大面积弧形微结构阵列芯片及其制备方法与单细胞精准力学分析方法及装置

本发明涉及大面积弧形微结构阵列芯片及其制备方法与单细胞精准力学分析方法及装置，属于细胞力学检测。

背景技术：

1、单细胞力学测量作为力学生物学的重要研究方式，可以通过力学响应变化推断细胞类型及对应的细胞生理状态，对于精准医疗发展和生命科学进步具有重要意义。原子力显微镜技术(atomic force microscopy,afm)可以在液体环境下实现高分辨率力学检测，因而是研究微纳米尺度柔性材料以及生物材料的重要工具。然而，目前使用原子力显微镜进行单细胞力学测量时，通常存在通量低下、单细胞定位精度及环境控制不足、细胞固定技术受限等问题。通量低下，是指在测量细胞前，只能够通过宏观的细胞培养或者细胞固定方式处理细胞，但各个细胞的位置无法控制，这就导致在实际测量过程中，需要在显微镜视野下大范围寻找细胞，才能够找到适宜测量或研究的单细胞，这极大影响了研究效率。单细胞定位精度和环境控制不足，是指位置无法控制的细胞团在各处生长情况和环境情况不同，这就导致测量的细胞处于不同的力学或者化学微环境状态，难以控制变量，影响实验的可信度。细胞固定技术受限，是指在进行传统细胞测试时，通常使用化学试剂将细胞固定在表面(如使用戊二醛固定红细胞、使用多聚赖氨酸固定悬浮细胞等)，然而化学试剂会严重影响细胞的生物学特征，进而影响对细胞的分析。因此当前亟需一种技术手段为单细胞提供均一稳定的力学微环境，使得微纳米力学加载能够有效作用于细胞并进行细胞的生物物理学分析。

2、cn115793414b公开了一种可调控高度比例的高深宽比微结构的制备方法。该方法采用bosch微纳加工工艺制备微结构，其操作过程繁琐且精准度不足，无法实现弧形微结构阵列的制备。

3、cn109278284a公开了一种su8光刻胶微柱阵列及其制备方法、应用。cn115857287a公开了一种石墨烯微结构的制备方法。rosenbluth等研发了一种将原子力显微镜机械特性测量扩展到非粘附细胞的简单方法，并描述了可能导致急性白血病并发症--白细胞滞留的人类白血病细胞的特性(rosenbluth mj,lam wa,fletcherda.force microscopy ofnonadherent cells:a comparison of leukemia cell deformability.biophysicaljournal.2006apr；90(8):2994-3003.)。这些方法采用su-8负性光刻胶实现了0-1光刻(binary lithography)，但这种传统光刻方法的精准度不足，无法实现不同曲率的弧形微结构阵列的制备。

4、cn 102680526a公开了单细胞阵列微芯片及其制造、电测量和电穿孔方法。细胞虽然能够通过该技术中的方式处于样品池微腔体中，但并不是力学稳定状态，仅能进行电学加载测量但无法对细胞进行有效的力学分析。

5、cn108611250a公开了一种基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片及其制备方法。该技术制备的微球腔结构为亚微米级，适用于固定细菌而非细胞，在不同尺度下的加工方式和可行方案存在差异。其次，该微球腔结构仅适用于潜在的电分析，难以使细菌处于稳定的力学微环境，因此无法进行精准力学分析。

6、cn114002918a公开了光刻曝光剂量的测算方法、装置、设备、控制系统及介质。该技术描述了通过测量和软件分析方法校正光刻机内部曝光剂量的方法，为针对光刻机的参数优化。

7、段玉公开了用于单微球阵列捕获与单细胞力学分析的微流体芯片研究(深圳大学硕士学位论文)。该文献使用了微流道设计进行单细胞捕获，但由于该方法为封闭流道下的细胞捕获，无法联用原子力显微镜等精密力学仪器，故无法实现精准细胞力学测量，仅能在显微镜下通过判断细胞形貌变化大致推断细胞的基本力学特点。

8、cn108037320a公开了一种基于原子力显微镜的红细胞力学特征的检测方法。该方法使用多聚赖氨酸固定红细胞，严重影响细胞的生物学特征，进而影响对细胞的分析。

9、cn115128303a公开了一种基于原子力纳米压痕测量单个细胞杨氏模量的方法。cn115327169a公开了一种检测活脂肪细胞的拉曼原子力显微装置及方法。这些方法在随机位置培养细胞，单细胞定位精度和环境控制不足，通量低下。

10、因此，用于单细胞测量的现有方式存在通量低下、单细胞定位精度及环境控制不足、细胞固定技术受限等问题。如上述的cn 108037320 a使用多聚赖氨酸固定红细胞，cn115128303a，cn115327169a和cn 108037320 a在随机位置培养细胞，单细胞定位精度和环境控制不足，通量低下。利用微结构进行细胞捕捉的方法通过传统0-1光刻制备，如上述文献中所述。该方法仅能够制造二维形貌的微结构阵列，即在高度方向上保持均一的柱体结构。对于弧状结构、圆台、锥体等定制化微结构阵列的加工能力欠缺，因而限制其应用范围。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种大面积弧形微结构阵列芯片及其制备方法与一种单细胞精准力学分析方法及装置。本发明能够制备得到应用于单细胞精准力学分析的大面积弧形微结构阵列细胞限位芯片，并将其成功应用于单细胞力学分析。

2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种大面积弧形微结构阵列芯片的制备方法，其包括以下步骤：

3、s1、光刻胶层的制备

4、在预处理后的硅晶圆上依次设置防反光层和光刻胶层，得到光刻胶层；

5、s2、光刻剂量标准化测试

6、s201、标准剂量曝光

7、使用激光直写系统进行灰度光刻(greyscale lithography)加工，在步骤s1得到的光刻胶层上制备方形微结构阵列，并且所述阵列从左至右、从上至下的光照强度递增，光刻完成后进行显影及清洗，得到方形测试阵列；

8、s202、光刻表面形貌表征

9、将所述方形测试阵列采用白光干涉仪进行扫描，得到白光干涉图，并收集所述白光干涉图中的阵列位置信息；

10、s3、光刻剂量关系分析

11、s301、光刻深度信息提取

12、通过所述白光干涉图中的阵列位置信息，基于跳变点区分光刻胶表面与方形微结构的高度信号，得到各个曝光剂量对应的光刻深度；

13、s302、标准剂量曝光

14、基于各个曝光剂量对应的光刻深度，通过多项式拟合得出曝光剂量-深度的模型；

15、s4、光刻微结构加工

16、s401、利用软件设计弧形微阵列三维结构，得到弧形微阵列三维结构图；

17、s402、灰度值转换写入激光直写系统

18、通过设定光刻胶层厚度和预设曝光最大深度，将所述弧形微阵列三维结构图转变为二维灰度图(bmp)，并写入激光直写系统；

19、s403、灰度光刻加工

20、将步骤s302得到的曝光剂量-深度的模型写入激光直写系统，校正弧形微阵列结构的二维灰度图信息，然后在步骤s1得到的光刻胶层上进行灰度光刻加工；

21、s404、经显影和清洗后，得到弧形微结构阵列；

22、s5、芯片制备

23、采用聚二甲基硅氧烷对步骤s404得到的弧形微结构阵列进行倒模，得到所述的大面积弧形微结构阵列芯片。

24、在上述的制备方法中，优选地，在步骤s1中，所述预处理后的硅晶圆是通过以下步骤制备的：将硅晶圆放置于丙酮中，超声处理1-5min(以去除表面污染)；然后再在180-220℃烘烤1-10min(以去除表面有机物杂质)，得到预处理后的硅晶圆。

25、在上述的制备方法中，优选地，步骤s1进一步包括：防反光层和光刻胶层的厚度标定，其具体包括：使用旋涂方式，在预处理后的硅晶圆上制备防反光层，制备完成后，移除局部防反光层，并利用原子力显微镜扫描模式(tapping mode)标定防反光层厚度，以确定防反光层的旋涂工艺参数；使用旋涂方式，在预处理后的硅晶圆上制备光刻胶层，移除局部光刻胶层，并利用白光干涉仪标定光刻胶层厚度，以确定光刻胶层的旋涂工艺参数。

26、在上述的制备方法中，优选地，在步骤s1中，所述防反光层的材料包括az-barli-ii-90，az-barli-ii-200，ar-10l-400或duo248等。

27、在上述的制备方法中，优选地，在步骤s1中，所述防反光层的厚度为10-1000nm。

28、在上述的制备方法中，优选地，在步骤s1中，所述防反光层是通过以下方式制备的：将防反光层的材料(即防反光剂)均匀滴加至预处理后的硅晶圆表面，旋涂制备均匀厚度的防反光层，并通过烘烤固化，制备得到防反光层。更优选地，所述防反光层的旋涂和烘烤工艺包括：预旋涂的转速为300-500r/min，加速度为500-1500r/s，时间为5-8s；匀胶的转速为1000-4000r/min，加速度为500-1500r/s，时间为10-100s；旋涂的减速度为500-1500r/s；烘烤温度为150-250℃，烘烤时间为1-5min。其中，进一步优选地，所述预旋涂重复1-2次。

29、在上述的制备方法中，优选地，在步骤s1中，所述光刻胶层的材料包括ma-p1215g，ma-p 1225g，ma-p 1275g，kl6008或k-pro等。

30、在上述的制备方法中，优选地，在步骤s1中，所述光刻胶层的厚度为1.5-60μm。

31、在上述的制备方法中，优选地，在步骤s1中，所述光刻胶层是通过以下方式制备的：将光刻胶层的材料(即光刻胶)均匀倾倒至具有防反光层的硅晶圆表面，旋涂制备均匀厚度的光刻胶层，并通过烘烤、退火，制备得到光刻胶层。更优选地，所述光刻胶层的旋涂、烘烤和退火工艺包括：旋涂：以100-500r/min的转速、500-1500r/s的加速度进行旋涂，时间为3-20s，再以300-1000r/min的转速、500-1500r/s的加速度进行旋涂，时间为3-20s，然后以500-1500r/min的转速进行稳定旋涂，时间为30-120s，然后调整旋涂的减速度为500-1500r/s，完成旋涂；烘烤：在80-150℃烘烤10-60min；退火：均匀退火至室温环境，时间为20-200min。其中，进一步优选地，在退火过程中，维持环境温度为20-30℃，维持环境湿度为40％-46％。

32、在上述的制备方法中，优选地，在步骤s201中，制备所述方形微结构阵列使用0-1000mj/cm2的激光能量。

33、在上述的制备方法中，优选地，在步骤s302中，所述曝光剂量-深度的模型采用九次多项式拟合得到。

34、在上述的制备方法中，优选地，在步骤403中，在步骤s1得到的光刻胶层上进行灰度光刻加工的过程中，维持环境温度为20-30℃，维持环境湿度为40％-46％，光刻过程控制在5h以下完成。

35、在上述的制备方法中，优选地，步骤404具体包括：采用显影液浸没光刻后的硅晶圆，放置于摇床上进行显影；从显影液中取出硅晶圆后，再将其浸没于去离子水中，放置于摇床上进行显影和清洗；从去离子水中取出硅晶圆后，静置干燥，得到弧形微结构阵列。其中，更优选地，所述显影液包括mr-d-526s显影液。更优选地，硅晶圆在显影液中置于摇床上晃动的速度为100-800r/min，时间为300-1000s。更优选地，硅晶圆在去离子水中置于摇床上晃动的速度为100-800r/min，时间为300-1000s。

36、在上述的制备方法中，优选地，在步骤4中，所述弧形微结构阵列的微结构的尺寸范围包括：底部直径5-30μm，高度1.5-60μm，高宽比0.3-2。所述微结构的弧度可根据设计灵活调整。

37、在上述的制备方法中，优选地，步骤s5具体包括：

38、s501、使用tmcs(三甲基氯硅烷)蒸汽处理所述弧形微结构阵列的表面；

39、s502、将pdms(聚二甲基硅氧烷)倒至蒸汽处理后的弧形微结构阵列的表面，在50-100℃烘烤1-2h，将固化成型的pdms膜剥离下来，得到pdms大面积弧形微结构阵列芯片。

40、在上述的制备方法中，优选地，在步骤s501中，所述蒸汽处理的时间为10-30min。

41、本发明第二方面提供了一种大面积弧形微结构阵列芯片，其是通过上述的大面积弧形微结构阵列芯片的制备方法制得的。

42、根据本发明的具体实施方式，优选地，所述大面积弧形微结构阵列芯片具有弧形微坑结构阵列，所述微坑的尺寸范围包括：顶部直径5-30μm，深度1.5-60μm，深宽比0.3-2。所述微坑的弧形结构和弧度可根据设计灵活调整。

43、本发明第三方面提供了一种单细胞精准力学分析方法，其采用上述的大面积弧形微结构阵列芯片实现单细胞精准力学分析，该方法包括以下步骤：

44、(1)探针加载及探针台防液密封

45、将测试探针装载至原子力显微镜的探针台上并固定，对探针台安装防液胶圈进行密封；

46、(2)隔振及光源加载

47、开启主动隔振平台并开启光源；

48、(3)探针参数校准与仪器校正

49、在液体环境下使用探针按压标准硬基底，结合热扰动方法，标定探针的弹性模量信息以及仪器的光学灵敏度(invols)；

50、(4)细胞限位芯片细胞加载

51、将浓缩细胞液滴加至所述大面积弧形微结构阵列芯片表面，并进行离心处理，使多个细胞在离心力作用下进入芯片的微坑中，完成大面积单细胞限位；取出芯片后，在芯片一侧缓慢滴加液体至芯片表面，同时在芯片另一侧吸收液体，在芯片表面形成缓慢的定向流场，清洗芯片并带走未进入微坑的多余细胞，得到已加载细胞的细胞限位芯片；

52、(5)细胞限位芯片装载

53、将已加载细胞的细胞限位芯片放置于载玻片中央，随后将载玻片装载至液池内，并固定载玻片；

54、(6)细胞生理环境加载

55、使用细胞培养基充满液池并浸没已加载细胞的细胞限位芯片；

56、(7)探针-细胞定位

57、在光学倒置显微镜视野下，将焦平面调至已加载细胞的细胞限位芯片的上表面，以观察到被限位在微坑结构阵列中的细胞阵列，逐步下调针尖位置并靠近芯片上表面，根据光学倒置显微镜视野同步操作探针台，使探针针尖位于待测量细胞的正上方，准备进行力学测量；

58、(8)力学测试与数据采样

59、驱动压电陶瓷移动，带动探针加载细胞，并同时进行数字采样，根据探针形变和光电转换记录力信号。

60、在上述的单细胞精准力学分析方法中，优选地，在步骤(3)中，所述标准硬基底包括玻璃片或硅片等。

61、在上述的单细胞精准力学分析方法中，优选地，在步骤(6)中，所述细胞培养基的温度控制在25-37℃。

62、根据本发明的具体实施方式，优选地，上述的单细胞精准力学分析方法进一步包括：重复步骤(7)和步骤(8)，以实现高通量细胞精准力学分析。

63、本发明第四方面提供了一种单细胞精准力学分析装置，其用于实现上述的单细胞精准力学分析方法，该装置包括：

64、样品模块，其包括：大面积弧形微结构阵列芯片，用于大面积单细胞限位得到已加载细胞的细胞限位芯片；载玻片，用于装载所述已加载细胞的细胞限位芯片；细胞培养基，用于维持细胞生理环境；以及液池，用于装载具有已加载细胞的细胞限位芯片的载玻片，并盛放所述细胞培养基；

65、原子力显微镜模块，其包括：探针台、悬臂、探针、压电陶瓷、光学倒置显微镜、主动隔振平台以及光源等；

66、控制及分析模块，其用于控制所述细胞培养基的温度状态和所述探针的状态，以及收集力信号数据。

67、在上述的单细胞精准力学分析装置中，优选地，所述探针通过悬臂和压电陶瓷连接于探针台；所述压电陶瓷用于控制所述探针进行力学加载；所述光学倒置显微镜设置于所述样品模块的下方，用于进行光学观察和显微操作；所述主动隔振平台设置于样品模块的下方，用于减小振动噪声；所述光源设置于样品模块的上方。在本发明中，所述原子力显微镜模块还可以包括其他常规的原子力显微镜的部件，本发明不对其进行特殊限制。

68、在上述的单细胞精准力学分析装置中，优选地，所述探针包括氮化硅针尖或聚合物材料球形探针等。

69、在上述的单细胞精准力学分析装置中，优选地，所述液池的底部设置有钢圈和密封圈，用于固定所述载玻片；所述液池的内部设置有电阻丝和热电偶，用于控制液池内的所述细胞培养基的温度。

70、本发明提供了一种大面积弧形微结构阵列芯片及其制备方法与一种单细胞精准力学分析方法及装置。本发明采用灰度光刻技术并对其进行改进，通过光刻胶层制备工艺、光刻剂量标准化测试、光刻剂量关系分析的综合方法，克服了灰度光刻加工时预设形貌与加工结果严重不匹配的问题，实现了参数准确、形貌可灵活调整的大面积弧形微结构阵列的制备。在现有技术中，使用灰度光刻可以加工定制化三维微结构。但最终的微结构形貌受到光刻胶物理特性、胶层制备工艺、激光波段及强度等多种因素的影响，加工结果往往与预设的目标结构相差甚远，因而无法通过简单的设计直接加工出目标结构，而制备形貌可控的三维形貌微结构阵列需要复杂的校正技术。本发明设计了光刻剂量矫正，针对光刻胶实际物理化学特性，对制备特定微结构的光刻剂量进行修正，不仅操作简单而且提高了制备精度。同时，本发明采用激光直写与灰度光刻相结合的工艺，解决了现有微纳加工工艺操作过程繁琐且精准度不足的问题，仅通过光刻胶的表面形貌形成微结构阵列，且可以实现微结构形貌的灵活调控，制备不同曲率的弧形微结构阵列，具有更广泛的应用价值。进一步地，本发明在弧形微结构阵列的基础上，利用pdms倒模制备了可进行稳定单细胞力学限位的芯片，并结合原子力显微镜实现了高通量精准单细胞力学分析。因此，本发明的单细胞精准力学分析方法及装置具有单细胞限位稳定、通量高、单细胞定位精度及环境控制程度高等优点，为单细胞提供了均一稳定的力学微环境，使得微纳米力学加载能够有效作用于细胞并进行细胞的生物物理学分析。此外，本发明的弧形微结构阵列还可应用于光学器件、亲疏水表面制备、液滴运输等领域，具有广泛的应用场景和可观的应用价值。