用于空间解析荧光相关光谱学的光垫显微镜的制作方法
【专利摘要】本公开内容教导了显微镜（1），其具有用于照明样品或物体(18)的照明光路（20）和用于观察所述样品的观察光路（40,50），所述显微镜包括在照明光路中的照明光路聚焦装置，所述照明光路聚焦装置限定沿着所述照明光路的照明方向和其垂直方向延伸的基本上二维的样品或物体照明区域（22）。所述显微镜进一步包括在照明光路中的用于有选择地照明所述基本上二维的物体照明区域的部分（10）的照明区域界定装置（27），其中所述基本上二维的物体照明区域的该部分在所述照明方向和其垂直方向中的至少一个方向上被界定。
【专利说明】用于空间解析荧光相关光谱学的光垫显微镜
【技术领域】
[0001]本发明涉及光学显微镜，特别是涉及具有限定的焦体(focal volume)的光学显微镜，以及适合于样品浓度波动测定的方法。
【背景技术】
[0002]扩散从根本上有助于可溶性分子的运动，从而从根本上有助于从细胞分裂和细胞内部的信号转导的调节到组织起源时的激素调节以及到发育过程中的形态发生原梯度等许多生物进程的时空方面。在复杂的细胞环境中量化生物分子的扩散性质是非常有挑战性的。能够直接分析扩散过程的装置和方法是非常少的且都是为个别问题专门定制的。
[0003]确定生物分子特别是蛋白质的且特别是在它们的自然环境中的性质和行为，是说明和分析它们的功能和在细胞过程和发育过程背后的机理的关键步骤。荧光相关光谱学(FCS)[1，2]是已知的用于分析分子迁移率的方法，分子迁移率提供了关于标记分子的移动的和不动的部分、它们的扩散性质和浓度、以及相互作用的不同标记分子的共扩散的信息。
[0004]共焦激光扫描显微镜(共焦显微镜)是目前选择用于具有高分辨率的活细胞成像
[3]和用于FCS的仪器，因为共焦激光扫描显微镜与利用雪崩光电二极管(APD)的超敏光子计数结合使衍射极限成像(diffraction limited imaging)成为可能。利用共焦激光扫描显微镜的FCS测定已经被应用于量化发信号时涉及的蛋白质复合物形成的动力学(由EMBL作出的[4]和由其他人作出的[5])，以研究具有出口能力(export-competent)的mRNP的成熟[6，7]或表征形态发生原梯度[8]。利用共焦激光扫描显微镜的FCS测定在本公开内容中被称为共焦FCS。然而，由于共焦FCS数据采集的一个点接着另一个点的连续做法所施加的内在局限性，连同因失焦的光照而导致的输入到样本中的光子的总荧光光子产率过低，使得共焦FCS实验仍然具有挑战性[9]。通常，共焦激光扫描显微镜仅允许在特定的所选的位置上测定每个细胞的一个或少数几个点[4，10，11] ο
[0005]换而言之，共焦FCS没有提供足够的空间解析信息以产生原本能够将跨越整个细胞或生物体的分散过程和其它来自FCS的蛋白质参数(例如蛋白质相互作用)视觉化的细胞和其它生物样品的图像。
[0006]已知方法和装置的另一个缺点是扩散的空间解析成像是有限的或不可能的。
【发明内容】
[0007]本公开内容教导了具有用于照明样品或物体的照明光路和用于观察样品的观察光路的显微镜。所述显微镜包括在所述照明光路中的照明光路聚焦装置，所述照明光路聚焦装置限定基本上为二维的样品或物体照明区域，所述照明区域沿着所述照明光路的照明方向和其垂直方向延伸。所述二维物体或样品照明区域可以被视为光带或光片(light-sheet)。由于照明光被成形为所述二维样品照明区域，因此所述照明光路聚焦装置可以被理解为光路成形装置。
[0008]所述显微镜在所述照明光路中进一步包含照明区域界定装置，所述装置用于有选择地对所述基本上二维的物体照明区域的一部分进行照明，其中至少在照明方向和/或其垂直方向上对所述基本上二维的物体照明区域的该部分进行界定。因此所述光带在照明方向和其垂直方向中的至少一个方向上被界定，基本上形成也称为“光垫(light pad)”的所述基本上二维的物体照明区域的一部分。所述基本上二维的物体照明区域的厚度和所述光垫的厚度比照明方向长度及其垂直方向的宽度小的多。例如，所述基本上二维的物体照明区域的该部分在照明方向上的长度和在垂直方向的宽度可以是所述基本上二维的物体照明区域的该部分的厚度的约6倍或大于约6倍。
[0009]所述照明光路聚焦(和成形)装置可以包括柱面透镜、畸变成形透镜(anamorphically shaped lens)、一维阵列的球面或非球面透镜中的至少一个。所述照明光路聚焦(和成形)装置还可以包括至少一个畸变成形反射镜。
[0010]所述照明区域界定装置可以至少包括第一孔，其用于在照明方向上界定所述基本上二维的物体照明区域的该部分。所述照明区域界定装置还可以至少包括第二孔，其用于在垂直于照明方向的方向上界定所述基本上二维的物体照明区域的该部分。所述第一孔和所述第二孔中的至少一个可以是可调节的，且可以是圆形光圈或矩形孔或狭缝。
[0011]所述观察光路的观察方向可以是基本垂直于所述照明方向。然后对所述基本上二维的物体照明区域进行调节以使其位于检测物镜的焦平面内。在这方面，所述显微镜可以基于具有至少在照明方向上被界定的照明区域的单一平面照明显微镜。本公开内容也可以联合使用其它观察方向。
[0012]所述检测光路或观察光路可以包括至少一个允许将检测区域界定在所述基本上二维的照明区域的该部分的空间滤波器。
[0013]可以使用一个或多个检测器像素阵列(如CXD照相机或EM-CXD照相机中的至少一个)来实施样品的观察和检测，利用所述观察光路将所述基本上二维的物体照明区域和检测区域投射/成像到所述检测器像素阵列。
[0014]本公开内容还教导了用于观察/检测样品的方法。所述方法包括通过使照明光束聚焦到在所述照明光束的照明方向和其垂直方向延伸的基本上二维的物体照明区域，来照明样品的二维部分，其中照明所述二维部分进一步包括界定所述基本上二维的物体照明区域以有选择地照明所述基本上二维的物体照明区域的一部分，其中在照明方向和垂直于照明方向的方向中的至少一个方向上对所述基本上二维的物体照明区域的该部分进行界定。可以将所述基本上二维的物体照明区域的该部分称为光垫。
[0015]所述方法可以包括移动所述基本上二维的物体照明区域或所述基本上二维的物体照明区域的该部分中的至少一个使其穿过所述样品。这可以用于扫描整个所述样品。通过至少移动一个照明物镜、通过移动照明光路聚焦装置或其元件、通过用扫描单元进行扫描、通过移动所述照明区域界定装置和通过改变所述照明光路的准直(这可以通过例如用空间光调制器(SLM)或用具有可变曲率的反射镜操作波前来完成)，可以在样品中以3D的方式进行所述基本上二维的物体照明区域和/或其所述部分的移动。
[0016]为了获得例如荧光分子在所述基本上二维的物体照明区域和检测区域的分布图像，可以将来自所述样品的光在一定时间内在检测器像素阵列的每个像素上的记录合并。
[0017]可以以一系列短时间间隔记录在检测器像素阵列的每个像素上的来自所述样品的光，可以将时空相关性分析应用于所述记录，以获得针对检测器阵列上的每个像素的FCS数据。
[0018]所述方法可以进一步包括测定在所述基本上二维的物体照明区域的该部分中的信号波动。可以对在每个像素上或一区域上或所述基本上二维的物体照明区域的该部分的荧光强度时间追踪进行波动分析。所述波动分析可以是时间自相关性分析、来自不同像素的信号之间的时间互相关性分析、来自不同光谱通道的信号之间的时间互相关性分析、光子计数直方图、来自不同像素的信号之间的光子符合分析、来自不同光谱通道的信号之间的光子符合分析和本领域技术人员已知的其它方法中的至少一种。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]当阅读了参照附图的详细说明时，本发明的进一步的方面和细节将变得明显，其中:
[0020]图1显示了以衍射极限的光垫进行的基于光片的FCS成像；
[0021]图2更详细地显示了图1a中的显微镜；
[0022]图3a至3c示意说明了光学光垫；
[0023]图4示意说明了光垫显微镜的光学性质；
[0024]图5显示了在溶液中的ID - FCS测定；
[0025]图6显示了细胞培养基对聚焦光片的影响；
[0026]图7显示了在用所述光垫显微镜记录的MDCK细胞内和来自果蝇幼虫的翅成虫盘内的蛋白质浓度和迁移率的FCS成像结果；
[0027]图8显示了活体内的用于对比的共焦FCS测定；
[0028]图9显示了关于来自果蝇幼虫的翅成虫盘和3T3细胞的ID-FCS测定；和
[0029]图10显示了通过FCS成像，对3T3细胞中的HPl α迁移率进行的空间解析分析。
【具体实施方式】
[0030]本发明现在将参照附图进行说明。应当理解的是这里所描述的本发明的实施例、实施方案和方面仅仅是范例，并没有以任何方式限制权利要求的保护范围。本发明由权利要求和它们的等同物所限定。应当理解的是本发明的一个实施方案或方面的特征可以与本发明中与之不同的一个或多个方面和/或实施方案的特征结合，还应当理解的是实施例和实施方案的特征并非都是实施本发明所必须的。
[0031]本公开内容教导了称为光垫(light-pad)显微镜I的新的显微镜。所述光垫(light-pad)显微镜I由三个模块组成，如例如在图1a和更详细的图2中所示:(i)从照明光束20产生衍射极限的光片22的照明装置2 ;所述衍射限制的光片22在至少一个方向上被界定，从而限定所述光垫10 ； (ii)能够沿着光片22和/或光垫10的焦点区的检测光路40和50中的至少一个进行观察的检测单元4;以及可选的(iii)能够方便地将试样或样品8的特定区域定位至光垫10的焦点之内的倒置显微镜6。
[0032]当只有试样8的横截面被光片22照明时，本公开内容的光垫显微镜I提供了对荧光激发的完全的空间控制，从而避免了不需要的失焦曝光。与此同时，所有的发射光子起源于光片22的焦平面，且不需要基于它们的空间起源的光子滤波。
[0033]光垫显微镜I基于两个正交排列的物镜，即照明物镜21和检测物镜41。所述照明物镜21和检测物镜41可以是长工作距离的物镜，例如40x/0.8NA物镜，但并不限于该40x/0.8NA物镜。应当理解的是也可以使用其它具有不同放大倍数和/或数值孔径的物镜。所述照明物镜21和检测物镜41可以是相同的或可以是具有不同的放大倍数和/或数值孔径的不同物镜。所述照明物镜21和检测物镜41可以浸入容纳样品8的皮氏培养皿82中。
[0034]光垫显微镜I可以与被认为有助于成像或FCS的任何波长或任何波长组合一起使用，可根据所述样品8和用于研究样品8的染料而定。为了检测GFP荧光，例如可以使用具有例如2W的输出功率的氩激光器220的488nm线(如图2所示，例如来自Coherent公司的Innova Sabre SBRC-R-DBff/20)?可以例如通过使所述照明光束穿过放置在位于声光可调滤波器 226 (例如 AOTF ；AA.A0TFnC-400.650-TN, AA Opto-Electronic 公司)之后的偏振器224 (例如格兰泰勒(Glan-Taylor)偏振器，如Thorlabs公司的GL5-A)前面的半波片222(例如Thorlabs公司的WPMH05M-488)，来调节所述照明光束20的功率。可以使用单模光纤228 (例如 kineFLEX-P-3-S-458-640-2.0-2.0-PL，Point Source 公司)传输光至包含在试验板(breadboard)7上的该设置。在另一个实施方式中，通过利用光学元件例如反射镜(未显示)，可以将激光直接传输至所述设置。
[0035]为了成形所述照明光束20以产生所述光片22，可以首先校准和以畸变方式扩展所述照明光束20,从而在一个方向上从高斯分布(Gaussian profile)中切出近似等截面。在另一个方向上，用柱面透镜23 (例如具有f=75.6mm)聚焦所述照明光束20。为了在样品中精确地定位光片22，所述照明光束20穿过扫描模块26，所述扫描模块26例如由配置在F-theta扫描透镜264(S4LFT0061，f=60mm, Sill Optics公司)的后焦平面的检流计驱动镜(galvanometer-driven mirror) 262 (VM-500+，GSI)组成。可以使用镜筒透镜24 (例如具有f=245.60mm)和具有例如3.3mm的长工作距离的水浸式照明物镜21 (例如，Plan-Apochromat40x/0.8NA, Leica公司)来产生样品8中的光片22。通过调节置于镜筒透镜24的后焦平面的宽度界定用狭缝或宽度界定用光圈(iris)27的尺寸，可以将光片22的宽度调节为例如在约20 μ m和200 μ m之间。这样允许仅对所述样品的一部分进行照明，从而防止在进行测定或图像采集时邻近区域的光致漂白。在扫描透镜264和镜筒透镜24之间的反射镜25将光束偏转45 °，从而使照明物镜21以45 °指向含有试样或样品8的水平面(皮氏培养皿底部)。
[0036]照明光路20中的多狭缝配置用来通过照明区域界定装置，将所述光片22界定至光垫10。所述照明区域界定装置可以包括用于界定所述光片22的宽度W的宽度界定用狭缝或光圈27。所述照明区域界定装置可以进一步包括配置在例如镜筒透镜24和所述照明物镜21之间的用于界定所述照明区域或光片22在所述照明光路20的照明方向上的长度I的长度界定用狭缝或光圈29。因此所述光片22可以被界定至长度I和宽度w而形成光垫10(具有宽度w和长度1)，如图1b和图3a所示。图3a上部的图像显示了沿着图la、lb和图2的z方向穿过检测物镜41所见的光垫10的顶视图。图3a下部的图像显示了沿着图la、Ib和图2的X方向所看到的光片22和光垫10，显示了所述光片22和所述光垫10的厚度d。扫描模块26的调节和长度界定用狭缝29以及宽度界定用狭缝27的定位提供了在样品8的所选区域内对光垫10的方便定位(图1a-1b和图3a_3c)。
[0037]为了收集发射的荧光，将作为观察物镜的检测物镜41配置为与所述照明物镜21成90°的角(图2)。为了避免反射的激光，可以将分色镜44(如果使用488nm的激发波长，则例如是BS HC R488，AHF Analysentechnik公司)置于位于所述观察物镜41之后的检测镜筒透镜43的前面。翻转镜(flip-mirror)45可以被用于在第一检测光路40和第二检测光路50这两个可替代的检测路径之间翻转荧光。在样品8和翻转镜45之间，第一检测光路40和第二检测光路50是叠加的且使用相同的元件。本公开内容可以同时使用第一检测光路40和第二检测光路50或仅使用第一检测光路40或仅使用第二检测光路50来实施。如果仅使用一个光路，可以省去翻转镜45。
[0038]所述第一检测光路40可被用于强度光片成像，以及可以包括带通滤波器47(例如BrightLine HC525/45, AHF Analysentechnik公司)和可以影响总放大倍数的开普勒望远镜46。将荧光信号沿着所述第一检测光路40聚焦在电子倍增电荷耦合装置(EM-CCD)照相机48 (例如QuantEM: 512SC, Photometries公司)上，所述照相机48被称为成像照相机
48。这个成像照相机48的像素尺寸可以在131xl31nm2 (在芯片上的实际尺寸:16x16 μ m2)的样品平面内，视野对应于样品中67x67 μ m2面积。可使用更小或更大的芯片像素尺寸和/或不同几何构型的芯片。
[0039]对于使用所述成像照相机48和第一检测光路40的光垫显微镜I,如图1a和图2所示，可以使用固定所述样品8的机动平台84对所述样品8进行3D成像。对于略圆的物体(例如微球或酵母细胞)的情况，在沿着检测光轴(z轴)的等距的样品位置可以获得图像堆栈。对于横向延伸的物体被用作样品8的情况，例如果蝇幼虫翅成虫盘，则可以水平地(在y-z方向)获得图像堆栈。通过邻近区域的平铺成像(tiled imaging)可以获得更大的有效视野。 [0040]所述第二检测光路50可以被用于FCS成像(1D-/2D-FCS记录)和/或强度成像。所述第二检测光路50可以包含带通滤波器55 ^UBfcightLine HC 525/45，AHFAnalysentechnik公司)和扫描模块56。通过空间滤波器57可以实现空间滤波,所述空间滤波器57可以包含两个透镜，例如为消色差双合透镜的第一透镜571和第二透镜572 (例如f=60mm，Thorlabs公司)；和置于所述第一双合透镜571成像平面的可调节狭缝573 (例如07SLT701，Melles-Griot公司)。所述可调节狭缝573也可以提供对与其垂直配置的所述光垫10的界定。所述扫描模块56使得能够对用于在所述样品8的照明区域内的FCS成像的区域进行定位，而空间滤波器57允许调节这个照明区域的图像的尺寸。换而言之，可以沿着所述第二检测光路50选择所述光垫10的一段或一部分进行成像或进行检测。连同在照明光路20中通过空间滤波器27 (光圈)进行的对所述光片22的横向界定一起，这限定了所述光垫10 (图1b和图2a)。最后,聚焦透镜59,例如非球面透镜(f=40mm, Thorlabs公司)，将所述荧光聚焦在被称为FCS照相机58的第二 EM-CCD照相机(例如SamBa SE-34，Sensovation公司)上。所述第二检测光路50的总放大倍数可以是例如39x,这可以使得在样品空间中的像素尺寸为190xl90nm2 (在芯片上的实际尺寸:7.4x7.4μπι2)以及产生对应于样品中124x94 μ m2的最大视野。其它的放大倍数和其它的像素尺寸以及不同的探测器阵列也可以在本公开内容中使用，也可以经配置用于所述显微镜和待研究的所述样品8。
[0041]对于一维(ID)-FCS数据的采集，可以使用通向所述FCS照相机58的所述光学路径50(图1a和图2)。为了提高时间分辨率，若需要，可以以线扫描的模式操作FCS照相机58的EM-CXD。在随后的曝光间隔之间,取代将来自传感器区域的全帧(complete frame)转移至芯片的存储区的是，仅将单线进行移位。然后，通过A/D转换和芯片放大链，将线的一部分或整条线转移至巾贞捕捉卡(framegrabber card)(例如 PC1-1422, National Instruments公司)。读出工序是CCD图像采集的限时步骤，这个过程显著地提高了时间分辨率，如对于例如线的120个像素的部分，时间分辨率为40 μ s (或25，000线/秒)。对于在活体内的测定，例如为了扩展视野，可以采集具有70 μ s的时间分辨率的340个像素(半线)。为了增加每个数据点的光电子数，可以将所述第二检测光路50中的空间滤波器57以能够照明多条线的方式进行配置。
[0042]可以采集荧光信号，例如每次测定30-60S。为了评估测定的总背景，在测定之前和/或测定时(例如5s)可以将所述激光关闭。
[0043]可以按照和ID-FCS中相同的程序进行二维的(2D)-FCS测定。为了照明FCS照相机58的EM-CXD芯片的20条线，可以调节空间滤波器57。然后在随后的曝光间隔之间将所述相应的20条线转移至例如存储区，然后再将其转换、放大和转移至帧捕捉卡作为单个帧。这里，当使用20条具有340个像素的线的帧尺寸时,使用本技术可以达到例如700 μ s的时间分辨率。至于1D-FCS，在每次测定开始时或在进行每次测定时可以用例如5s来确定信号的总背景。(图像的时间序列或2D波动曲线记录如图1d和图4g所示)。
[0044]尽管在上述实施例中参照图1和图2对具有成像照相机48的成像光路40和分开的具有FCS照相机58的FCS光路50进行了说明，但也可以使用具有同时用于FCS和成像的单个照相机或成像装置的复合成像及FCS光路。翻转镜45可以被省略。
[0045]在使用例如配备有Η)300检测器的Nova II功率计(Ophir Optronics公司，耶路撒冷，以色列)的照明透镜的焦平面上，能够测定用于FCS成像的激光功率。在1D-/2D-FCS的活体内实验的典型的实施例中，所述光片22的焦点激光强度可以在几个kW.cnT2的范围内。这对应于典型用于常规共焦FCS设备的焦点强度的下限。因此，用于在共焦设备中进行一个FCS测定的强度能够进行例如20次测定(沿着20个像素)。因此，除了避免失焦照明外，与通常的共焦FCS设备相比，所述光垫显微镜I还在这个实施例中提供了高至少约20倍的效率。
[0046]此外，所述照明物镜21的轴向扫描和通过所述检测扫描模块56或所述检测空间滤波器/狭缝573的同步扫描进行的检测区域的同步扫描，能够在所述检测物镜41的视野内扫描所述光垫10。或者可以扫描柱面透镜23以达到同样的效果。或者，例如通过用空间光调制器例如具有可调节的曲率的镜代替镜25来进行的光束的受控的准直/不准直也可以被应用，以实现对光垫10的同样的轴向扫描。
[0047]FCS照相机58的每个像素收集从光垫10中相应的观察体积元(volume element)发射出的光(图lb)。当单个的荧光分子如GFP-标记的蛋白质在所述光垫10中进行例如由扩散驱动的穿过单个体积元的移动时，所述荧光分子产生时空浓度(和荧光)波动。使用EM-CCD芯片作为FCS照相机58，可以以高的时间分辨率和单光子灵敏度记录这些波动。对于体积元的每一个体，每个像素的强度时间追踪的时空相关性分析(图1c)提供了关于荧光分子流入和流出运动的频率和速度的统计信息(图ld-f)。在校准时，这种信息被转变为例如蛋白质浓度和如在可溶性分子的情况时的扩散系数等蛋白质迁移率的空间解析图。
[0048]光垫显微镜I的光学性质是这样的:所述光垫显微镜I产生衍射极限的光垫，该光垫沿着照明轴向的长度例如是约4μπι，提供多个接近共焦的单体积元的阵列(参见图lb、图3a-3c和图4)。所述光垫10的宽度是可通过在照明光路20中的狭缝27进行调节的。FCS照相机58的像素可以例如将最大可用的光垫区域3.8x65 μ m2(图4a)细分为20条340像素的线，但也可以进行其它的细分。观察体积总计为约0.31fL，并对应于几乎各向同性的点扩展函数(PSF)(图4e-h)。所述观察体积的尺寸是由所述光片22的厚度和所述检测物镜41的横向分辨率所决定，所述光片22的厚度可以为约0.7 μ m (沿着z轴向Ι/e2)或小于0.7μπι。这样产生比标准的共焦显微镜大例如约1.6倍的观察体积(图41-1)。
[0049]可以将所述光垫显微镜I构建在垂直竖立的试验板7上，如图1a和图2所示。这种设备的垂直配置具有的附加的优点是:垂直配置使得能够使用常规皮氏培养皿82 (不需要3D细胞培养或将样品埋入凝胶，例如琼脂糖中)，所述常规皮氏培养皿具有例如60_直径，装满直接浸没2个物镜的培养基(图Sib、图2)。垂直配置还避免了由于空气-玻璃、玻璃-培养基或培养基-琼脂糖界面的折射率的变化所导致的光学像差，这样的光学像差可能会在使用具有用于照明的干燥物镜的常规光片显微镜配置时遇到。为了使所述样品8进行自由运动，皮氏培养皿82可以被固定在三轴的机动平台84上(例如:步进电机:能够以50nm 的精确度定位样品 8 的 LN-Mini23manipulator block XY 和 LN-Mini Z vario, CellBiology Trading/Luigs&Neumann)。
[0050]可以将光垫显微镜I设计成:在装配有物镜61的可选的常规倒置显微镜6 (例如Olympus 1X70)的帮助下能够从底部(如果使用了皮氏培养皿的话，例如透过皮氏培养皿的玻璃底)观察所述样品8。例如可以使用长工作距离的干燥物镜，例如20x/0.4NA的透镜。为了应用的需要，本领域技术人员可以选择最好的透镜。由于它的更大的视野，倒置显微镜6使得能够更容易地和更快地对光垫中生物试样8中更大的试样进行定位或迅速选择适合FCS的培养细胞。在试样定位时，为了对它们进行观察，可以使用透射光照明，例如使用置于皮氏培养皿82之上的白光发光二级管。
[0051]可选择地，在所述倒置显微镜6上可以采集标准共焦荧光图像、图像堆栈和FCS数据，例如如果使用了共焦激光扫描显微镜(例如装配有HCX PlanApo CS63x/l.2NA水浸物镜的Leica TCS SP5A0BS SMD FCS)。为了激发，可以使用Ar激光的488nm线或另外的激发波长。可以使用用于成像的光电倍增管和用于成像和/或FCS的雪崩光电二极管(例如SPCM-AQR-14, Perkin-Elmer Optoelectronics公司)检测突光。在这个具体实施例中，检测小孔的直径可以固定在I艾里斑。样品8中的激光功率远低于用于FCS的约200μ W且低于在物镜前面所测定的用于共焦激光扫描显微镜(CLSM)采集的500 μ W。为了采集FCS数据，将入射光束60置于先前所采集的图像中的所关心的位置，启动30-60S的激光照明和检测器读出。
[0052]图4a显示了在Alexa488溶解在水中的情况下，用成像照相机(z轴是视图方向)成像的和通过照明可视化的照明光片。虚线区域凸显了光垫10，在这个具体实施例中，光垫10被调节至3.8x65 μ m2的区域，光片22是足够薄的以提供足够小的单个的观察体积元(图lb)。为了表征所述光片的厚度，可以将水平镜放置在装满水的皮氏培养皿82的中心，并将皮氏培养皿82连同水平镜一起定位在照明物镜21和检测物镜41两者的焦平面中，以将光片22直接反射至检测物镜41内，如图4b所示。在将分色镜44和发射滤波器47从所述第一检测光路40中移出之后，用成像照相机48对光片22的焦截面进行成像。得到的图像如图4c所示。用高斯函数拟合平均水平强度分布，产生了 700±10nm的Ι/e2时的全宽(图 2d)。[0053]通过分析直径为20nm的单个荧光微球的图像堆栈(参见图4e的轴定义)，表征了总的PSF。根据3D高斯函数对微球的图像堆栈的拟合(图2f)，可以使用370±20nm的横向(x-y) Ι/e2半径和410±40nm的轴向(z) Ι/e2半径,这意味着PSF是几乎各向同性的，具有0.31fL的单个观察体积。通过表达与GFP融合的膜蛋白Pmal的酵母细胞(图4g_h)，对从3D堆栈中提取的横向和轴向强度分布进行了比较，确认了 PSF的各向同性剖面。
[0054]图4i_l显示了使用装配有1.2NA水浸物镜且用于共焦FCS的Leica SP5共焦显微镜所表征的相同微球的直接比较。按照同样的方案，获得了 240± IOnm的横向Ι/e2半径和600±20nm的轴向(z) Ι/e2半径，即PSF是明显更加各向异性的，具有0.19fL体积。总的来说，光垫显微镜的PSF是各向同性的，并比标准的共焦显微镜的PSF大大约1.6倍，因此小到足以使得能够进行FCS测定。此外，与常规的光片显微镜相比，光垫显微镜I使得能够对样品8进行各向同性的3D成像，而不需要通过旋转样品或图像反卷积而从不同的方向对样品进行成像。
[0055]图5显示了体外的1D/2D-FCS记录的实例。在这个应用例中，所述光垫显微镜I被用于体外荧光样品的FCS。对作为样品8的具有20nm直径的FluoSphere荧光微球的1D-FCS数据进行了记录。图5a显示了 250个单独的自相关性函数(ACFs)，这些函数是从沿着插图中所示的虚线的ID-FCS记录中计算出的。所述荧光微球趋向于形成非均质聚集体，这在图像的原始数据中是清楚可见的(图5a中所示的插图中的亮点)并造成了各ACF的明显振幅和衰减的非均质性。因此，在从强度时间追踪中除去对应于聚集体的尖峰(spikes)之后，获得图5a中所示的ACF。当进行接近表面的ID-FCS记录时，在皮氏培养皿82的底部，观察到了荧光微球的纯布朗运动，然而在液滴的中心，能够观察得到的运动主要是对流。滤过聚集体的FCS数据的质量允许我们区分两种输送模式:ACF (图5b)能够用单组分异常扩散模型拟合，(使用下面定义的方程(2))，分别获得不同的异常参数1.0和1.85，前者表示纯扩散，而后者是定向运动，这一点正如根据能够在电影中看到的大聚集体的运动所预期的那样。
[0056]为了显示光垫显微镜I的性能以及验证所测的规格，图5c显示了关于Alexa488溶液在蒸馏水中扩散的ID-FCS记录。60个单独ACF显示在图5c中，由图5d中所标记的像素范围得到的记录仅显示了振幅和时间依赖性上的微小变化。用单组分自由扩散模型拟合ACF,之前测定的410nm的轴向焦半径和通过互相关分析(参见下文和图5e)独立确定的320 μ m2s_1的扩散系数能够取得(retrieval )490±30nm的有效横向焦半径(图5d)。为了比较，我们计算了理论上的期望值:由于我们将3像素合并(3-pixel binning)应用到数据中(图5f)，所以我们将3xl90nm长的矩形检测剖面和如上面所测定的具有370nm的1/e2半径的高斯函数卷积，以获得有效检测剖面，该有效检测剖面能够很好地拟合于具有500nm的Ι/e2半径的高斯函数，与实验结果有很好的一致性。包括合并(binning)的有效焦体积是0.57fL。从拟合中获得的分子数目能够被转化成浓度分布曲线(图5d)，其沿着线几乎是保持不变的，使得能够很好地取得所使用的荧光团浓度。因此，Alexa488的ID-FCS以独立的方式，充分确认了基于成像的PSF测定。
[0057]除了计算的ACF夕卜，可以将空间互相关性作为像素间距离的函数如图5e_f所示，并通过为0-4的像素距离的CCF全局地拟合方程(2)进行计算，我们获得了作为独立的拟合参数的SZOilOym2S4的扩散系数。
[0058]图6显示了细胞培养基的折射率对聚焦所述光片22的影响。为水设计的物镜在具有不同于水的折射率的介质中工作时，预期会导致光学像差。考虑到能够与所述光垫显微镜I 一起使用的物镜21和41的长工作距离，即使微小的差异也可能显示出不能忽略的影响。为了评估此差异对用光垫显微镜I从1D-/2D-FCS记录所获得的数据的影响，我们观察了，使用溶解在水中或溶解在具有不同的折射率的缓冲液中的Alexa488时，光片22的光束束腰的位置(参见图6a-b)。当用足够高的强度进行照明时，由于接近照明焦点处的荧光团饱和，照明光束的束腰可能被识别成黑暗狭窄的区域。这种效应能够被用来精确地确定所述光垫10的位置。当使用磷酸盐缓冲液(PBS)代替水时，能够观察到光垫10朝向照明物镜21的4.5 μ m或0.14%工作距离的位移(参见图6b)。这个结果说明了生长介质的折射率已被考虑到，以及所述系统需要通过所述检测物镜的合适的再聚焦和再定位而进行相应的调节。 [0059]图6c显示了溶解在水、IxPBS和具有Ca2+的IxPBS中的浓度为250nM的Alexa488的ID-FCS ACF。用单组分自由扩散模型拟合ACF，当与水进行比较时，PBS和PBS/Ca2+产生的振幅分别明显降低了 48%和64%。相反，对于扩散相关时间，当与水进行比较时，观察到PBS和PBS/Ca2+分别仅较小地相对增加了 9%和13%。扩散相关时间的不同可能要归结于水和PBS的不同的黏度(在25°C时分别为0.99和0.89mPa s) ； [12，13]。这表明介质的折光率的不同对焦半径没有影响，并表明了降低的振幅是增加的失焦信号所致。为了说明球面像差对振幅的影响，我们对数据拟合中获得的浓度值，应用了校正系数，在PBS中的活体内测定的校正系数为0.52，在PBS/Ca2+中的活体内测定的校正系数为0.36。
[0060]数据处理分析
[0061]以下提供了可以与本公开内容一起使用的用于数据处理和数据分析的实施例。本领域技术人员应当理解，根据待研究的参数，也可以使用其它的数据处理和数据分析方法。可以在本公开内容中使用已知的用于荧光分子(或荧光微粒)扩散的数据处理和数据分析方法。
[0062]对于ID-FCS和2D-FCS测定的每个像素，在减去整个采集时间的最初5s或另一部分获得的数据作为背景信号之后，以及按前面所述地将像素灰度值转化为光电子数目之后，能够从图像文件中提取出来自线y中的像素X的强度时间追踪Fx，y(t)。从得到的荧光强度追踪以及共焦FCS测定，可根据下式计算自相关函数(ACF)和互相关函数(CCF)。
[0063]
[0064]with
[0065]SFxJt) = FxJt) 一 (FxJt)) and {...) = I/T^df
[0066]可利用滑动平均法校正例如由于光致漂白造成的缓慢变化。所得到的ACF和CCF可通过用例如Matlab软件(The Mathfforks公司),利用含以下通用模型函数的非线性最小二乘法Levenberg-Marquardt算法，进行拟合。
【权利要求】
1.显微镜，其具有用于照明样品(8)的照明光路(20)和至少一个用于观察所述样品(8)的观察光路(40，50)，所述显微镜包括在所述照明光路(20)中的照明光路聚焦装置(23)，所述照明光路聚焦装置(23)限定基本上二维的物体照明区域(22)，所述物体照明区域(22)沿着所述照明光路(20)的照明方向和其垂直方向延伸，和 在所述照明光路(20)中的照明区域界定装置(27，29)，所述照明区域界定装置(27，29)用于有选择地照明所述基本上二维的物体照明区域(22)的一部分(10)，其中所述基本上二维的物体照明区域的该部分(10)在所述照明方向和所述垂直方向中的至少一个方向上被界定。
2.如权利要求1所述的显微镜，其中，所述照明光路聚焦装置(23)包括柱面透镜(23)、畸变成形透镜、一维阵列的球面透镜或一维阵列的非球面透镜中的至少一个。
3.如权利要求1或2所述的显微镜，其中，所述照明光路聚焦装置(23)包括至少一个畸变成形反射镜。
4.如上述任一项权利要求所述的显微镜，其中，所述照明区域界定装置(25)至少包括第一孔(29)，所述第一孔(29)用于在所述照明方向界定所述基本上二维的物体照明区域(22)的所述部分。
5.如上述任一项权利要求所述的显微镜，其中，所述照明区域界定装置至少包括第二孔(27)，所述第二孔(27)用于在所述照明方向的垂直方向上界定所述基本上二维的物体照明区域的所述部分。
6.如上述任一项权利要求所述的显微镜，其中，所述照明区域界定装置(23，27)包括光束整形器。
7.如上述任一项权利要求所述的显微镜，其中，所述至少一个观察光路(40，50)的观察方向是与所述照明方向和所述基本上二维的物体照明区域(22)基本垂直的。
8.如上述任一项权利要求所述的显微镜，其进一步包括在检测光路(50)中的可调节的检测孔(573)，所述可调节的检测孔(573)能够在一维或二维上减小有效观察区域。
9.如权利要求8所述的显微镜，其中，所述基本上二维的物体照明区域(22)的所述部分(10)和所述有效观测/观察区域是一致和/或重合的。
10.如权利要求9所述的显微镜，其中，所述基本上二维的物体照明区域(22)的所述部分(10)和所述有效观测/观察区域能够一致地和/或重合地移动穿过所述样品(8)。
11.如上述任一项权利要求所述的显微镜，其进一步包括用于照明和观察布置在所述样品照明区域的样品(8)的附加物镜(61)。
12.如权利要求11所述的显微镜，其中，所述附加物镜(61)是荧光显微镜(6)的部件。
13.如权利要求11或12所述的显微镜，其中，所述附加物镜(61)是倒置显微镜(6)的部件。
14.检测样品的方法，所述方法包括: 通过将照明光束(20)聚焦至基本上二维的物体照明区域(22)，以照明样品的二维部分，所述基本上二维的物体照明区域(22)在所述照明光束(20)的照明方向和其垂直方向上延伸； 其中，照明所述二维部分进一步包括，对所述基本上二维的物体照明区域(22)进行界定，以有选择地照明所述基本上二维的物体照明区域(22)的部分(10)，其中，所述基本上二维的物体照明区域的所述部分至少在所述照明方向上被界定。
15.如权利要求14所述的方法，其进一步包括在观察方向上观察所述基本上二维的物体照明区域，所述观察方向基本上垂直于所述照明方向。
16.如权利要求14或15所述的方法，其进一步包括移动所述基本上二维的物体照明区域(22)或所述基本上二维的物体照明区域的所述部分(10)中的至少一个而穿过所述样品(8)。
17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其进一步包括在所述基本上二维的物体照明区域的所述部分(10)中测定信号波动。
18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其进一步包括测定用于校准的荧光强度对比。
【文档编号】G02B21/36GK103649813SQ201280008835
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年2月14日 优先权日:2011年2月14日
【发明者】麦克尔·克诺普, 马尔特·瓦克斯穆特, 热雷米·卡普拉德 申请人:欧洲分子生物学实验室(Embl)