一种用于共聚焦荧光显微镜的二维快速光束扫描模块的制作方法

本发明属于光学机械领域，涉及一种用于共聚焦荧光显微镜的二维快速光束扫描模块。

背景技术：

与常规宽场荧光显微镜不同，由于在共聚焦荧光显微镜中，为了提高系统分辨率特别是轴向切片能力，往往使用点探测器作为成像器件。因此，为了对一定视场范围内的样品进行成像，往往需要使用特殊装置实现光束聚焦光斑在样品内的扫描。在早期的系统中，聚焦光斑相对样品的扫描往往通过移动样品载物台来实现。这种方法虽然原理直观，但是扫描成像速度较慢(＜＜1fps)。因此，科学家们转而通过使用扫描镜模块改变入射激发光束进入显微物镜入瞳时的入射角来实现上述目的。同时，当扫描镜模块与落射式荧光显微镜架构(epi-fluorescentmicroscope)相结合时，利用光路可逆的原理，使用同一显微物镜收集的荧光反向通过扫描镜模块后，荧光光束将成为方向固定的准直光束，进而为位置固定的点探测器所接收。扫描镜模块由此同时具备扫描和解扫描的功能，大大简化了系统结构。

典型的扫描镜模块包括两片振动方向垂直的扫描镜。按照扫描速度的不同，这两片扫描镜往往分别被称为快轴扫描镜和慢轴扫描镜。目前可供选择的机械扫描镜主要包括电流计镜(galvanometermirror)和振镜(resonantmirror)两种。其中，电流计镜扫描的扫描频率可达到1～2khz，已经成为了慢轴扫描镜的标准选择。在原理上，为了保证图像扫描的同步，快轴扫描镜的扫描频率应等于慢轴扫描镜扫描频率与图像横向像素数的乘积。但是，目前机械扫描镜的扫描频率受到工艺的限制，即使是相对速度较快的振镜，其扫描频率也只能到达10～20khz。因此，在现实中，往往只能将慢轴扫描镜进行降速处理，限制其实际扫描频率至10～100hz。这样的技术选择无疑极大地降低了共聚焦荧光显微镜的成像速度。

为了提高成像速度，有科学家提出使用电子扫描器件取代机械扫描镜的设计思路。然而，部分以声光偏转器(acousto-opticaldeflector)为代表的电子扫描器件对入射光波长敏感，当使用于共聚焦荧光显微镜中时，非常容易发生严重的色散问题。与之对应，电光偏转器(electro-opticaldeflector)可以对很大范围内的波长产生相同的角度偏转，因而更加适用于共聚焦显微镜中。例如，j.schneider等人在2017年成功将电光偏转器应用于共聚焦扫描显身镜的快轴扫描中(参见j.schneider等，“ultrafast,temporallystochasticstednanoscopyofmilliseconddynamics”，naturemethods12，827-830，2015)。其使用的电光偏转器具有250khz的扫描频率，因而可以将慢轴的扫描速度充分加快，实现上千fps的成像速度。但是，电光偏转器是一种具有高度偏振选择性的器件。与此同时，由于荧光具有消偏振的特点，因此，当荧光光束反向通过电光偏转器时，只有50％的荧光可以被解扫描，进而为点探测器收集用于成像。为解决收集效率的问题，j.schneider提出仅通过慢轴扫描镜对荧光光束进行单向解扫描、并使用线探测器替代点探测器的技术方案。该方案虽然解决了荧光信号收集效率的问题，但是需要扩大探测器的面积，并且保证探测器摆放位置与电光偏转器光束偏转方向一致，不仅使系统更加复杂、增加了成本，同时，使用线探测器也会减弱系统过滤杂散光能力。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供了一种用于共聚焦荧光显微镜的二维快速光束扫描模块，通过使用电光偏转器加快扫描成像速度，同时在使用点探测器的前提下，保证荧光收集效率。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于共聚焦荧光显微镜的二维快速光束扫描模块，包括沿光路依次布置的电光偏转器、第一透镜、二分之一波片、第二透镜、wollaston棱镜和电流计镜；

正向入射的激发光为偏振方向垂直于纸面的线偏光，从电光偏转器左端入射进入二维快速光束扫描模块，经电光偏转器、第一透镜、第二透镜、wollaston棱镜，最后经电流计镜出射；

反向入射的荧光为非偏振光束，从电流计镜端入射，经wollaston棱镜后，按照偏振方向被分解为两个偏振方向正交的子光束：垂直于纸面的第一偏振分量沿原正向入射光光路反向传播到达电光偏转器右端，平行于纸面的第二偏振分量经第二透镜后，先经过二分之一波片旋转偏振方向至垂直于纸面，再经过第一透镜，与第一偏振分量在电光偏转器右端合束后，经电光偏转器从左端出射；

通过控制电光偏转器和电流计镜的偏转，实现二维快速光束扫描。

进一步地，所述电光偏转器、第一透镜、第二透镜、wollaston棱镜、电流计镜位于同轴光路上。

进一步地，所述电光偏转器和电流计镜通过第一透镜和第二透镜保持光学共轭关系；所述电光偏转器位于第一透镜焦平面上，所述电流计镜位于第二透镜焦平面上；所述电光偏转器、第一透镜、第二透镜和电流计镜构成一个4f系统。

进一步地，所述电光偏转器的作用是使入射准直光束产生垂直于纸面方向的偏转并扫描，偏转角度在可见光范围内保持一致，最大偏转角度大于5°，扫描频率不小于250khz。

进一步地，所述电流计镜的作用是使入射准直光束产生平行于纸面方向的偏转并扫描，最大偏转角大于10°，扫描频率在1～2khz之间。

进一步地，所述第一透镜和第二透镜均为双胶合消色差凸透镜。

进一步地，所述wollaston棱镜分解出的两个子光束的出射角之差应控制在4.5-8.5°之间。

进一步地，所述二分之一波片的直径小于30mm，工作波长覆盖400-700nm。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)结构简单，由于使用了点扫描器件，性能稳定、扫描速度快；

(2)由于收集了两个偏振态的荧光信号，所以荧光回收效率是原有设计的2倍；

(3)可以不受限制，获得多色荧光成像能力。

附图说明

图1为本发明的用于共聚焦荧光显微镜的二维快速光束扫描模块光路结构示意图；

图2为应用本发明的实施例1光路结构示意图；

图中：电光偏转器1、第一透镜2、二分之一波片3、第二透镜4、wollaston棱镜5、电流计镜6、激发光激光器7、二色镜8、反射镜9、二维快速光束扫描模块10、第三透镜11、第四透镜12、四分之一波片13、显微物镜14、载物台15、第五透镜16、单光子探测器17、样品18。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示，本发明提供的一种用于共聚焦荧光显微镜的二维快速光束扫描模块，包括沿光路依次布置的电光偏转器1、第一透镜2、二分之一波片3、第二透镜4、wollaston棱镜5、电流计镜6。

本发明中，正向入射光(激发光)为垂直于纸面的线偏光，从电光偏转器1左端入射进入二维快速光束扫描模块，经电光偏转器1、第一透镜2、第二透镜4、wollaston棱镜5，最后经电流计镜6出射。反向入射光(荧光)是非偏振光束，从电流计镜端6入射，经wollaston棱镜5后，按照偏振方向被分解为两个偏振方向正交的子光束：其中，垂直于纸面的偏振分量(第一偏振分量)沿原正向入射光光路反向传播到达电光偏转器1右端；平行于纸面的偏振分量(第二偏振分量)经第二透镜4后，先经过二分之一波片3旋转偏振方向至垂直于纸面，再经过第一透镜2，与第一偏振分量在电光偏转器1右端合束后，经电光偏转器1从左端出射。

本发明中，所述电光偏转器1、第一透镜2、二分之一波片3、第二透镜4、wollaston棱镜5、电流计镜6位于同轴光路上。

本发明中，所述电光偏转器1和电流计镜6通过第一透镜2和第二透镜4保持光学共轭关系。电光偏转器1位于第一透镜2焦平面上，电流计镜6位于第二透镜4焦平面上；电光偏转器1、第一透镜2、第二透镜4和电流计镜6构成一个4f系统。

本发明中，所述电光偏转器1的作用是使入射准直光束产生纵向(垂直于纸面方向)的偏转并扫描，偏转角度在可见光范围内(400～800nm)保持一致，最大偏转角度大于5°，扫描频率不小于250khz；优选为美国conopticsinc.生产的m311a型电光偏转器。

本发明中，所述第一透镜2和第二透镜4均为双胶合消色差凸透镜。其中，第一透镜2优选焦距为140mm，第二透镜4优选焦距为160mm。

本发明中，所述wollaston棱镜5的作用是将反向入射光(荧光)按照偏振方向分解为两个偏振方向正交的子光束，子光束出射角之差应控制在4.5-8.5°之间；优选为b.halle公司生产的pwk5.20型wollaston棱镜。

本发明中，所述二分之一波片3的作用是将反向入射光中第二偏振分量子光束的偏振方向从平行于纸面旋转至垂直于纸面方向，二分之一波片3直径小于30mm，工作波长覆盖400-700nm，优选为newport公司的10rp52-1p型二分之一波片。

本发明中，所述电流计镜6的作用是使入射准直光束产生横向(平行于纸面方向)的偏转并扫描。其中，最大偏转角大于10°，扫描频率在1～2khz之间；优选为美国scanlab公司的xs型电流计镜。

本发明具有高度通用性，可以应用于任意基于扫描共聚焦显微镜架构的成像系统。如光摄(opticaltweezers)、受激辐射光淬灭显微镜(sted)、荧光相关谱仪(fcs)等。下面仅就基于本发明的扫描共聚焦显微镜作为实施例进行说明。

实施例1

如图2所示为基于本发明的扫描共聚焦显微镜示意图，其中，电光偏转器1、第一透镜2、二分之一波片3、第二透镜4、wollaston棱镜5、电流计镜6、激发光激光器7、二色镜8、反射镜9、二维快速光束扫描模块10、第三透镜11、第四透镜12、四分之一波片13、显微物镜14、载物台15、第五透镜16、单光子探测器17构成整个扫描共聚焦显微镜系统。

本发明中，从激发光激光器7出射的准直激发光，穿过二色镜8、由反射镜9反射后，进入二维快速光束扫描模块10，而后，依次透过第三透镜11、第四透镜12、四分之一波片13，最后由显微物镜14聚焦在置于载物台15上的样品18内，并激发荧光。所激发的荧光由显微物镜14反向收集后，依次经过四分之一波片13、第四透镜12、第三透镜11后，进入二维快速光束扫描模块10，而后，经过反射镜9后，由二色镜8反射，再经过第五透镜16聚焦，由单光子探测器17收集并生成图像。

本发明中，所述的激发光激光器7的作用是提供激发光照明样品18。所述激发光波长由选用荧光标记的激发光谱决定，可以选用连续或脉冲激光器。例如：当荧光标记选用atto647n时，激发光激光器优选为中心波长为650nm的德国picoquant公司ldh-d-c-650型半导体脉冲激光器。

本发明中，所述二色镜8的作用是从混合光束中分离荧光信号并将其反射进单光子探测器17中。

本发明中，所述反射镜9的作用是折转光路。

本发明中，所述二维快速光束扫描模块10由电光偏转器1、第一透镜2、二分之一波片3、第二透镜4、wollaston棱镜5、电流计镜6构成，其光学结构和工作原理与图1所示完全相同。

本发明中，所述第三透镜11和第四透镜12保持光学共轭关系。电流计镜6位于第三透镜11焦平面上，显微物镜14的入瞳位于第四透镜12焦平面上；电流计镜6、第三透镜11、第四透镜12和显微物镜14的入瞳构成一个4f系统。其中，所述第三透镜11和第四透镜12均为双胶合消色差凸透镜。其中，第三透镜优选焦距为150mm，第二透镜4优选焦距为100mm。

本发明中，所述第五透镜16的作用是将荧光聚焦到单光子探测器17的小孔上。所述第五透镜16为双胶合消色差凸透镜，优选焦距为200mm。

本发明中，所述单光子探测器17的作用是收集荧光信号并转换为图像；可以有多种技术方案选择，如光电倍增管、雪崩式光电二极管等，优选为雪崩式光电二极管。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应视为本发明的保护范围。