一种双光子受激发射损耗复合显微镜的制作方法

本发明涉及显微光学成像技术领域，尤其涉及一种双光子受激发射损耗复合显微镜。

背景技术

光学超分辨显微术的成像分辨率超越了光学衍射限制，其成像分辨率远高于传统的光学显微镜，是近年来的研究热点，出现了多种类型。受激发射损耗(stimulatedemissiondepletion，sted)显微术是首先提出也是直接克服光学衍射极限的远场光学显微术，其建立在激光共聚焦显微成像基础上，相对于其它类型的超分辨显微术，成像速度相对较快，能够对活细胞进行成像，在生物医学研究中可以探测更精细的结构。

sted成像分辨率很高，但成像深度很浅，双光子显微成像分辨率较差，但由于采用近红外光，成像深度较深，但目前尚未给出一个集成sted成像和双光子成像两种功能的复合显微镜，对于较厚的样本可以采用双光子成像，对样本表层感兴趣的区域可以采用sted超分辨成像的技术报道。

技术实现要素：

有鉴如此，有必要针对现有技术存在的缺陷，提供一种可以实现激发光斑和损耗光斑的快速高精度合束的双光子受激发射损耗复合显微镜。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种双光子受激发射损耗复合显微镜，包括：双光子成像单元及sted成像单元；

所述双光子成像单元包括：飞秒激光器、第一反射镜、第二反射镜、由第一透镜和第二透镜组成的扩束镜、第三反射镜、第一二色镜、λ/4玻片、第四反射镜、xy扫描振镜、扫描透镜、筒镜、第二二色镜、物镜、用于放置样本的三维纳米位移台、滤光片、第五反射镜、第三透镜及光电倍增管；

所述飞秒激光器发出的飞秒激光经所述第一反射镜和所述第二反射镜反射进入到由所述第一透镜和所述第二透镜组成的扩束镜，光束从所述第二透镜出射后经所述第三反射镜反射进入所述第一二色镜，并经所述第一二色镜透射后进入所述λ/4玻片，再经所述第四反射镜反射后进入到所述xy扫描振镜，经所述xy扫描振镜出射的光束依次经所述扫描透镜和所述筒镜进入到所述第二二色镜，并经所述第二二色镜透射的光束进入所述物镜，并被所述物镜聚焦在位于所述三维纳米位移台上的样本处，样本发出的荧光经所述物镜收集后进入所述第二二色镜，并经所述第二二色镜反射后进入到所述滤光片，所述滤光片对入射的激光进行抑制并对荧光进行透射，透射所述滤光片的荧光经所述第五反射镜反射后进入到所述第三透镜，经所述第三透镜聚焦的光束进入到所述光电倍增管，实现对双光子成像荧光信号的探测；

所述sted成像单元包括：所述飞秒激光器、所述第一反射镜、所述第二反射镜、由所述第一透镜和所述第二透镜组成的所述扩束镜、所述第三反射镜、连续激光器、第六反射镜、第七反射镜、第八反射镜、相位板、所述第一二色镜、所述λ/4玻片、所述第四反射镜、所述xy扫描振镜、所述扫描透镜、所述筒镜、所述第二二色镜、所述物镜、所述用于放置样品的三维纳米位移台、所述滤光片、所述第五反射镜、第四透镜、针孔及雪崩二极管，所述第五反射镜可移出所在光路；

所述飞秒激光器发出的飞秒激光经所述第一反射镜和所述第二反射镜反射进入到由所述第一透镜和所述第二透镜组成的扩束镜，光束从所述第二透镜出射后经所述第三反射镜反射进入所述第一二色镜，并经所述第一二色镜透射形成激发光；

所述连续光激光器发出的激光经所述第六反射镜、所述第七反射镜后进入到所述第八反射镜，在经所述第八反射镜后进入到所述相位板，经所述相位板透射的光束经所述第一二色镜反射形成损耗光，且所述激发光和所述损耗光经所述第一二色镜后实现合束，合束后的光束进入到所述λ/4玻片进行偏振态调整，并经所述第四反射镜反射后进入到所述xy扫描振镜，经所述xy扫描振镜出射的光束依次经所述扫描透镜及所述筒镜tl后进入所述第二二色镜，经所述第二二色镜透射后的光束进入所述物镜，并被所述物镜聚焦位于所述三维纳米位移台上的样本处，样本发出的荧光经所述物镜收集后进入所述第二二色镜，并经所述第二二色镜反射后进入到所述滤光片，所述滤光片对入射的激光进行抑制并对荧光进行透射，所述第五反射镜移出所在光路，经所述滤光片透射后的荧光直接进入所述第四透镜，并聚焦于所述第四透镜焦点位置的针孔处，经所述针孔出射的光束进入到所述雪崩二级管中，实现对sted成像荧光信号的探测。

在一些较佳的实施例中，所述第一反射镜、所述第二反射镜、第三反射镜、第四反射镜、第五反射镜、第六反射镜、所述第七反射镜均可绕xy轴向调节角度。

在一些较佳的实施例中，绕xy轴调节所述第一反射镜和所述第二反射镜的角度，可以使飞秒激光发出的光束快速接入到显微镜系统中。

在一些较佳的实施例中，绕xy轴调节所述第六反射镜和所述第七反射镜的角度，可以使连续光激光器发出的光束快速接入到显微镜系统中。

在一些较佳的实施例中，绕x轴或y轴调节所述第三反射镜的角度，调节激发光光斑在x向或y向的位置，沿光轴z向调节所述第二透镜的位置，调节激发光光斑在z向的位置，使得激发光光斑与损耗光光斑精确重合。

在一些较佳的实施例中，所述第二透镜沿光轴z向的位置可调节。在一些较佳的实施例中，所述相位板上的相位分布为0-2π螺旋分布。

在一些较佳的实施例中，在进行双光子成像荧光信号探测时，所述xy扫描振镜对光束进行扫描移动，所述三维纳米位移台保持不动。

在一些较佳的实施例中，在sted成像荧光信号的探测时，所述xy扫描振镜不移动扫描且保持在0位，所述三维纳米位移台带动样本扫描移动实现成像。

在一些较佳的实施例中，所述飞秒激光器和所述连续光激光器可拆卸地安装于所述双光子受激发射损耗复合显微镜中。

本发明采用上述技术方案的优点是：

本发明提供的双光子受激发射损耗复合显微镜，包括：双光子成像单元及sted成像单元，对于较厚的样本可以采用双光子成像单元，对于样本表层感兴趣的区域可以采用sted超分辨成像单元，本发明提供的双光子受激发射损耗复合显微镜集成sted成像和双光子成像两种功能，为生物医学前沿研究提供了一种强有力工具。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例提供的双光子受激发射损耗复合显微镜的结构示意图。

图2为发明提供的双光子受激发射损耗复合显微镜物镜焦点处激发光斑光强分布。

图3为本发明提供的双光子受激发射损耗复合显微镜物镜焦点处损耗光斑光强分布。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，为本发明实施例提供的双光子受激发射损耗复合显微镜10的结构示意图，包括：双光子成像单元100及sted成像单元200。其中：

所述双光子成像单元100包括：飞秒激光器110、第一反射镜m1、第二反射镜m2、由第一透镜l1和第二透镜l2组成的扩束镜、第三反射镜m3、第一二色镜dm1、λ/4玻片120、第四反射镜m4、xy扫描振镜130、扫描透镜sl、筒镜tl、第二二色镜dm2、物镜ol、用于放置样本的三维纳米位移台140、滤光片f1、第五反射镜m5、第三透镜l3及光电倍增管150。

本发明实施例提供的双光子成像单元100，其工作方式如下：

所述飞秒激光器110发出的飞秒激光经所述第一反射镜m1和所述第二反射镜m2反射进入到由所述第一透镜l1和所述第二透镜l2组成的扩束镜，光束从所述第二透镜l2出射后经所述第三反射镜m3反射进入所述第一二色镜dm1，并经所述第一二色镜dm1透射后进入所述λ/4玻片120，再经所述第四反射镜m4反射后进入到所述xy扫描振镜130，经所述xy扫描振镜130出射的光束依次经所述扫描透镜sl和所述筒镜tl进入到所述第二二色镜dm2，并经所述第二二色镜dm2透射的光束进入所述物镜ol，并被所述物镜ol聚焦在位于所述三维纳米位移台140上的样本处，样本发出的荧光经所述物镜ol收集后进入所述第二二色镜dm2，并经所述第二二色镜dm2反射后进入到所述滤光片f1，所述滤光片f1对入射的激光进行抑制并对荧光进行透射，透射所述滤光片f1的荧光经所述第五反射镜m5反射后进入到所述第三透镜l3，经所述第三透镜l3聚焦的光束进入到所述光电倍增管(pmt)150，实现对双光子成像荧光信号的探测。

可以理解，在进行双光子成像荧光信号探测时，所述xy扫描振镜对光束进行扫描移动，所述三维纳米位移台保持不动。

所述sted成像单元200包括：所述飞秒激光器110、所述第一反射镜m1、所述第二反射镜m2、由所述第一透镜l1和所述第二透镜l2组成的所述扩束镜、所述第三反射镜m3、连续激光器210、第六反射镜m6、第七反射镜m7、第八反射镜m8、相位板220、所述第一二色镜dm1、所述λ/4玻片120、所述第四反射镜m4、所述xy扫描振镜130、所述扫描透镜sl、所述筒镜tl、所述第二二色镜dm2、所述物镜ol、所述用于放置样品的三维纳米位移台140、所述滤光片f1、所述第五反射镜m5、第四透镜l4、针孔230及雪崩二极管240，所述第五反射镜m5可移出所在光路；

本发明实施例提供的sted成像单元200，其工作方式如下：

所述飞秒激光器发出的飞秒激光经所述第一反射镜m1和所述第二反射镜m2反射进入到由所述第一透镜l1和所述第二透镜l2组成的扩束镜，光束从所述第二透镜l2出射后经所述第三反射镜m3反射进入所述第一二色镜dm1，并经所述第一二色镜dm1透射形成激发光；

所述连续光激光器210发出的激光经所述第六反射镜m6、所述第七反射镜m7后进入到所述第八反射镜m8，在经所述第八反射镜m8后进入到所述相位板220，经所述相位板220透射的光束经所述第一二色镜dm1反射形成损耗光，且所述激发光和所述损耗光经所述第一二色镜dm1后实现合束，合束后的光束进入到所述λ/4玻片进行偏振态调整，并经所述第四反射镜m4反射后进入到所述xy扫描振镜130，经所述xy扫描振镜130出射的光束依次经所述扫描透镜sl及所述筒镜tl后进入所述第二二色镜dm2，经所述第二二色镜dm2透射后的光束进入所述物镜ol，并被所述物镜ol聚焦位于所述三维纳米位移台140上的样本处，样本发出的荧光经所述物镜ol收集后进入所述第二二色镜dm2，并经所述第二二色镜dm2反射后进入到所述滤光片f1，所述滤光片f1对入射的激光进行抑制并对荧光进行透射，所述第五反射镜m5移出所在光路，经所述滤光片f1透射后的荧光直接进入所述第四透镜l4，并聚焦于所述第四透镜l4焦点位置的针孔230处，经所述针孔230出射的光束进入到所述雪崩二级管240(apd)中，实现对sted成像荧光信号的探测。

可以理解，在sted成像荧光信号的探测时，所述xy扫描振镜不移动扫描且保持在0位，所述三维纳米位移台带动样本扫描移动实现成像。

在一些较佳的实施例中，所述第一反射镜、所述第二反射镜、第三反射镜、第四反射镜、第五反射镜、第六反射镜、所述第七反射镜均可绕xy轴向调节角度，以使激光精确地耦合输入到显微镜系统中。

具体地，对于飞秒激光器110其发出的光束为自由空间传播，采用两个均设置有能绕xy轴调节角度的第一反射镜m1和第二反射镜m2，调节m1和m2可以使飞秒激光发出的光束快速接入到显微镜系统中；对于连续光激光器210其发出的光束为自由空间传播，采用两个均设置有能绕xy轴调节角度的第六反射镜m6和第七反射镜m7，调节m6和m7可以使连续光激光器发出的光束快速接入到显微镜系统中。

在一些较佳的实施例中，所述相位板上的相位分布为0-2π螺旋分布。

在一些较佳的实施例中，所述飞秒激光器和所述连续光激光器可拆卸地安装于所述双光子受激发射损耗复合显微镜中。

可以理解，本发明提供的双光子受激发射损耗复合显微镜采用的飞秒激光和连续光激光器体积都比较大，在显微镜运输或移动位置时这些激光器需要从显微镜中拆卸下来，为使飞秒激光和连续光激光器能快速准确接入到显微镜系统中，将所述飞秒激光器和所述连续光激光器可拆卸地安装于所述双光子受激发射损耗复合显微镜中，方便拆卸以及便于运输。

请参阅图2，为本发明提供的双光子受激发射损耗复合显微镜，物镜焦点处激发光斑光强分布(在xy面和xz面内光强分布)，激发光经过物镜后聚焦为一个呈长椭球形的实心三维光斑。

请参阅图3，为本发明提供的双光子受激发射损耗复合显微镜，物镜焦点处损耗光斑光强分布(在xy面和xz面内光强分布)，损耗光经物镜聚焦为一个呈柱体的空心三维光斑。

可以理解，sted成像需要激发光斑和损耗光斑在三维方向精确重合，以损耗光光斑位置作为参考(保持不变)，调整激发光光斑三维位置，使其与激发光光斑精确重合，绕x轴或y轴调节第三反射镜m3的角度，可以改变激发光光斑在x向或y向的位置，沿光轴z向调节第二透镜l2的位置，可以改变激发光光斑在z向的位置，从而可以使激发光光斑与损耗光光斑精确重合。

本发明提供的双光子受激发射损耗复合显微镜，对于较厚的样本可以采用双光子成像单元，对于样本表层感兴趣的区域可以采用sted超分辨成像单元，本发明提供的双光子受激发射损耗复合显微镜集成sted成像和双光子成像两种功能，为生物医学前沿研究提供了一种强有力工具。

当然本发明的双光子受激发射损耗复合显微镜还可具有多种变换及改型，并不局限于上述实施方式的具体结构。总之，本发明的保护范围应包括那些对于本领域普通技术人员来说显而易见的变换或替代以及改型。