Ag＠GO／PU／CA复合抑菌电纺纤维膜材料的制备的制作方法

本发明涉及到的是一种基于静电纺丝技术的嫁接用电纺纤维膜材料的制备技术，属于静电纺丝纤维材料用于植物愈伤领域。

背景技术

嫁接是植物无性繁殖中的一项重要技术，植物嫁接在我国已有三千多年的历史。然而植物的嫁接成活率并不高。

现如今提高嫁接的存活率主要通过以下三个方面来实现：1)防止伤口的细菌感染；2)嫁接时浸渍植物激素以加快伤口愈合；3)科学的后期管理。在减少细菌感染方面，主要就是通过前期的灭菌处理，但是这样也不能保证在其后近半个月的愈合过程中不再被细菌、病毒等感染，一旦感染也就前功尽弃。现如今嫁接多采用植物激素来提高植物嫁接的存活率，主要是通过在嫁接前将嫁接苗浸泡在培养液中的“一次浸泡法”，虽说这在一定程度上提高嫁接的存活率(部分嫁接存活率达到90％)，但是这样的方法激素无法保证持久的供应，而且低浓度的生长素有促进器官伸长的作用，然而随着蒸腾失水，超过最适浓度时，导致乙烯产生，使得促进生长的作用下降，甚至产生抑制作用。这样的方式在加速愈合上就可能出现一些明显的弊端，而且与嫁接过程中的愈合过程对激素的需求在一定程度上也不匹配，伤口在愈合过程中对激素尤其是生长素在第三阶段有一个需求上的小高峰，但是“一次浸泡法”就无法做到有效的长期的外源激素供给。

因此，开发一种对生长因子可控释放且具有长效抑菌性能的新型膜材料对于提高植物嫁接成活率有着显著的实际意义。

近期，氧化石墨烯(go)成为药物缓释和抗菌的热门材料。现有研究认为氧化石墨烯的抗菌机理主要有以下几个作用：1)对卵磷脂的提取，2)对细胞膜的穿刺，3)对细胞膜的吸附和4)产生活性氧。氧化石墨烯的抗菌机理使得该材料在使用过程中不产生任何灭菌生物剂，并且能够实现长效抗菌。研究表明，通过将氧化石墨烯和银纳米颗粒进行复合，出现的协同效应能够显著提升氧化石墨烯的抗菌性能。同时适宜的尺寸、特殊的形貌和合理的用量也对复合材料的抗菌性能有明显的提高作用。此外，氧化石墨烯表面含氧官能团丰富，极易与含极性基团的聚合物产生强的分子间作用力，故而，氧化石墨烯也常被当做纳米材料添加到聚合物中来增强聚合物的物理性能。

聚氨酯(pu)又名聚氨酯甲酸酯，由于聚氨酯弹性体在分子链结构上属于(ab)型嵌段共聚物，由柔性软段和刚性硬段组成，这种独特的结构赋予了pu优异的力学强度。同时，由于其良好的生物相容性被广泛应用于生物材料领域。生物相容性良好且可降解性的醋酸纤维素(ca)，因其具有无毒，价格低廉，生物相容性好等优点，使其具有广泛的应用。

综上所述，ca具有良好的生物相容性，但纤维的机械性能不够好且不耐磨。pu不仅具有优异的力学强度，还具有良好的柔韧性、拉伸性、耐磨耐疲劳等特性，通过掺杂pu可以增强ca膜的机械性能，克服其不耐磨等缺点，通过确定ca与pu喷头比例以及go的含量可以得到优异机械性能、生物相容性与超强抑菌性能的多功能复合膜。

技术实现要素：

本发明提出的是一种多功能嫁接用静电纺丝纤维膜材料的制备方法，通过同轴静电纺丝方法制备高力学强度、透气、强抑菌、生长因子可控释放的促愈合生长的芯-壳结构多功能电纺纤维膜。通过调节制备和功能化的参数，1)制备ag@go溶液，选取合适浓度的氧化石墨烯与硝酸银溶液，具体表现为：配制go/dmf溶液(go含量0.00％-0.08％wt；)，agno3/乙醇溶液(agno3含量0.8％-1.5％wt)，将其置于20w紫外灯下照射，制备得到ag@go的dmf溶液；2)通过同轴静电纺丝法制备高力学强度微纳米电纺纤维膜，将pu/ca加入到ag@go的dmf溶液，其中壳层溶液浓度为12％-15％(wt/v)，芯层溶液浓度为8％-12％(wt/v)；芯部进样速度为：0.4-0.6ml/h，壳部速度为：0.8-1ml/h；静电纺丝电压为15-17kv，注射器针头与接收器之间的接收距为8-10cm，进而得到强抑菌性的ag@go复合电纺纤维膜；3)加入合适浓度的生长素，具体表现为：加0％-0.2％的生长因子，溶解在电纺丝溶液中，进而得到可促进生长和长效抑菌性能的电纺纤维膜；实现纤维膜生长因子的释放与嫁接愈伤对生长因子的需求相匹配(释放周期在5-50天内可控)，并减少伤口细菌感染，提高植物嫁接成活率。研究结果表明，该发明制备的材料可以有效的抑制植物嫁接伤口的细菌感染，并促进伤口的愈合。

本发明的技术解决方案：多功能嫁接用静电纺丝纤维膜材料的制备，其特征是找出电纺膜的形貌、结构、组成等与ag@go抑菌性能之间的依赖关系。

其制备方法，包括如下步骤：

1)ag@go溶液的制备：选取合适浓度的氧化石墨烯与硝酸银溶液，配制go/dmf溶液(go含量0.00％-0.08％wt；)，agno3/乙醇溶液(agno3含量0.8％-1.5％wt)，将其置于20w紫外灯下照射，制备得到ag@go的dmf溶液；

2)强抑菌性高力学强度同轴电纺纤维膜的制备：选用生物基高分子材料乙基纤维素(ec)、聚氨酯(pu)作为药物的载体，加入制备得到ag@go的dmf溶液，采用同轴静电纺丝法，其中壳层溶液浓度为12％-15％(wt/v)，芯层溶液浓度为8％-12％(wt/v)，go含量0.00％-0.08％wt，芯部速度为：0.4-0.6ml/h，壳部速度为：0.8-1ml/h，静电纺丝电压为15-17kv，注射器针头与接收器之间的接收距为8-10cm；

3)电纺纤维膜促进生长性能的构建：包裹加入植物生长因子对电纺膜进行促生长“功能化”构建，具体表现为：0％-0.2％的生长因子；

本发明的优点：

相较于传统的塑料薄膜，本发明的多功能嫁接用强抑菌性静电纺丝纤维膜材料具有以下优势：

1)由于纳米电纺纤维膜的多孔特性而具有良好的透气性，有效解决了传统塑料薄膜透气性差的问题；

2)生物可相容电纺纤维膜能较好被嫁接处的伤口粘附，促进伤口愈合，且无并发症；

3)电纺纤维膜不透光，可以为嫁接愈伤创造黑暗的环境，加速愈合；

4)通过同轴静电纺丝技术，以聚氨酯(pu)为芯，所制备的高弹性电纺膜，对提升嫁接膜的性能有很大的提高；

5)通过调节原料配比，和电纺参数，可以实现纤维尺寸的可调节，进而可以调节生长因子的释放性能，最终达到电纺膜释放周期与植物嫁接伤口愈合期间所需生长因子量相适应的目的；

6)通过ag与go的复合，不仅实现了药物的长效控释，又提高了力学强度，还达到了长效抑菌。

具体实施方式：

对照图1，ag@go/pu/ca抑菌复合电纺纤维膜材料的制备，其制备方法是基于同轴静电纺丝技术，其中芯部是聚氨酯(pu)，壳部是醋酸纤维素(ca)；其中壳部与go/agno3溶液混合并加入功能化物质生长素，分别装载在两个注射器中，开两个推进泵控制推进速度，同轴电纺的针头连接高电压，作为接受的飞轮连接负压，并以一定速度进行旋转，最终得到同轴纤维膜，并将其应用于植物嫁接伤口的长效抑菌，提高嫁接存活率以及加快植物伤口愈合。

其制备方法，包括：

1)摸索go与agno3溶液的合适浓度，并将go/agno3溶液制置于20w紫外灯下照射，制备得到ag@go溶液；

2)摸索同轴静电纺丝溶液的浓度和溶剂得到合适的单纺条件；

3)基于单轴电纺，摸索同轴静电纺丝的电纺参数，得到合适的同轴电纺参数；

4)在壳部溶液中加入合适浓度的生长素(6-ba)进行功能化；

5)对所得到的膜材料进行控释性能，力学性能、抑菌性和电镜表征；

6)将其应用于促进植物伤口愈合；

选取合适的溶剂，以醋酸纤维素(ca)和聚氨酯(pu)作为药物的载体，采用同轴静电纺丝法并通过调节聚合物浓度、进样速率、电导率、纺丝电压和温、湿度等，制备得到均一稳定、纤维直径可控的芯-壳结构微纳纤维，并用飞轮进行取向收集。采用扫描电子显微镜和扫描孔隙率分析仪对所得电纺纤维膜进行形貌和尺寸表征，并测试其断裂伸长率和力学强度。

抑菌试验，通过测试材料的抑菌圈量化其抑菌性能，得出具有最高效能的配比，其具体操作步骤如下：

1)将所需的实验用品放入到超净台中，开启紫外灯照射15min，然后关闭紫外灯并通风。同时在电热炉上加热融化固体培养基至完全溶解。稍加冷却后放入超净台，开始试验。

2)点燃酒精灯，使附近成为无菌区。然后在灯焰附近打开固体培养基的封口膜，进行倒平板，每个培养皿内倒入约20ml的培养基。之后放置待其凝固。

3)稀释菌液，首先在准备的两个试管中各加入2ml液体培养基，用酒精灯烧红挑菌环后待其冷却并从斜面培养基中挑取少许菌，然后加入到试管1中，吹气泡混合均匀，取出0.5ml加入到试管2中，吹气泡混合均匀。这样试管2的菌液相对于试管1来说菌液稀释了5倍。然后，从试管1和试管2中各取出0.5ml混合液加入到培养皿中，用灭菌后的涂布棒将菌液均匀的涂布在培养基上。

4)将事先准备好的4个质量分数的复合膜圆片和未加agno3的对照组按顺序放在培养皿上，并轻轻按压使其紧密贴合在表面。

5)将培养皿放置在恒温培养箱中培养24h。

6)通过尺子测定抑菌圈大小测试在不同条件下制备的电纺膜的药物释放性能，得到具备最佳抑菌和释放性能的兼具避光透气的功能电纺膜。

将电纺纤维膜用于植物愈伤增值和单细胞实验，将纤维膜裁剪成2*2cm规格的方形，对膜进行8h的紫外灭菌处理，选用杂交鹅掌楸幼胚愈伤组织作为测试对象，以1/2ms为基本培养基，附加浓度为0.5mg/l的2，4-d。在超净台中，将愈伤放置在纤维膜表面，分别进行三组平行实验，20℃暗箱培养。

如图5所示，通过对照实验发现，在添加了6-ba的ag/pu/ca混纺纤维膜上(p-c-g-0)的愈伤组织显示愈伤生长状态良好，说明通过加入6-ba的纤维膜具有促进愈伤增殖的作用，且ag的加入对增殖没有产生影响。随着go含量的增加，样品p-c-g-2和p-c-g-4均显示良好的促进增殖状态，愈伤和单细胞都显示良好的生长状态。但是随着加入量达到0.06％以上，愈伤生长状态变差，在0.08％时出现褐化现象，这可能是由于go的穿刺效应的结果。结果表明ag@go/pu/ca复合电纺纤维膜在go含量较低时具有促进愈伤增殖的作用，且效果明显，但是当含量高于0.06％时，愈伤增殖受限。

附图说明

图1是静电纺丝纤维膜材料的制备的示意图；

图2是罗丹明-b模拟药物的缓释曲线图；

图3力学性能对比图；

图4是ag@go复合电纺膜抑菌圈图；

图5是纤维膜材料用于植物愈伤的毒性和增殖性能评价。