显微镜和用于选择性平面照明显微术的方法
【专利摘要】本发明涉及显微镜，该显微镜包括：照明装置，该照明装置包括照明光源(3)和用于以光片照亮样本(1)的照明光路；用于检测从样本(1)辐射出的光的检测装置；成像光学器件，该成像光学器件将样本(1)通过成像光路中的成像物镜(7)至少部分地在检测装置上成像，其中光片在成像物镜(7)的焦点中或在成像物镜的几何焦点附近的限定平面内基本上是平的，并且其中成像物镜(7)具有以非零角度与光片的平面相交的、优选地与光片的平面垂直相交的光轴，其中在照明光路中提供了通过如下方式作为Sinc空间过滤器起作用的幅度和/或相位滤波器，即该Sinc空间过滤器在至少一个空间方向上通过对于出现的空间频率以sinc函数滤波来限制照明光，和/或在至少一个空间方向上通过sinc滤波器函数对于照明光的相位和幅度进行限制，和/或在照明光路中提供了组合的幅度和相位滤波器，所述组合滤波器通过以sinc滤波器函数影响照明光分布的传输率进程来进行光片的成形。
【专利说明】显微镜和用于选择性平面照明显微术的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及显微镜，所述显微镜包括用于将样本在检测器上成像的成像物镜以及 用于在成像光学器件的焦平面内或在此焦平面附近限定的平面内以光片照亮样本的机构。 用于照明的机构包括辐射出相干光的照明光源。
【背景技术】
[0002] 其中照明光路和检测光路基本上相互垂直布置并且其中以光片在成像光物镜的 焦平面内、即垂直于其光轴照亮样本的显微镜，被构造为用于根据选择性平面照明显微术 (SPM)的方法来检查样本。与其中三维样本在各个不同的深度的平面内被逐点扫描并且其 中然后将所获得的图像信息组合为样本的三维图像的激光扫描共聚焦显微术（LSM)的差 异在于，SPIM技术基于宽场显微技术并且实现了基于通过样本的各个平面的光学截面对于 样本进行图像图示。
[0003] SPM技术的优点包括：以更高的速度进行图像信息记录，生物样本的褪色的风险 更低，以及焦点在样本内的更扩大的侵入深度。
[0004] 原理上，在SPM技术中，以激光激励包含在样本中的或引入到样本中的荧光团， 这形成了所谓的光片。以此光片分别将样本的深度内的选择的平面照亮并且以成像光学器 件获得具有光截面形式的此样本平面的图像。基本上与此使用静态光片的激励等价的是薄 的旋转对称的激光束在成像物镜的焦平面内的快速往复运动。因此，有效地，即在观测的时 间段内以时间平均的方式实现了光片的形状。
[0005] SPIM技术例如在如下文献中描述：Stelzer等人的Optics Letter 31,1477(2006)，Stelzer 等人的 Science 305, 1007 (2004)，DE 10257423A1 和 TO 2004/0530558A1。
[0006] 在图1中首先图示了 SPM显微镜的基本结构。照明光源1的光通过照明光学器 件2成形为光片并且偏转到样本3上。样本和光片处于成像物镜4的焦平面内。成像物镜 4的光轴垂直于如下方向，样本3从该方向被照亮。照明光学器件2通常包括多个光学元 件，所述光学元件将照明光源1的相干光准直并且由此形成光片。在现有技术中，照明光学 器件2通常也包括多个柱透镜，所述柱透镜的平的侧指向样本并且其隆起的侧指向照明光 源。在下文中将解释照明光学器件2的多个示例，以所述照明光学器件2可产生与现有技 术中已知的设备相比带有高景深和小阴影的光片。
【发明内容】
[0007] 问题提出
[0008] 希望的是如下光分布（光片），即所述光片在一个方向（y方向）上的伸展小于 1 μ m，但在另外两个方向上尽可能宽地伸展，其中在y方向上在光片上方和下方应无光。在 光片的上方和下方的此光将干扰从观测方向（y方向）的测量。
[0009] 目前已知的解决方案
[0010] a)干涉图案可在y方向上是薄的并且原理上在X和z方向上理论上无限地伸展， 但干涉图案在y方向上周期地延续，使得很多的光处于光片外。
[0011] b)贝塞尔光束（DE 10 2007 063 274 Al)可理论上在z方向上无限地伸展，在y 方向上具有希望的直径，但又有很多的功率在y方向上处于光束外；如果在X方向上扫描贝 塞尔光束，则虽然得到了光片，但使得很多的光功率处于与希望的平面上方和下方。
[0012] c)使用柱透镜的直线聚焦：使用柱透镜可产生在X方向上的聚焦；如果通过散焦 在z方向上扫描光束，则也可实现光片。
[0013] 柱透镜由入射的准直激光束形成在X方向上的直线聚焦（在柱透镜后方的距离f 处）。所述直线聚焦可在z方向上移动（例如通过以可移动透镜或SLM改变焦距f来实现 散焦）。此直线聚焦当然具有很小的在z方向上的伸展（DOF?λ/NA 2, DOF=景深），其中 在y方向上的直线聚焦越细则该伸展越小。
[0014] 例如，NA = 5 -在 λ =〇· 488 μ m 时，有 DOF ?λ /NA2?2 μ m
[0015] 以上的解决方案的缺点是单光束的小伸展，或要求必须扫描光束。此外，在贝塞尔 光束的情况中在y方向上并且在X直线聚焦的情况中在z方向上具有很多的光，这可能使 得样本褪色。另外的目的因此是放大光聚焦的伸展。
[0016] 本发明的特征在于独立权利要求的特征。优选的扩展是从属权利要求的对象。权 利要求详细地在本发明的公开中论述。本发明涉及用于"SPIM"显微术的显微镜，以及所属 的显微技术方法，以及用于显微镜的运行方法，以及在权利要求中阐述的Sinc滤波器和马 修光束的用于SPIM显微术的有利的使用。
[0017] 为此，根据本发明给出如下建议：
[0018] 通过限制光的频谱中的z分量获得在z方向上传播不变的或良好限定的分布。每 个z分量通过"传播"经历了另外的相移，因此有利的是以滤波器函数限制频谱的z分量。 特别地建议作为z方向上的滤波器函数使用Sinc(Z)函数。
[0019] 原理上也可构思另外的函数，例如Sine (z) ~2函数，但Sinc函数提供的优点是在 z方向上实现（理想化的）恒定的轮廓。
[0020] 当然，可进一步优化精确的滤波器函数，Sinc函数在此应特别地有利地用作在Z 方向上在大的范围内实现了在轴上的近似恒定的光束轮廓的函数。
[0021] 直线聚焦的伸展因此根据本发明可在z方向上通过柱透镜前方的Sine (z)滤波器 放大。Sinc(z)滤波器为此变换到y方向上并且实现为y方向上的滤波器。为此，当然要求 相对构建复杂的滤波器，因为Sinc函数具有正值和负值。单纯的幅度滤波器对于传输率可 以仅取正值。滤波器的传输率的负值对应于为λ/2的相移。以附加的例如λ/2的相移也 可实现对于传输率的负值。在X方向上滤波器函数可以是恒定的。
[0022] 图2示出了对于复数滤波器的理论上理想的传输曲线的这种示例。图中示意性地 图示了准直的激光束LK，所述激光束LK穿过布置在所使用的光学器件的光瞳内的空间滤 波器F并且在幅度和相位上受到该空间滤波器影响。相应的空间光分布作为调制激光束ML 示意性地图示。
[0023] 在此首先刻画了空频滤波器sine ( V ζ)。
[0024] 柱透镜ZL和所生成的光片LB在照明方向上跟随。Sinc(Vz)有利地对应于通过 Ewald方程在V ζ方向上放缩的Sinc，其零位置在V ζ= 〇处（轴线上）。因此在y轴上投 影的sine ( V z)导致在z方向上的伸展。
[0025] 在V y轴投影的sine ( V z)当然在y方向上仍非理想地限制光束轮廓。在y方向 上投影的sine ( V z)因此例如与sine ( V y)(通过乘法）叠置；此sine ( V y)导致光片在y 方向上被限制，而在V，由投影的sine (V z)导致光片在一定的z距离上保持恒定。
[0026] 两个Sinc函数相互影响；小的y伸展要求拉伸的sinc(vy)，这如在该示例中示出 那样应该大约对应于投影的sine ( V z)。
[0027] 在该示例中，因此可达到DOF?8 μπι。另外的示例在下页中阐述。
[0028] 在另外的示例中，作为使用基本上沿X轴恒定地形成的柱形光学器件来构成光片 的替代，光片也可使用带有例如球面的常规的旋转对称的光学器件来构成。在ζ方向上的 滤波器函数（Sinc(V z))作为旋转对称的函数在x-y平面内投影并且与在1和7上的一个 或两个另外的滤波器函数相乘，以获得在y方向上的希望的限制和在X和ζ方向上的希望 的伸展，即例如与在y方向上的很宽的sine ( V y)相乘以用于在y方向上薄的光片以及与 在X方向上的很窄的Sinc(Vx)相乘以用于在X方向上的大的伸展。
[0029] 在图3中示例地在沿图2的Y轴，沿Y/Ζ截面的横截面中图示了由三个滤波器函 数（X，y，ζ)叠置的幅度分布A。
[0030] 以此方式令人惊奇地也可在不使用如所图示的柱透镜的变形光学器件的情况下 实现伸展的直线聚焦，其焦距在Z方向上为10 μm而厚度在y方向上大致为1 μm(波长 0· 488 μπι) (100μηιΧ10μηιΧ1μηι，ΧΧΥΧΖ)〇
[0031] 此外，可实现100 μπιΧ 100 μηιΧ4 μπι的光片（宽度χ乘深度ζ乘在y方向上的厚 度）。
[0032] Sinc函数简单地叠置地处在轴线上（零角度）并且相互"干扰"，即带有更小的宽 度的各Sinc函数更占优（也见图3)。
[0033] 为了将Sinc函数相互分离，即传输尽可能多的频率信息，可在物镜光瞳内离轴地 设置滤波器，理想地在尽可能大的孔径下（例如，在物镜中NA = 0.85至NA= 1)。因此，令 人惊奇的是可实现厚度更低的光片，例如IOOymXlO μ mX 2 μ m(x乘y乘ζ)。当然，Sinc 函数的零点在照明光学器件的光瞳内可自由选择。
[0034] 带有在y方向上的Ιμπι的直径的更小的光片也是可以的（例如，在0.5 μπι的波 长情况下1〇μπιΧ100μπιΧ1μπι，ΧΧΥΧΖ)。特别地，可使用新的滤波器生成带有大的侧向 伸展同时带有在y方向上的低厚度和在y方向上在光片外更少的光的光片，所述光片比现 有技术中已知的光片明显更好，例如在X或ζ方向上是高斯光束的至少两倍的尺寸，或在y 方向上在光片外比贝塞尔光束或双光束干涉图案具有至少小十倍的光强度。
[0035] 光片也可在ζ方向上以及在X方向上走向（根据滤波器在光瞳内的位置）。这使 得布置特别地灵活。
[0036] 光片可使用相位函数调制，以使其在x、y和ζ方向上移动（聚焦或移动）。因此， 光片可例如也使用SLM(空间光调制器）而通过空间运动（扫描）。此SLM单独地或与幅度 滤波器组合地使用，并且导致光片的移动，例如在y方向上的移动。因此，对样本的共焦扫 描可以以例如来自y方向的观测光束实现。
[0037] 此外可将多个Sinc~3滤波器并且因此将多个光片并列或叠置布置。因此，光片面 积可扩大或例如对于STED在激励区域的边沿上刺激出附加的去激励。
[0038] 光片可调制（结构化），这通过例如将两个Sinc~3滤波器引入到光瞳内而无散焦 或相移来实现。因此，可自由调节调制频率。所形成的干涉场可用于SM(ZEISS Elyra S. 1) 或类似的带有结构化照明的方法。光片厚度可进一步降低（例如，〇.7μπι)，其中光片的伸 展更低。
[0039] 数学公式和宙义
[0040] SINC 函数
【权利要求】
1. 一种显微镜，包括： 〇成像光学器件，所述成像光学器件通过成像物镜（7)在第一方向上接收从样本（1) 以第一孔径角度辐射出的光， 〇检测装置，用于检测从样本（1)以第一孔径角度辐射出的、以成像光学器件接收的 光， 〇照明装置，包括带有波长A的照明光源（3)和用于以在第二方向上的照明光分布照 亮样本（1)的照明光路，其中，第二方向基本上垂直于第一方向， 其特征在于，所述照明装置具有机构，使得： 〇在第二方向中的截面（LZ)内，照明光分布基本上恒定， 〇在由第一孔径角度张成的锥形内，在第一方向上的伸展（LY)的区域外，照明光的功 率小于20%，其中： LY〈2 入， LZ>8 入。
2. 根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述机构包括复数滤波器，所述复数滤波器将 到照明装置的光瞳内的光分布限制在基本上圆形的区域内。
3. 根据权利要求2所述的显微镜，其中，滤波器产生在照明装置的光瞳内由至少两个 Sine函数的叠置形成的照明光分布。
4. 根据权利要求3所述的显微镜，其中，两个Sine函数对应于根据Ewald方程投影到 一个平面内、优选地到X-Y平面内的Sine (z)函数。
5. 根据前述权利要求中任一项所述的显微镜，其中，滤波器产生在照明装置的光瞳内 对应于马修光束的频谱的照明光分布。
6. 特别地根据前述权利要求中任一项所述的显微镜，包括： -照明装置，包括照明光源（3)和用于以光片照亮样本（1)的照明光路， -检测装置，用于检测从样本（1)辐射出的光， _成像光学器件，所述成像光学器件将样本（1)通过成像光路中的成像物镜（7)至少部 分地成像到所述检测装置上， -其中，光片在成像物镜（7)的焦点中或在成像物镜的几何焦点附近的限定平面内基 本上是平的，并且其中，成像物镜（7)具有以非零角度与光片的平面相交的、优选地垂直相 交的光轴， -其中，在照明光路中提供了通过如下方式作为Sine空间过滤器起作用的幅度和/或 相位滤波器，即，其在至少一个空间方向上通过对于出现的空间频率以sine函数滤波来限 制照明光， 和/或在至少一个空间方向上通过sine滤波器函数对于照明光的相位和幅度进行限 制， 和/或在照明光路中提供了组合的幅度和相位滤波器，所述组合滤波器通过以sine滤 波器函数影响照明光分布的传输率进程来进行光片的成形。
7. 根据前述权利要求中至少一项所述的显微镜，其特征在于， 幅度和/或相位滤波器至少部分地布置在照明光学器件的光瞳平面内或其附近， 和/或滤波器通过全息图（CGH)和/或衍射光学器件实现， 和/或滤波器至少部分地通过用于光的空间调制器（空间光调制器（SLM))形成， 和/或以SLM实现光片垂直于光方向的移动， 和/或成像物镜的焦平面在光片移动时移动， 和/或在光瞳平面中产生非对称的Sine函数/离轴分布， 和/或提供相对于光轴在轴外起作用的sine滤波器， 和/或提供多个Sine滤波器的叠置以用于光片结构化， 和/或提供通过Ewald方程放缩的sine函数作为滤波器函数， 和/或在照明光路中进行滤波器与变形光学器件的组合以用于光束成形。
8. -种用于运行根据前述权利要求中至少一项所述的显微镜的显微镜方法或方法。
9. 一种显微镜，包括： -照明装置，包括照明光源（3)和用于以光片照亮样本（1)的照明光路， -检测装置，用于检测从样本（1)辐射出的光， _成像光学器件，所述成像光学器件将样本（1)通过成像光路中的成像物镜（7)至少部 分地成像到检测装置上， -其中，光片在成像物镜（7)的焦点中或在成像物镜的几何焦点附近的限定平面内基 本上是平的，并且其中，成像物镜（7)具有以非零角度与光片的平面相交的、优选地垂直相 交的光轴， 其特征在于，使用马修光束在SPIM中产生光片。
10. 根据前述权利要求中至少一项所述的显微镜，其特征在于，使用扫描的马修光束在 SPM中产生光片。
11. 特别地根据前述权利要求中任一项所述的显微镜，包括： -照明装置，包括照明光源（3)和用于以光片照亮样本（1)的照明光路， -检测装置，用于检测从样本（1)辐射出的光， _成像光学器件，所述成像光学器件将样本（1)通过成像光路中的成像物镜（7)至少部 分地成像到检测装置上， -其中，光片在成像物镜（7)的焦点中或在成像物镜的几何焦点附近的限定平面内基 本上是平的，并且其中，成像物镜（7)具有以非零角度与光片的平面相交的、优选地垂直相 交的光轴， 其特征在于， 以强度调制器和/或相位调制器产生马修光束，特别是通过如下光学元件的至少一个 产生马修光束： 1) 部分环形光圈，特别是由两个对置的半圆形组成的光圈； 2) 通过用于光的空间调制器（空间光调制器（SLM)); 3) 轴棱锥； 4) 全息图； 5) 衍射元件。
12. 根据前述权利要求中至少一项所述的显微镜，其特征在于， 在环形光圈前产生椭圆高斯分布， 和/或在环形光圈前产生高斯分布，其中环形光圈的上部分和下部分不被施加以光， 和/或通过变形光学器件和/或如SLM的强度调制器进行光束成形， 和/或在轴棱锥上产生椭圆高斯分布， 和/或在轴棱锥上产生高斯分布，其中轴棱锥的上部分和下部分不被施加以光， 和/或使用强度调制器以优化光分布， 和/或将变形光学器件和强度调制器组合以优化光分布， 和/或抑制马修光束的频率分量以避免射线的周期性强度调制， 和/或产生结构化的照明， 和/或在平面检测器上，特别是CCD接收器或EMCCD接收器上或CMOS或sCMOS照相机 上进行逐行检测， 和/或在平面检测器上进行面相关的检测，其中检测的面小于平面检测器的整个检测 面。
13.用于运行根据前述权利要求中至少一项所述的显微镜的显微镜方法或方法。
【文档编号】G02B27/09GK104428706SQ201380034258
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2012年7月2日
【发明者】J.西本摩根, W.辛格, T.安哈特, R.沃利申斯基 申请人:卡尔蔡司显微镜有限责任公司