专利名称：一种定向培育含有海藻糖烟草杂合体的新方法
技术领域：
本发明属高新技术的农业育种领域，特别涉及一种以染色质转移技术为基础，分子检测手段为辅助的新型育种措施。
背景技术：
种质资源与人类的生活和生存环境息息相关，创造具有重大应用价值的新种质，培育优质、高产、多抗的农业和林业新品种，已成为生命科学领域亟待解决的问题。新种质创造本质上是打破物种的界限，使来自不同物种的遗传物质——基因或基因组进行重新整合。当前新种质创造的一个重要手段即分子育种，分子育种的原理和技术创新问题在国际越来越受关注。
在分子育种领域中，对于遗传物质的转移方法有很多，如农杆菌介导转化法和基因枪技术等，但直接获得细胞内遗传物质进行分子育种也是一种可以尝试的手段。本项研究在认真借鉴DNA重组和转基因等分子育种技术的原理和方法的基础上，欲从植物细胞中直接获得遗传物质，再将供体植物遗传物质经显微注射的方法注入受体植物细胞中。在此基础上，将含有受体细胞遗传物质的细胞置于供体植物的再生组织上，进行再生培养。最终筛选受体细胞遗传物质中保守性较强的目的基因片段，对受体再生植株进行分子检测，其目的是能够探索出一种崭新的分子手段，其特点是周期较短，遗传转化效率较高。
发明内容
本发明方法第一次成功将衣藻染色质转移至烟草原生质体，优点是(1)应用显微注射的方法为受体细胞提供遗传物质，是一种创造植物新种质的崭新途径。传统转基因方法只针对某一个基因，培育出的新种质资源也只是具有单一优势性状。而显微注射可以将整个目的基因组注射进入受体植物细胞，创造具有多个优势性状的新种质。而且如果有合适的方法将基因组切割成片段，还可以尝试注射几个特定的基因片段，达到更准确获取多个优势性状的新种质资源。
(2)衣藻裂解液首先注射入烟草原生质体中，短时间共孵育，对衣藻遗传物质起到一个保护性作用，而且增加整合几率。转衣藻裂解液的再生植株与对照植株表型差异明显，转衣藻裂解液的再生植株发育迟缓，叶片柳叶形。
(3)在脱分化培养结束时，严格筛选出生长在划痕上的愈伤组织，进行再生芽培养，再筛选出表型差异大的再生植株进行目的基因检测。结果表明那些表型差异显著的再生植株存在目的基因长度的片段。而另外一些烟草再生植株显型与对照相比差异较小的，不存在目的基因片段。表明在划痕附近的部分愈伤组织没有与衣藻遗传物质整合，进一步研究时应该加大衣藻遗传物质注射到原生质体的量，也增加浇注到烟草外植体上的原生质体的数量，这样将会提高整合衣藻遗传物质的烟草再生植株的几率。
(4)衣藻裂解液可能含有染色质、核酸片段、蛋白质等，在接下来的实验中将会采取更有效的分离方法，得到确切的裂解液。目前动物细胞的染色质转移技术已经成功应用。2004年，“遗传存储与克隆”公司使用染色质转移技术成功的克隆了与正常胚胎极为相像的宠物猫。这项技术表明转移染色质可以创造与亲本更为相像的物种。关于植物中染色质转移的问题，早在1955年郑国錩等报道了花粉母细胞间染色质自发穿壁以及新核形成过程的研究。染色质作为转移遗传物质的对象，能够提高整合几率和提高新种质的成活率。所以微注射技术在植物染色质和基因组等遗传物质转移方面的应用研究的开拓，为新种质创造提供新技术新理论。
本发明的具体步骤如下将TAP液体培养基培养衣藻3天分装成1ml的离心管8-10个，用封口膜封口，液氮反复冻融三次，0.8μM滤器过滤。应用原子力显微镜(AFM)和分子手段(PCR)检测滤液中衣藻遗传物质；取短轴超过5cm的温室苗叶片。3％NaCIO消毒五分钟，无菌水冲洗三次。超净工作台下撕去表皮，裸露叶肉面向下置于10ml酶液中，28℃暗培养4-12h。300目铜网过滤。40g离心10min，温度28℃，弃上清，取沉淀。用改良的cpw洗液重悬，洗三次，调整浓度；用微量移液器分别吸取200μl衣藻冻融液和烟草原生质体滴加在载玻片上，移动注射针通过虹吸作用吸取衣藻冻融液，然后迅速移到烟草原生质体液滴中；调整注射针和固定针的位置，用固定针吸住原生质体，用注射针刺入细胞，轻转液压泵，注射体积为10pl；将注射好的细胞吸入固定针中，同时吸入一定的培养液，轻转液压泵，释放原生质体至烟草外植体划痕处。也可以将注射后的烟草原生质体放入2mlCPW洗液中，然后浇到划痕上，进行培养。大约20天左右划痕上再生芽萌发，进行继代培养。大约15天左右，再生芽2-3cm后进行继代培养。
下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。
实施例1将衣藻用液氮反复冻融三次，0.8μM滤器过滤。应用原子力显微镜(AFM)和分子手段(PCR)检测滤液中衣藻遗传物质如
图1、图2所示；酶解制备原生质体，过滤，离心，弃上清取沉淀。用改良的cpw洗液重悬；用注射针将衣藻冻融液注入到烟草原生质体中；将注射好的细胞吸入固定针中，同时吸入一定的培养液，轻转液压泵，释放原生质体至烟草外植体划痕处。大约20天左右划痕上再生芽萌发，进行继代培养。大约15天左右，再生芽2-3cm后进行继代培养，如图3所示。随机选取转移衣藻裂解液的烟草再生植株进行PCR检测，检测到预期的600bp片段，阴性对照未扩增出任何谱带，如图4所示。600bp片段可能是海藻糖水解酶基因，海藻糖水解酶基因可以诱导植物具有抗旱性的特征。
实施例2将衣藻用液氮反复冻融三次，0.8μM滤器过滤。应用原子力显微镜(AFM)和分子手段(PCR)检测滤液中衣藻遗传物质如图1、图2所示；酶解制备原生质体，过滤，离心，弃上清取沉淀。用改良的cpw洗液重悬；用注射针将衣藻冻融液注入到烟草原生质体中；将注射后的烟草原生质体放入2mlCPW洗液中，然后浇到划痕上，进行培养，最后进行PCR检测。结果与实例1相似。
权利要求
1.一种定向培育含有海藻糖烟草杂合体的新方法，包括如下步骤(1)制备衣藻冻融物(2)分离烟草原生质体(3)拉制微注射针(4)微注射(5)微注射之后烟草原生质体的培养(6)分子检测(7)叶绿素测定
2.按照要求1所述的方法，其中步骤(1)TAP液体培养基培养衣藻3天分装成1ml的离心管8-10个，用封口膜封口，液氮反复冻融三次，0.8μM滤器过滤。用于AFM观察的滤液直接滴加在新揭的云母片上。
3.按照要求1所述的方法，其中步骤(2)所述的酶液配制方法为Mannitol1.09302gCaCI2·2H2O 0.01176gCelluase0.1gMacerozyme 0.05gMES 0.01066gBSA 0.003g加入10ml蒸馏水，在磁力搅拌器上搅拌均匀，然后用1MKOH调PH＝5.8，0.2μM滤膜过滤。CPW洗液的配制方法为Mannitol1.09302gCaCI2·2H2O 0.01176gKH2PO40.001369g加入10ml蒸馏水，1MKOH调PH＝5.8。
4.按照要求1所述方法，其中步骤(3)注射针参数调整如下温度80℃，主磁力70，副磁力20；固定针参数为温度80℃，主磁力50，副磁力25。然后，将拉断的玻璃管置于EG-400磨针仪磨制，角度30°，转数60rpm。最后，将毛细玻璃管置于MF-900煅针仪上煅烧针尖形状，弯曲角度为30°，固定针所需温度约为40℃，注射针约为所需温度约为28℃。以上为平均参数，对于不同毛细玻璃管略有差异。固定针的尺寸应该根据原生质体大小来调节，住原生质体，又可以将原生质体在不导致其破碎的情况下吸入。
5.按照要求1所述的方法，其中步骤(4)微注射应最小程度减轻细胞损伤，注射体积为10pl，以小于细胞体积的5％为宜。
6.按照要求1所述的方法，其中步骤(5)所使用的培养基分别为诱导愈伤培养基MS+1.0mg/lBA+0.5mg/l2，4-D+20g蔗糖+9.5g琼脂PH＝5.8继代培养基MS+0.2mg/lBA+0.1g/lNAA+20g蔗糖+9.5g琼脂PH＝5.8再生芽继代培养基MS+0.2mg/lBA+0.05mg/lNAA+20g蔗糖+9.5g琼脂PH＝5.8
7.按照要求1所述的方法，其中步骤(6)用CTAB法提取转衣藻裂解液、烟草再生植株和阴性对照的总DNA作为模板，在PCR仪上进行PCR扩增，扩增引物为自行设计的海藻糖水解酶目的基因引物。每次扩增设衣藻原生质体和衣藻冻融后的裂解液为阳性对照，正常烟草植株为对照阴性。PCR产物加2μl溴酚蓝，经1.2％琼脂糖凝胶电泳法分离，紫外照相。PCR扩增条件为95℃预变性5min，然后94℃变性1min，52.6℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，72℃保温10min，反应终止。每次扩增设衣藻和衣藻冻融后的滤液为阳性对照，正常烟草植株为对照阴性。PCR产物加2μl溴酚蓝，经1.2％琼脂糖凝胶电泳法分离，紫外照相。
8.按照要求1所述的方法，其中步骤(7)采用二甲基亚砜浸提法，应用分光光度计(日本Shimadzu)测定，按照参考公式计算单位鲜重叶绿素和类胡萝卜素的含量。
全文摘要
本发明一种定向培育含有海藻糖烟草杂合体的新方法，属高新技术的农业育种领域，包括染色质的分离、染色质转移和分子生物学的检测等技术方法，本发明利用染色质转移技术对烟草进行培育，既节约了成本，又提高了效率。
文档编号C03B23/047GK1916178SQ200610010520
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月8日 优先权日2006年9月8日
发明者祖元刚, 郭晓瑞, 张宇亮, 吴双秀, 刘 英, 孟庆焕, 王俐, 赵修华, 于景华, 梁慧丽, 刘红梅 申请人:东北林业大学, 祖元刚