基于三维稀疏复合光学晶格的多焦点扫描共焦荧光显微成像系统

本发明提供的是一种基于三维稀疏复合光学晶格的多焦点扫描共焦荧光显微成像系统，实时原位获取细胞内部高空间分辨率三维结构荧光层析图像。具有时间和空间分辨率高、系统适应性强、操作灵活等特点。属于生物光子学研究领域。

背景技术：

1、细胞作为生命结构和功能的基础单元，其深入研究对于揭开生命现象的奥秘、改造生命以及战胜疾病具有至关重要的意义。当前，生命科学研究的一个热点领域便是从分子层面解析单细胞的基本活动规律。为实现这一目标，我们必须对细胞内众多生物分子的物理、化学性质及其功能进行系统而深入的研究。这要求我们能够快速且准确地识别单细胞内种类繁多的生物分子，并对其进行精确的定量分析，以获取其物理、化学特性及功能信息。

2、因此，开发能够快速获取活细胞内生物分子的空间分布和功能信息的光谱分析和显微成像技术，对于实时、原位、动态地监测单细胞生命活动过程至关重要。这些技术不仅有助于我们理解单细胞的生命活动，还能揭示外界环境对细胞内生物分子性质、功能和作用的影响，以及探索生物分子在细胞生命活动过程中的性质、功能及其相互作用动态，具有深远的意义。

3、荧光显微镜在生物科学领域有着广泛的应用，特别是在研究细胞的三维内部结构、器官，以及观察带有高特异性荧光标签的特殊生物分子方面。然而，这些显微镜技术存在一个主要缺点：它们的空间分辨率中等，受到光学衍射极限的限制。为了克服这一限制，研究人员在远场荧光显微成像技术领域探索并实现了多种超分辨成像方法，这些方法能够突破光学衍射极限。

4、目前，共聚焦显微技术，作为一种快速发展的先进研究手段，已在多个生物学领域得到广泛应用，包括细胞学、微生物学、发育生物学、遗传学、神经生物学、生理学和病理学等。它已成为现代生物学微观研究领域不可或缺的技术工具。该技术的核心在于其独特的成像原理：共聚焦显微镜通过位于光源后的照明针孔和位于检测器前的探测针孔，实现了精确的点照明和点检测。光源发出的光通过照明针孔后，仅在样品焦平面的特定点上聚焦，此点产生的荧光成像于探测针孔中。而该点以外的光线则被探测针孔有效阻挡，从而提高了成像的清晰度和对比度。在这种配置下，照明针孔与探测针孔对于样品上的照射点和探测点来说是共轭的，确保了只有位于共焦平面的点能够被准确探测。计算机系统将这些探测点以图像点的形式显示在屏幕上。为了构建一幅完整的图像，扫描系统在样品焦平面上进行逐点扫描，最终形成一幅清晰的共焦图像。通过调整载物台沿z轴的上下移动，可以使得样品的不同层面依次进入共焦平面，并在显示器上生成相应的荧光图像。这样，随着z轴的不断调整，研究人员能够获取样品多个层面的荧光图像。单点共聚焦受限于成像速度，利用多焦点的扫描能够进一步提高成像速度。

5、结构照明显微镜(structured illumination microscopy,sim)技术作为一种宽场超分辨荧光显微成像技术，它在提高荧光显微成像的横向分辨率方面取得了显著成就，实现了高达数十纳米以下的空间分辨率。结构照明显微镜技术虽然显著提高了荧光显微成像的分辨率，但它也存在一些局限性。sim技术通常需要采集多幅图像并进行后期处理以重建超分辨率图像，这可能会降低成像速度，不适合快速动态过程的实时监测。sim技术主要用于提高二维成像的分辨率，对于三维成像的改善相对有限，而且通常需要额外的光学系统或样本制备方法。这些局限性推动了研究人员继续探索和开发新的超分辨率显微技术，以实现更高分辨率、更快速度、更简单操作和更少对样本影响的成像方法。

6、光学晶格技术已成为生物学、医学、原子物理和量子通信科学等众多研究领域中广泛使用的工具之一，尤其基于光学晶格的层光显微技术广泛应用于活体细胞和生物组织显微成像研究工作中。光学晶格的作为结构光的一种替代性光源，能够通过配置光束的数量和入射角度实现空间中晶胞大小的控制并突破衍射极限。三维光学晶格有着周期性分布的多个激发焦点，能够实现多焦点扫描来提高共聚焦的成像速度，并克服三维结构光不同深度下荧光信息之间串扰的影响。

7、生成三维光学晶格的激光光束经过入射数量和入射角度调制后，聚焦在物镜后焦面，作为平行光束以不同的角度的在焦点处干涉叠加。多束平行光束被凹面反射镜反射后，这些光束反向传播。反射前后的平行光束在待测样品中相干叠加，最终产生三维稀疏复合光学晶格光场。特别地，在轴向上三维光学晶格通过调节光束入射位置进一步调控晶胞间的周期。三维稀疏复合光学晶格作为激发光场能够实现多焦点扫描，利用写入特殊图案的透射式空间光调制器，实现多焦点共聚焦。因此，基于三维稀疏复合光学晶格的多焦点扫描共焦荧光显微成像系统是一种基于三维稀疏复合光学晶格的荧光成像，提供三维成像对比度、具有高灵敏度和时间分辨率的显微成像技术。

8、本发明在已有的多焦点扫描显微成像技术，以及荧光显微成像技术的理论和实验研究的基础上，提出基于多矢量光场相干叠加调控机制，在物镜视场范围内形成周期排列的，高密度、高强度的三维稀疏复合光学晶格作为多焦点激发光源。在各焦点处激发细胞内的荧光信号，提供化学特异性和成像对比度。通过多焦点扫描方式快速准确地识别细胞内部的生物分子，实时原位获取其三维分布图像信息的，具有三维高分辨率的多焦点扫描显微成像系统。

技术实现思路

1、一种基于三维稀疏复合光学晶格的多焦点扫描共焦荧光显微成像系统，以多焦点快速扫描成像的方式获取共焦高分辨率荧光图像的显微成像系统。

2、本发明的目的是这样实现的：

3、它所述系统中所述系统中单波长连续激光器1发出特定波长的激光光束，经过准直扩束系统2后，入射到透射式空间光调制器3进行调制。调制后的产生的多束激光光束通过掩膜板4和准直扩束系统5后，经由双色镜6反射，耦合进显微物镜7。多束激光光束经由显微物镜7，穿过待测样品8和载玻片9后，经过三维纳米载物台10，打在凹面反射镜11上并被反射。入射与反射后的多束激光光束在样品中相干叠加，产生三维稀疏复合光学晶格，在各晶胞位置处激发待测样品8中的荧光团，产生荧光信号。使用显微物镜7收集荧光信号，经过透镜12聚焦后，通过带通滤光片13滤除杂散光，安装在共焦位置处的透射式空间光调制器14消除离焦荧光信号的干扰，实现共焦探测，通过emccd相机15获取待测样品具有高空间分辨率的三维结构荧光层析图像。利用计算机16收集、处理、显示和存储所获得的荧光图像信息。

4、多个矢量光场在同一区域内相干叠，这些矢量光场以不同的角度入射，产生周期性排列的光学晶格光场。在空间中的光学晶格光场的强度分布受到入射矢量光场的波矢和强度共同影响。在凝聚态物理领域，晶格的倒易原始矢量和波矢之间的关系可以用以下方式表示：

5、bn＝k0-kn,n＝1,…,d (1)

6、根据上述内容，可以通过控制叠加光场的数量和波矢方向产生想要得到的三维光学晶格。直接晶格的原始晶胞波矢定义为an，令a＝[a1,…,ad]。且倒易晶格的原始晶胞波矢bn，令b＝[b1,…,bd]。由b'i·aj＝2πδij(即下标相同右侧等于2π，否则右侧结果为0，其中b'i即为倒易向量)可以得到：

7、k0＝a·β/4π (2)

8、根据公式(1)与(2)可以得到包含了晶格的方向和周期性信息的波矢集{kn}。综上所述，根据产生的光场需求选择不同的晶胞形状，根据晶胞的点阵分布计算直接原始晶胞矢量an和波矢kn来生成满足相位匹配的三维光学晶格。

9、结合凝聚态物理的相关知识，通过分析a和b的关系可以知道：当布拉维点阵分布保持不变时，有多种a可以表示布拉维点阵。可以通过引入g来改变a和b包含的基础矢量和倒易晶格矢量，其中|g|＝±1，即：

10、a2t＝g·a1t (3)

11、根据公式(3)，产生不同的生成矩阵g来改变a和b，最终改变光学晶格的周期来产生稀疏光学晶格。产生稀疏光学晶格的光束，根据最大有效对称原则，分别以波矢集的形式进行旋转，镜像和反转，最终实现光束数量和角度的有效最大对称。进而得到稀疏复合光学晶格。

12、三维光学晶格的产生是在轴向的波矢分量发生变化，激发光场在轴向上的频率分量变化促进空间中光场的轴向分布变化。利用凹面反射镜对光束的反射，使显微物镜出射的光束反向传播后。这增加激发光场中光束的数量和入射角度，促使空间中光场的轴向分布发生变化，进而实现对交叠区域的光场进一步调制。根据初始出射的光束和反射后发生光束的入射数量和入射角度，以最大有效对称的形式产生三维稀疏复合光学晶格。在焦平面上的待测样品中，相干叠加产生三维稀疏复合晶格作为激发光场激发待测样品的荧光信号。在透射式空间光调制器中写入和三维晶格点阵分布一致的孔洞图案，实现对样品的离焦荧光信息的滤除。实现多焦点共聚焦扫描成像。