用于氧化有色物质的芽孢杆菌属细菌多酚氧化酶的制作方法

专利名称：用于氧化有色物质的芽孢杆菌属细菌多酚氧化酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及细菌多酚氧化酶，产生该酶的方法，产生该酶的细菌菌株以及利用该酶的方法。更具体地说，本发明提供了多酚氧化酶的新酶源，所说的氧化酶用于有色物质的氧化以及包含多元酚的物质的氧化，也用于洗涤。
现有技术作为氧化多元酚的多酚氧化酶和漆酶是众所周知的。在多元酚氧化酶的利用上人们已进行了各种研究。例如，WO 94-29510报道了在纸和纸浆领域中的去木质作用(delignination)；WO 91-05839,EP 91610032,DE4008894和JP-A 64-60693报道了在洗衣房洗涤方面的酶漂白用途。
然而，唯一已知的多酚氧化酶和漆酶的微生物来源是诸如担子菌纲和半知菌纲的霉菌真菌，通常难以培养大量的这样真菌，此外，培养期间的细胞生长速率也不高。对这些真菌来说，通过突变或者利用遗传工程技术提高酶产量比细菌更困难，因为真菌有复杂的生命周期，并且有包含内含子的复杂基因结构，等等。由于这些原因，人们难以从这样的真菌中稳定地和廉价地获得大量的多酚氧化酶，需要细菌产生的多酚氧化酶以便于将它们运用于实际应用中。
本发明的目就是提供由细菌产生的多酚氧化酶、产生酶的细菌和酶的用途，因而提供了多酚氧化酶的新酶源，该多酚氧化酶用于有色物质的氧化和含有多元酚的物质的氧化，也用于洗涤。
发明的说明我们，本发明人刻苦地研究了能胞外产生催化多元酚物质氧化的酶的各种细菌。尽管困难重重，我们对这些产物的研究终于得到了如下事实的发现属于芽孢杆菌属的细菌能够胞外产生所需的酶。基于这一发现，我们完成了本发明。
因此，本发明提供了下列材料和方法一种得自细菌的多酚氧化酶。
一种用于氧化酚化合物、包含芳香化合物的烷氧基、卤化酚化合物或者芳香胺化合物的方法，该方法包括在有氧存在条件下用上述多酚氧化酶处理上述化合物。
一种用于漂白有色物质的方法，该方法包括在有氧存在条件下用上述多酚氧化酶处理有色物质。
一种当多种织物在洗涤液中一起洗涤时，用于抑制纺织品染料从染色织物转移至另一织物上的方法，该方法包括在有氧存在条件下用上述多酚氧化酶处理上述洗涤液。
一种用于漂白有色废水的方法，该方法包括在有氧存在条件下用上述多酚氧化酶处理有色废水。
一种用于灭活微生物或者病毒的方法，该方法包括在有氧存在条件下用上述多酚氧化酶处理微生物或者病毒。
一种用于漂白包含木质素的材料的方法，该方法包括在有氧存在条件下用上述多酚氧化酶处理包含木质素的材料。
一种包含上述多酚氧化酶的去污剂组合物。
一种用于产生多酚氧化酶的方法，该方法包括在合适的营养培养基中培养芽孢杆菌属细菌产生的多酚氧化酶，而后回收上述多酚氧化酶。
产生多酚氧化酶的地衣芽孢杆菌菌株SD3003(FERM P-15383)。
下面将详细地描述本发明。发明详细描述产生酶的细菌按照本发明，多酚氧化酶得自细菌菌株，优选得自芽孢杆菌属菌株。具有产生多酚氧化酶的能力的任一或每一芽孢杆菌属菌株都能在本文中使用以获得本发明的多酚氧化酶，并且对用于本发明的细菌没有任何其它具体限制。本发明所使用的产生酶的细菌包括例如那些嗜碱芽孢杆菌、液解化淀粉杆菌、短芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等等。一些优选的种是地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和球形芽孢杆菌，具体地说是地衣芽孢杆菌。一些优选菌株是Bacillus sp.NCIB 10314，地衣芽孢杆菌NCIB 8059、NCIB8061、ATCC 6634、ATCC 9945a、ATCC 11945和SD3003，纳豆芽孢杆菌SN AKU 0205和球形芽孢杆菌IFO 3341。
菌株NCIB 10314、NCTB 8059和NCIB 8061可从国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB，以前称为NCIB)(英国，苏格兰，AberdeenAB21RY,23 St.Machar Drive)自由获取。
菌株地衣芽孢杆菌ATCC 6634、ATCC 9945a和ATCC 11945可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)(美国，马里兰20852,Rockville,12301Parklawn Drive)自由获取。
菌株纳豆芽孢杆菌SN AKU 0205可从京都大学(日本，京都)农学院的培养物保藏中心自由获取。
菌株球形芽孢杆菌IFO 3341可从发酵研究所(IFO)(日本，大阪532,Yodogawa-ku,17-85 Juso-honmachi 2-chome)自由获取。
菌株地衣芽孢杆菌SD3003于1995年12月28日以P-15383保藏号保藏在国际贸易和工业部的国立生命科学和人体技术研究所(日本，ISaraki-ken 305,Tsukuba-shi,1-3 Higashil-chome)。其后保藏物于1997年1月28日转变为按照布达佩斯条约的国际保藏，保藏号为FERM BP-5801。上述保藏物由日本的Showa Denko K.K.产生，然后分配到Novo NordiskA/S。按照本发明，从代表菌株的形态学观察和生理学试验中发现下列结果
(*)通过HPLC测得。
从上述结果并参照Williams和Wilkins的“伯杰氏系统细菌学手册”第二卷(1986)和美国农业部的“芽孢杆菌属”(1973)，将这一菌株分类为地衣芽孢杆菌SD3003。酶的制备通过培养属于芽孢杆菌属菌株(如本文上述的菌株或者其突变种)的细胞可以获得本发明的多酚氧化酶。此外，它也可以通过培养这样菌株(由遗传工程制备)的转化体获得。例如，在所需多酚氧化酶能够得到表达的条件下培养宿主细胞并从这样培养的转化细胞的培养物中收集如此表达的多酚氧化酶，其中所说的宿主细胞是用表达载体转化的宿主细胞(所说的表达载体是通过将编码本发明的多酚氧化酶的DNA以及合适的启动子、操纵子和终止子DNA(其功能是使上述编码酶的DNA在宿主有机体中表达上述酶)插入到具有复制起点(所说载体在宿主有机体中的复制起始于该点)的DNA载体中制备的)，或者是通过用宿主细胞的DNA以及合适的启动子、操纵子和终止子DNA(其功能是使上述编码酶的DNA在宿主有机体中表达上述酶)整合编码本发明的多酚氧化酶的DNA转化的宿主细胞。
为了获得编码本发明的多酚氧化酶的DNA片段，任一普通的方法都可利用。例如，cDNA或者基因组文库(从上文提及的菌株中提取)都可以用作DNA源。当利用寡核苷酸(基于所需酶(本发明的多酚氧化酶)的氨基酸序列或者基于已知多酚氧化酶的氨基酸序列合成)作为探针时，可特异性地鉴定所需的DNA片段。除这些以外，可选择表达酶促活性的克隆，或者选择能够产生与抗酶本发明的多酚氧化酶的抗体进行反应的蛋白质的克隆。
通过在常规的合成培养基或者营养培养基(包含有机碳源和有机氮源)上培养产生酶的细胞，可以获得本发明的多酚氧化酶。需要在培养基中加入0.001mM-10mM浓度的Cu+2离子金属盐，优选浓度为0.01mM-1mM。也需要在培养基中加入0.001mM-100mM浓度的Mn+2离子金属盐，优选浓度为0.01mM-10mM。培养温度可以为20-60℃，优选为30-55℃。适当的培养时间可以是20-200小时，优选为40-150小时。
可以用任何普通的方法回收细胞分泌的多酚氧化酶。回收上述酶的方法可以包含一系列通过离心、过滤或者膜分离从培养基中分离细胞的步骤，其后通过如离子交换色谱或诸如此类的色谱法纯化上述酶。利用超滤膜的浓缩也是回收酶的有效方法。此外，通过用铵硫酸盐的盐析或诸如此类的方法来分离和浓缩上述酶也是可行的。酶的性质本发明的多酚氧化酶优选有一个或多个下列性质最适反应pH大约为7，最适反应温度为60℃-80℃之间，以及大约51,000的分子量(由GFC测定)。
本发明的多酚氧化酶的一个典型例子是得自地衣芽孢杆菌SD3003的酶，该酶在5-9的pH范围之内(而优选为6-8，更优选为大约7)催化氧化(参见

图1)。因此，该酶的特征在于它在中性pH范围内催化氧化。用于酶反应的最适温度可以是60-80℃(参见图2)。在pH 7条件下在不同的预定温度下热处理30分钟之后，活性显示出几乎100％(70℃)的剩余活性(图3)。酶在30℃下在不同pH值的缓冲液中处理30分钟之后，它的活性在宽pH范围内仍然保持稳定(参见图4)。这些结果确保酶的稳定活性以便在宽pH范围(覆盖弱酸性至弱碱性)的各种溶液中在低温培养基上催化氧化反应。通过GFC分析发现上述酶的分子量大约为51,000。
本发明的多酚氧化酶可以与在酸性pH时有最适反应pH的任一普通酶结合起来使用。在酸性范围内有最适反应pH的常规多酚氧化酶和本发明的多酚氧化酶的结合有可能影响在宽pH范围之内(覆盖酸性至弱碱性条件)的多酚氧化酶反应。对于用于所需目的的这些酶的结合来说，多酚氧化酶的活性量的比率(普通酶在酸性pH值下的最大活性与同前者相混合的本发明的多酚氧化酶的最大活性的比值)可以优选为1/10-10/1，更优选为1/3-3/1(在活性或者蛋白质酶基底上)。为了在这样一个宽pH范围之内实现多酚氧化酶反应，本发明的多酚氧化酶是有用的。测定酶活性的方法为了在本发明中测定多酚氧化酶，我们使酶与20 ppm的丁香醛连氮在包含100mM Bis-Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)(Bis-Tris可从Dotite试剂公司)的水溶液中在20℃下进行反应，并测定所产生的反应混合物在525nm的吸光度。本文将每分钟氧化1nmol丁香醛连氮的酶活性量定义为1个毫单位(munit)(下文称作mU)。在包含多元酚的底物的处理中，一般以10-500mU/ml的浓度利用本发明的多酚氧化酶。酶用于漂白本发明的多酚氧化酶用于氧化各种底物(具体地说是酚化合物)，并且用于在有氧存在条件下漂白各种有色物质。因而发现本发明的多酚氧化酶可应用于溶液中的有色漂白。
也发现本发明的多酚氧化酶可应用于抑制染料转移，例如用于处理有色纺织品(参照例如WO 92/18687)或者用于洗衣期间(比较，例如WO91/05839)。因此，本发明的多酚氧化酶可以用于抑制纺织品染料从一有色织物转移至另一织物上(当上述织物在同一洗涤液一起洗涤时)，其方法包含在附加的可氧化的底物存在的条件下(可选择的)，用本发明的多酚氧化酶处理洗涤液。纺织染料可以是如偶氮染料的合成染料、或者是天然或者与天然完全相同的染料。
本发明的多酚氧化酶用于洗涤和漂白的领域。因此，本发明提供了得自细菌的酶在上述领域中的用途。多酚氧化酶在漂白方面的用途已在，例如WO 91-05839,DE 4008894和JP-A 64-60693中公开。
目前，过氧化氢的氧化漂白广泛用于清洗和洗涤中。然而，氧化氢的漂白活性在60℃或者更低的低温下并不令人满意。为了解决这一问题，人们将过氧化氢与过酸前体一同结合使用。然而，结合使用的漂白活性在40℃或者更低的温度下仍然不令人满意。因此，需要更有效的漂白系统。
本发明的多酚氧化酶可以与一种或多种常规氧化剂(其迄今已用于氧化漂白，如空气、氧、臭氧、过氧化氢、过氧化氢前体、过酸前体以及过酸)结合，由此以酶促进氧化漂白。因此，本发明的酶可以与任一常规氧化剂有效地结合，从而提高它的氧化和漂白活性。
本发明的多酚氧化酶可以与一种或多种具有过氧化物酶活性的物质(如过氧化物酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶等等)结合，由此促进这些酶的氧化漂白。
在上述氧化剂中，过氧化氢前体溶解在水中以产生过氢氧根离子。这些物质包括例如一水合或者四水合过硼酸盐、过碳酸盐、过硼酸钠、过焦磷酸钠、过苯甲酸、尿素-过氧化氢反应产物、三聚氰胺-过氧化氢反应产物、柠檬酸过氧化氢合物等等，在这些物质中，特别优选的是过硼酸盐碳酸盐和过碳酸盐。作为过氧化氢前体，也可能使用产生过氧化氢的系统(包含氧化酶和酶底物)。该类型氧化酶的例子包括葡萄糖氧化酶、醇氧化酶、甘油氧化酶、胺氧化酶、氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、芳基醇氧化酶、醛氧化酶、半乳糖氧化酶、山梨糖氧化酶、尿酸(ureate)氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶等等，在这些氧化酶中，特别优选的是葡萄糖氧化酶和醇氧化酶。
用于本发明的过酸前体是包含活性酰基的有机化合物、羧酸盐、羧酸酐、醋酸盐等等，这些过酸前体包括例如TAED(四乙酰乙二胺)、TAMD(四乙酰甲二胺)、TAGU(四乙酰甘脲)、DADHT(二乙酰二氧代六氢化三嗪)、SNOBS(壬酰羟苯磺酸钠)、ISONOBS(异壬酰羟苯磺酸钠)、丁二酸酐、苯甲酸酐、邻苯二甲酸酐、FAG(葡糖五乙酸盐)以及木糖四乙酸盐。在这些过酸前体中，优选的是TAED和SNOBS。
用于本发明的过酸包括例如DPDDA(二过十二烷二酸)、二过异间苯二甲酸、单过邻苯二甲酸镁六水合物以及NAPPA(壬酰氨基过己二酸)。
对用作漂白组合物的本发明的多酚氧化酶的用途来说，在洗涤和/或漂洗过程开始或期间加入另一种可氧化的底物(相对于本发明的多酚氧化酶)可以提高所使用的多酚氧化酶的漂白效果。附加的可氧化的底物这样的可氧化的底物的例子是诸如酚化合物的有机化合物，例如P-羟苯磺酸盐。可以用于本目的的其它酚化合物的例子是那些在有关文献(M.Kato和S.Shimizu，植物细胞生理学，25(7),1985,pp.1291-1301(具体参照表1)或者B.C.Saunders等，过氧化物酶，伦敦，1964,P.141以下页码)中给出的化合物。
在WO 94/12621中，揭示其它类型增强剂可以用于本目的，例如吩噻嗪或者吩恶嗪或其衍生物，诸如10-甲基吩噻嗪、10-吩噻嗪-丙酸、N-羟丁二酰亚胺-10-吩噻嗪-丙酸盐、10-乙基-4-吩噻嗪-羧酸、10-乙基吩噻嗪、10-丙基吩噻嗪，10-异丙基吩噻嗪、甲基-10-吩噻嗪丙酸盐、10-苯基吩噻嗪、10-丙烯基吩噻嗪、10-(3-(4-甲基-1-哌嗪)丙基)吩噻嗪、10-(2-吡咯烷乙基)酚噻嗪、丙嗪、2-氯-10-甲基吩噻嗪、2-乙酰-10-甲基吩噻嗪或者10-甲基吩噻嗪。
在WO 96/13079中，揭示另一组增强剂可以用于本目的，例如乙酰丁香酮、丁香醛、甲基丁香酯或者丁香酸。
在0.1-100μM的洗涤液中，可氧化的底物的量与浓度相对应。去污剂组合物本发明的多酚氧化酶可以与各种去污剂、清洁剂或者表面活性剂一起用于洗涤。该酶与任一这样物质的结合提供了包含本发明的多酚氧化酶的清洁剂组合物或者去污剂组合物。本发明酶可以结合入其中的清洁剂和去污剂的典型例子是包含10-50％(相对于组合物重量的重量百分比)表面活性剂、0-50％(重量百分比)助洗剂、1-50％(重量百分比)碱化剂或者无机电解质、0.1-10％(重量百分比)至少一种选自特定组(由再污染抑制剂、酶、漂白剂、荧光染料、粘结抑制剂和抗氧化剂组成)中的组分的清洁剂组合物和去污剂组合物。
表面活性剂可以是那些通常添加至清洁剂和去污剂中的任一表面活性剂(诸如肥皂)，并且包括，例如脂族硫酸盐(诸如直链或者支链烷基或烯基硫酸盐类，酰胺硫酸盐类，有一个或多个环氧乙烷、氧化丙烯和环氧丁烷组分添加于其中的直链或者支链烷基或烯基醚硫酸盐类)、脂族磺酸盐(诸如烷基磺酸盐类，酰胺磺酸盐类，二烷基磺基丁二酸盐类，各种具有α-烯烃、亚乙烯基型烯烃或内烯烃的磺酸盐类)、芳族磺酸盐(诸如直链或者支链烷基苯磺酸盐类)、直链或者支链烷基或烯基醚羧酸盐类(有一个或多个环氧乙烷、氧化丙烯和环氧丁烷组分添加于其中)、磺基脂肪酸盐类或酯类、氨基酸型表面活性剂、磷酸盐型表面活性剂(诸如酸性烷基或者烯基磷酸盐、烷基或者烯基磷酸盐类)、磺酸盐型两性表面活性剂、甜菜碱型两性表面活性剂、直链或者支链烷基或烯基醚类或醇类(有一个或多个环氧乙烷、氧化丙烯和环氧丁烷组分添加于其中)、聚氧化乙烯烷基或者烯基苯基醚类(其中烷基或者烯基组分可以是直链或者支链的，同时有一个或多个环氧乙烷、氧化丙烯和环氧丁烷组分添加于其中)、高级脂肪酸链烷醇酰胺或其烯化氧加合物、蔗糖脂肪酸酯、具有甘油的脂肪酸单酯、四烷基铵表面活性剂等等。阴离子表面活性剂的反荷离子优选钠离子或者钾离子。可以单独或者结合使用这些表面活性剂。
助洗剂、碱化剂以及无机电解质包括，例如磷酸盐(诸如正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐、偏磷酸盐、六偏磷酸盐、肌醇六磷酸盐)、膦酸(诸如乙烷-1,1-二膦酸及其衍生物、乙羟基-1,1,2-三膦酸、乙烷-1,2-二羧基-1,2-二膦酸、乙羟基膦酸)的盐类、膦酰基羧酸(诸如2-膦酰基丁烷-1,2-二羧酸、1-膦酰基丁烷-2,3,4-三羧酸、α-甲基膦酰基丁二酸)的盐类、氨基酸(诸如天门冬氨酸、谷氨酸)的盐类、氨基多乙酸盐(诸如亚硝基三乙酸盐、乙二胺-四乙酸盐、二亚乙基三胺-五乙酸盐)、聚电解质(诸如聚丙烯酸、聚顺丁烯二酸、顺丁烯二酸酐共聚物、羧甲基纤维素的盐类)、未离解聚合物(诸如聚乙二醇、聚乙烯醇)、羧甲基化产物(由二羟基乙酸、氧联二丁二酸、羧甲基羟丁二酸、葡糖酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、蔗糖、乳糖或诸如此类羧甲基化产生)、季戊四醇的羧甲基化产物、葡糖酸羧甲基化产物、有机酸(诸如苯多甲酸、草酸、苹果酸、氧联二丁二酸、葡糖酸)的盐类、硅铝酸盐(诸如沸石)、无机酸的盐类(例如碱金属碳酸盐类、倍半碳酸盐、硫酸盐、硅酸盐或诸如此类)、有机物质(如淀粉、尿素)、无机物质(如氯化钠、皂土)、以及甚至有机碱化剂(如三乙醇胺、二乙醇胺、一乙醇胺、三异丙醇胺)。
正如上文所论及的，本发明的去污剂组合物包含表面活性剂以及本发明的多酚氧化酶作为组成成分。如果需要，它还可以包含两性表面活性剂、漂白剂(如过硼酸盐、过碳酸盐、染料)、助洗剂、再污染抑制剂(如聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素)、粘结抑制剂、抗氧化剂以及各种酶(如除本发明酶之外的其它氧化酶、过氧化酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶)之任一物质。
为了把酶结合入本发明的去污剂组合物，可以使用任何方法。优选地，将酶加至溶液形式或者无粉尘粒状的去污剂组合物。例如，通过静态成粒、挤压成粒、流化床成粒、利用流化床的离心成粒等等，可以制得无粉尘粒状物。然而，添加至去污剂组合物中的酶的形状不应该限制于按照上述方法成形的形状。纸和纸浆的处理因此，本发明的多酚氧化酶可以用于漂白包含木质素的材料的方法中，具体地说，就是在纸生产中漂白纸浆，该方法包括在有氧存在条件下用多酚氧化酶酶处理木质素或者包含木质素的材料。
就纸浆生产中的去木质作用和漂白目的来说，在任一所需制浆步骤，本发明之任一细菌菌株均可接种到纸浆材料中，由此在该步骤期间产生本发明的多酚氧化酶；或者本发明酶可以直接加至木片或者粗打纸浆中。如此，则本发明酶有效地用于生物制浆和生物漂白领域。
用于产生纸的纸浆的漂白可以用与SE 88/0673和US 4,690,895相类似的方法完成。可选择地，如上所述，在附加的可氧化的底物存在的条件下可以完成上述处理。废水处理也发现本发明的多酚氧化酶可以用于处理废水，例如产生于化学或药物工业、染料制造、染色工厂、纺织工业或者纸浆生产的废水(参照，例如US4,623,465或者JP-A-2-31887)。因此，本发明提供了废水(产生于染料制造、染色工厂、纺织工业或者制浆)处理的方法，该方法包括在有氧存在条件下用多酚氧化酶处理上述废水。
本发明的多酚氧化酶用于处理包含天然物质和人工物质(在它们的结构组分中含有多元酚)的排水。本发明的多酚氧化酶作用于这一类型的天然物质，如类黄酮、不吨酮、三聚氰胺和其它植物染料以及木质素。此外，多酚氧化酶也作用于各种有毒AOX底物，如二氯苯酚、三氯苯酚等等。
可选择地，如上所述，在附加的可氧化的底物存在的条件下可以完成上述处理。酶的其它工业用途此外，还发现本发明的多酚氧化酶可用于木质素修饰，例如用于刨花板生产中。用于生产木制复合材料(如纤维板和刨花板)的粘结剂可以由经多酚氧化酶处理的木质素产生(参照US 4,432,921)。因此，本发明提供了用于木质素(或包含木质素的材料)的酶促聚合和/或修饰的方法，该方法包括在氧存在时用多酚氧化酶处理木质素或包含木质素的材料。
此外，本发明的多酚氧化酶可以用于生物传感器，该生物传感器反映酶的特征因而可用于在水溶液或者有机溶剂中(pH值落在弱酸性至弱碱性范围)监测各种芳香化合物。
此外，由于本发明的多酚氧化酶产生活性苯氧基，因此它可以用于在弱酸性至弱碱性pH范围之内有效地灭活微生物和病毒。也就是说，除本发明的多酚氧化酶本身对底物的杀微生物活性之外，当酶促产生这样的活性苯氧基时该酶可以显示出更强的杀微生物活性。此外，甚至当由酶杀微生物地处理上述物质时，那么此时本发明的多酚氧化酶将与人体接触或者为人体所摄取，或者甚至当它们在大气中释放时，它们是安全的，因为在由酶氧化之后这些物质已转化成具有很小毒性的安全物质。因此，本发明酶十分有用，因为在任何所需阶段均显示出它的杀微生物活性而把由它处理的物质转化成无毒性和安全的物质。
此外，本发明的多酚氧化酶也用于聚合物产生中，其中利用了得自该酶的苯氧基和醌。
此外，当本发明的多酚氧化酶用来氧化包含易氧化的多元酚(如儿茶酚)的物质时，该多酚氧化酶实现了多元酚的自氧化和酶促及催化氧化的两种氧化。因此，用于这一目的的本发明的多酚氧化酶对于使上述物质达到充分氧化来说是十分有效的。
实施例现在，以下论述本发明的一些典型例子，这些例子更具体地展示了本发明。然而，这些例子仅仅是说明本发明的一些优选的实施方案而不是限制本发明的范围。实施例1培养、粗纯化、浓缩一个500ml烧瓶在本文用作为培养箱。制备100ml包含0.134Na2HPO4·12H2O、0.03 KH2PO4、1麦芽糖、1蛋白胨、0.1酵母提取物、0.05MgSO4·7H2O、0.1mM CuSO4、1mM MnCl2和2mM CaCl2的培养基，并往其中加入20％的Na2CO3以调节pH至7.8。将地衣芽孢杆菌SD3003(FERM P-15383)细胞接种在培养基上，在50℃下在该培养基上摇动培养16小时。然后，将培养基温度降至35℃，并再培养3天。
在培养之后，在4℃条件下离心分离培养物以除去细胞。发现硫酸铵分馏法对纯化和浓缩所产生的培养肉汤有效。更具体地说，用饱和浓度为20％-60％的硫酸铵分馏上述培养肉汤，集中大多数的活性多酚氧化酶组分作为沉淀。对由硫酸铵分馏获得的沉淀进行抗10mM Bis-Tris-HCl缓冲液(pH7.0)透析，同时通过超滤法纯化和浓缩上述透析物。这样在10,000-100,000分子量范围的组分中获得一种粗纯化的含水酶浓缩物(800mU/ml)。实施例2底物特异性将前述实施例1中获得的粗纯化的含水酶浓缩物用于检验抗多酚化合物氧化的底物特异性。更具体地说，在室温(20℃)下在100mM的Bis-Tris-HCl缓冲液(pH7.0)中，添加酶浓缩物至0.05mM下表1所显示的每一种底物中。测定包含酶浓缩物检验样品与不含酶浓缩物对照样品间的耗氧量差别，结果显示在下列表中实施例3分子量通过GFC(凝胶过滤色谱法)测定以上制备的酶的分子量。
利用一系列两GFC柱(shodex PROTEIN KW-802.5)(在1.0ml/min流速下与1.34 Na2PO4·12H2O、0.3 KH2PO4和1NaCl平衡)和Uv检测器(280nm)，通过HPLC分析和分馏实施例1中所获得的粗纯化的含水酶浓缩物，测得所分馏的酶的活性。结果在46,000-56,000分子量范围之内洗脱出多酚氧化酶活性峰值。由东方工业公
司生产的MW-Marker(HPLC)用作为分子量标记蛋白质。实施例4在5升培养箱中的培养、浓缩、粗纯化制备三升包含0.134Na2HPO4·12-H2O、0.03 KH2PO4、1麦芽糖、1蛋白胨、0.1酵母提取物、0.05 MgSO4·7-H2O、0.1mM CuSO4、1mMMnCl2和2mM CaCl2的培养基，以10 NaOH调节pH至7.8。将其放入5升的培养箱中。将地衣芽孢杆菌SD3003(FERM P-15383)细胞接种在培养基上，在50℃下在该培养基上摇动培养16小时。然后，将培养基温度降至35℃，并再培养3天。在培养之后，在4℃条件下离心分离培养物以获得无细胞培养肉汤。
接着，利用微型槽过滤包(生产目录号PTGCOMP04，由Millipore公司生产)，在微型槽超滤系统(由Millipore公司生产)中分馏这部分培养肉汤。以获得具有10,000或更高分子量的组分，然后将其浓缩。得到的浓缩物进行抗200 ppm NH4HCO3透析，然后冻干获得粗纯化的干燥冻干物(lyopHilisate)。干燥冻干物的多酚氧化酶活性是500mU/mg。实施例5用含酶去污剂清洗污染的织物将0.1g的实施例4中获得的干燥冻干物加入10g标准去污剂(包含25％(重量百分率)直链烷基苯磺酸钠(LAS)、5％(重量百分率)聚氧化乙烯月桂基醚、15％(重量百分率)三聚磷酸钠、6％(重量百分率)硅酸钠、1％(重量百分率)羧甲基纤维素钠和48％(重量百分率)Na2SO4)中，以制备含酶去污剂样品。将不含酶的去污剂作为对照去污剂样品。
在白棉布(5cm×5cm)的中心使用0.2ml的100 ppm Evans′Blue(从Wako纯化学工业公司购得)以制备污染的样品。
将一块污染样品与10ml水、10mg含酶的去污剂样品或不含酶的对照去污剂样品一同放到500ml的烧杯中。然后，摇动烧杯12分钟以清洗棉布。经过这样洗涤之后，用水冲洗样品并在空气中干燥，用色差测量仪(由Minolta公司生产)测量其颜色以测定上述布的Y、y和X值。由这些测量值，按照方程式Z=(1-X-y)Y/y可获得其Z值。
与不含酶对照去污剂处理的样品比较，结果显示含酶去污剂样品处理的样品白度增加1.5个百分点。实施例6平板检验各种菌株中的多酚氧化酶检验下列菌株地衣芽孢杆菌NCIB 8059、NCIB 8061、ATCC6634、ATCC 9945a、ATCC 11945和SD3003和纳豆芽孢杆菌SN AKU0205。
每一菌株在34℃下在pH8.6下在包含下列组合物的培养基中摇动培养3天0.5苹果酸、0.5蛋白胨、0.05 MgSO4·7H2O、0.01 mM CuSO4、0.05 mM MnCl2、0.1 mM CaCl2。
利用具有下列组合物的平板，在平板测定中试验每一培养肉汤50mM缓冲液(中性pH)、100 ppm MgSO4·7H2O、1.8琼脂和作为指示剂的25ppm丁香醛连氮。培养肉汤涂于安置在平板上的纸盘上。
对于上述的每一种菌株，在纸盘周围可观察到一个表明多酚氧化酶活性存在的、明显的粉红区带。实施例7各种菌株的多酚氧化酶测定96孔微量滴定皿的一个加样孔装以20μl缓冲液(1M,pH7.1)、160μl水、20μl培养肉汤(在前述实施例中利用以下显示的菌株制备)的上清液、以及20μl丁香醛连氮溶液(200 ppm，在50乙醇中)。将其在室温下培养5小时，同时在培养前后测定其在550nm处的吸光度。结果显示每一种菌株的吸光度都有增加菌株吸光度增加量IFO 3341 .002NCIB 10314.004NCTB 8059 .023NCIB 8061 .010
ATCC 6634 .024ATCC 9945a.052ATCC 11945.047这些结果证明芽孢杆菌属菌株具有阳性多酚氧化酶活性。本发明的优点如同上文所详细描述的，本发明提供了一种由细菌产生的多酚氧化酶。现已发现，这一酶起到酶促氧化作用，可用于对多酚物质和有色物质的氧化处理，并可用于清洗和漂白目的。
按照本发明的方法，可以高效地产生本发明的多酚氧化酶。
本发明的地衣芽孢杆菌SSD3003有效地用于产生本发明的多酚氧化酶。
本发明也提供利用上述酶的方法，即利用本发明的多酚氧化酶来处理有色物质，处理纸、纸浆和纤维，漂白和清洗各种物质以及处理微生物和病毒而使它们无毒的方法。
附图简要描述图1显示得自DS 3003的多酚氧化酶pH廓线。
图2显示得自DS 3003的多酚氧化酶温度廓线。
图3显示得自DS 3003的多酚氧化酶温度依赖性稳定性的示意图。
图4显示得自DS 3003的多酚氧化酶pH值依赖性稳定性的示意图。
权利要求
1．一种得自细菌的多酚氧化酶。
2．权利要求1的多酚氧化酶，其得自芽孢杆菌属细菌。
3．前述权利要求的多酚氧化酶，其中所说的芽孢杆菌属细菌属于地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌或者球形芽孢杆菌。
4．权利要求2或3的多酚氧化酶，其得自Bacillus sp.NCIB 10314；地衣芽孢杆菌NCIB 8059、NCTB 8061、ATCC 6634、ATCC 9945a、ATCC 11945或SD3003(FERM P-15383)；纳豆芽孢杆菌SN AKU 0205或者球形芽孢杆菌IFO 3341。
5．前述权利要求的多酚氧化酶，其得自地衣芽孢杆菌SD3003(FERMP-15383)。
6．任一前述权利要求的多酚氧化酶，其具有下列特征a)最适反应pH值大约为7。b)最适反应温度在60℃和80℃之间。c)分子量大约51,000(vy凝胶过滤层析)。
7．一种用于氧化多酚化合物、包含烷氧基的芳香化合物、卤化多酚化合物或者芳香胺化合物的方法，该方法包含在有氧存在的条件下用权利要求1-6中任一项的多酚氧化酶处理上述化合物。
8．一种用于漂白有色物质的方法，该方法包括在有氧存在条件下用权利要求1-6中任一项的多酚氧化酶处理有色物质。
9．一种在多种织物在洗涤液中一起洗涤时，用于抑制纺织品染料从一种有色织物转移至另一种织物的方法，该方法包括在有氧存在条件下用权利要求1-6中任一项的多酚氧化酶处理上述洗涤液。
10．一种用于漂白有色废水的方法，该方法包括在有氧存在条件下用权利要求1-6中任一项的多酚氧化酶处理有色废水。
11．一种用于灭活微生物或病毒的方法，该方法包括在有氧存在条件下用权利要求1-6中任一项的多酚氧化酶处理微生物或病毒。
12．一种用于漂白含有木质素的材料的方法，该方法包括在有氧存在条件下用权利要求1-6中任一项的多酚氧化酶处理含有木质素的材料。
13．权利要求7-12中任一项的方法，其中所说的多酚氧化酶与一种附加的可氧化的底物一起使用。
14．权利要求7-13中任一项的方法，其中所说的多酚氧化酶与具有过氧化酶活性的物质一起使用。
15．权利要求7-13中任一项的方法，其中所说的多酚氧化酶与氧化酶及氧化酶底物一起使用。
16．一种去污剂组合物，其包含权利要求1-6中任一项的多酚氧化酶。
17．一种用于产生多酚氧化酶的方法，该方法包括在适宜营养培养基中培养产生多酚氧化酶的芽孢杆菌属细菌，其后回收上述多酚氧化酶。
18．前述权利要求的方法，其中所说的细菌属于地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌或者球形芽孢杆菌。
19．前述权利要求的方法，其中所说的细菌是地衣芽孢杆菌NCIB8059、NCIB 8061、ATCC 6634、ATCC 9945a、ATCC 11945和SD3003(FERM P-15383)；纳豆芽孢杆菌SN AKU 0205；球形芽孢杆菌IFO3341或者这些细菌的任一突变体。
20．地衣芽孢杆菌菌株SD3003(FERM P-15383)。
全文摘要
一种由细菌,特别是从芽孢杆菌属胞外产生的新多酚氧化酶,该酶在漂白和氧化各种各样的底物中是有用的。
文档编号D21C5/00GK1209839SQ9719194
公开日1999年3月3日 申请日期1997年1月29日 优先权日1996年1月29日
发明者爱知后贵, 大野律子 申请人:诺沃挪第克公司