料的量)。
上皮蛋白1对A431细胞有抑制作用，并对几种正常的上皮细胞系充当有丝分裂原(见上文)。另外，在变性的生长因子β存在下，上皮蛋白1能够诱导鼠肾纤维细胞固定一独立地生长(图17)。相反地，上皮蛋白2对纤维细胞的啮齿动物角质化的生长没有作用，并且在这两个系统中，上皮蛋白2反抗上皮蛋白1的有丝分裂原的作用(剂量依赖方式中)(图17)。未处理的上皮蛋白前体在任何这些测定中没有活性。可能与处理过的形状如螯合金属离子或蛋白酶和磷脂酶的调节相比，完整的前体起着完全不同的作用。
权利要求
1.人上皮蛋白(epithelin)前体，包含实质上在图22中大约氨基酸残基数1-593所描述的氨基酸序列。
2.人上皮蛋白1，包含实质上在图22中大约氨基酸残基数282-337所描述的氨基酸序列。
3.人上皮蛋白2，包含实质上在图22中大约氨基酸残基数206-262所描述的氨基酸序列。
4.人上皮蛋白，包含实质上在图22中大约氨基酸残基数59-114所描述的氨基酸序列。
5.人上皮蛋白，包含实质上在图22中大约氨基酸残基数124-180所描述的氨基酸序列。
6.人上皮蛋白，包含实质上在图22中大约氨基酸残基数364-418所描述的氨基酸序列。
7.人上皮蛋白，包含实质上在图22中大约氨基酸残基数442-497所描述的氨基酸序列。
8.人上皮蛋白，包含实质上在图22中大约氨基酸残基数519-574所描述的氨基酸序列。
9.核酸分子编码的人上皮蛋白前体，包含实质上在图22中大约核苷酸残基数41-1819所描述的核苷酸序列。
10.与权利要求9的核酸分子互补的反义核糖核酸分子。
11.鼠上皮蛋白前体，包含实质上在图18中大约氨基酸残基数1-589所描述的氨基酸序列。
12.鼠上皮蛋白1，包含实质上在图18中大约氨基酸残基数280-335所描述的氨基酸序列。
13.鼠上皮蛋白2，包含实质上在图18中大约氨基酸残基数205-261所描述的氨基酸序列。
14.鼠上皮蛋白，包含实质上在图18中大约氨基酸残基数59-114所描述的氨基酸序列。
15.鼠上皮蛋白，包含实质上在图18中大约氨基酸残基数123-179所描述的氨基酸序列。
16.鼠上皮蛋白，包含实质上在图18中大约氨基酸残基数362-416所描述的氨基酸序列。
17.鼠上皮蛋白，包含实质上在图18中大约氨基酸残基数440-495所描述的氨基酸序列。
18.鼠上皮蛋白，包含实质上在图18中大约氨基酸残基数515-570所描述的氨基酸序列。
19.核酸分子编码的鼠上皮蛋白前体，包含实质上图18中大约核苷酸残基数31-1797所描述的核苷酸序列。
20.根据权利要求19，核酸分子互补的反义核糖核酸分子。
21.小鼠上皮蛋白前体，包含实质上在图23中大约氨基酸残基数1-589所描述的氨基酸序列。
22.小鼠上皮蛋白1，包含实质上在图23中大约氨基酸残基数280-335所描述的氨基酸序列。
23.小鼠上皮蛋白2，包含实质上在图23中大约氨基酸残基数205-261所描述的氨基酸序列。
24.小鼠上皮蛋白，包含实质上在图23中大约氨基酸残基数59-114所描述的氨基酸序列。
25.小鼠上皮蛋白，包含实质上在图23中大约氨基酸残基数123-179所描述的氨基酸序列。
26.小鼠上皮蛋白，包含实质上在图23中大约氨基酸残基数362-416所描述的氨基酸序列。
27.小鼠上皮蛋白，包含实质上在图23中大约氨基酸残基数440-495所描述的氨基酸序列。
28.小鼠上皮蛋白，包含实质上在图23中大约氨基酸残基数515-570所描述的氨基酸序列。
29.核酸分子编码的小鼠上皮蛋白前体，包含实质上在图23中大约核苷酸残基数8-1774所描述的核苷酸序列。
30.根据权利要求29，核酸分子互补的反义核糖核酸分子。
31.多肽包含氨基酸序列X2CX5-6CX5CCX8CCX6CCXDX2HCCPX4CX5-6CX2其中C是半胱氨酸，D是天门冬氨酸，H是组氨酸，P是脯氨酸和X是任意的氨基酸。
32.含氨基酸序列多肽包含CX5-6CX5CCX8CCX6CCX5CCX5CCX5-6C其中C是半胱氨酸和X是任意的氨基酸。
33.含氨基酸序列多肽。包含CCX8CCX6CCX5CC其中C是半胱氨酸和X是任意的氨基酸。
34.抑制赘生细胞生长的方法，包括使细胞与对抑制赘生细胞生长有效的至少一种上皮蛋白接触。
35.根据权利要求34的方法，其中上皮蛋白是上皮蛋白1。
36.根据权利要求34的方法，其中上皮蛋白是上皮蛋白2。
全文摘要
本发明描述了鼠上皮蛋白前体和成熟形式的重组表达。纯化的上皮蛋白1是一种双重功能的生长调节剂，当抑制其它细胞类型生长时，能够刺激一些细胞类型的生长。在生长抑制剂生物活性方面纯化的上皮蛋白2与上皮蛋白1功能上相似，可是，相反地上皮蛋白2表面上不具有上皮蛋白1的引起生长刺激活性的特性，但事实上上皮蛋白2对抗这个上皮蛋白1的活性。
文档编号C12N15/18GK1058782SQ9110306
公开日1992年2月19日 申请日期1991年4月3日 优先权日1990年4月3日
发明者穆罕默德·索雅布, 格雷戈里·D·普洛曼 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司