用于识别样品的方法和设备的制作方法
【专利摘要】披露了一种多反射飞行时间（MRTOF）质谱仪（12）以及用于识别样品的方法。在一个离子源（15）处产生样品离子。该MRTOF是在一个反射轴（XX′）上具有相对的第一和第二离子镜（20，20′）的一个闭合镜安排。该MRTOF（12）还包括在该轴（XX′）上的一个双向离子偏转器（50）。该偏转器（50）在时间t0时将离子作为一个短脉冲偏转到该反射轴上，在其中它们振荡多次，根据离子m/z在飞行时间中进行分离。在一个稍后的时间t，将以沿该轴（XX′）在两个方向上行进的离子通过该双向偏转器（50）喷射出该MRTOF（12）至一个离子检测器安排（55）。飞行时间中的离子分离允许由该检测器安排（55）产生一个生物样品的“指纹”，而无需给每个峰指定一个质量。与一个指纹的库的比较允许进行识别。
【专利说明】用于识别样品的方法和设备
发明领域
[0001]本发明涉及一种识别未知组成或类型的样品的方法，尤其(但并非唯一地)是微生物如细菌或真菌菌落。本发明还涉及一种用于识别样品如微生物有机体的设备。
[0002]发明背景
[0003]已开发了用于分析和识别微生物有机体如细菌或真菌菌落的各种不同技术。例如，菌种保藏技术已经建立了许多年。在此，将有待识别/分析的材料的一个样品保藏并且然后培养该样品以生长一个然后可以例如用显微镜进行分析的菌种。该技术是缓慢的(它花费至少几个小时并且可能花费数天)并且可能遗漏许多类型的细菌。
[0004]用于微生物分析的第二种技术是所谓的聚合酶链式反应(PCR)。该方法将一个DNA链的特定区域放大。微生物学上的PCR诊断是基于借助特定基因识别的传染因子检测以及从病原菌株中非病原形式的辨别。
[0005]用于微生物分析和识别的一种另外的技术使用具有一个基质辅助激光解吸电离(MALDI)源的一种飞行时间(TOF)质谱仪。该MALDI技术是在1980年代后期开发的并且它由岛津公司(Shimadzu Corporation)的田中(Tanaka)应用于生物大分子的分析在2002年获得了诺贝尔化学奖。这些原理的早期描述可以在K.Tanaka等人，质谱学快讯(RapidCommunications in Mass Spectrometry), 1988 年,第 2 卷,第 151 页中找到。使用该技术，可以产生可重现的、种特异性的谱图，并且用于识别在物种水平上的微生物。
[0006]已经使用该MALDI TOF技术识别了广谱的有机体，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性的细菌、诺卡氏菌属、分枝杆菌、酵母菌和霉菌。该技术是相对快的(当然是与菌种保藏技术相比)，具有最小的消耗成本，并且提供与基因组测序可相比较的准确度。该MALDI TOF技术的另外的讨论可以在 Seng P.、M.Drancourt、F.Gouriet、B.La Scola、P.E.Fournier、J.M.Rolain、和D.Raoult的“细菌学上正在进行的变革:通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪的细菌的常规识别(Ongoing Revolution in Bacteriology:RoutineIdentification of Bacteria by Matrix-Assisted Laser Desorption 1nization Timeof Flight Mass Spectrometry)”,临床感染性疾病杂志(Clin.1nfect.Dis.), 2009 年 8 月15日，第49卷,第4期,第552页和第553页；还可以参见http://www.ncb1.nlm.nih.gov/pubmed/19583519。
[0007]对于相同细菌(在这种情况下，大肠杆菌(atcc33694))，使用该MALDI TOF质谱技术，由三个不同研究所获得的质谱在美国化学学会期刊的质谱法，2005年4月，第16卷，第4 期，第 456 页至第 462 页，Wunschel 等人的一篇文章(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1044030504008220)中不出。在该 Wunschel 等人的论文中不出的每个质谱表示一个50次发射的平均谱。该Wunschel等人的论文还示出来自由该三个不同研究所获得的三个质谱中的质谱的产生的生物指纹。这些指纹通过例如去除基线噪声将该质谱简化。在该Wunschel的论文的指纹中,横(x)轴表示质荷比(m/z),同时纵(y)轴表示这些峰的相对强度。
[0008]同时在Wunschel等人的论文中可以看出，明显地在这三个指纹之间存在相同的峰(具体地，该大峰为约m/z=7, OOO并且一些更小的峰似乎对应约m/z=9, 500),同样地存在仅在这三个指纹中的一个或其他中出现的许多峰。由于这些指纹本身已经从标称上相同的微生物材料产生，识别的准确度(通过这些指纹与一个此类指纹的库的比较)与该测量的指纹与所分析的微生物的数据库中的指纹的对应程度直接相关。
[0009]在Wunschel等人的论文中在这三个指纹之间的偏差的部分原因是当前使用的MALDI TOF质谱技术产生非常低的分辨率的指纹，尽管具有良好的灵敏度和相对低的成本。在细菌识别中，检测细菌来源的200个以上的峰，但可能仅这些中的四分之一与一种特定种类相关(即，对该特定种类是特异的)并且因此可以用于识别该种类或将该种类与其他区分。
[0010]除了相对低的分辨率(分辨率是在相邻峰之间进行区分的能力的一个度量)之外，当前的数据库还包含具有仅最高达约10,000的m/z的指纹。然而,如可以在Wunschel等人的论文中从国家标准与技术研究院产生的指纹中看出，将希望的是将该质量范围扩展至最高达20，000。而且，更高的分辨率和更高的灵敏度将允许更确切的识别。
[0011]用于细菌识别的当前的MALDI TOF主要使用线性TOF质谱仪。确实存在高分辨率仪器。例如，如具有离子镜的多反射TOF的装置是作为此类已知的。然而，它们是昂贵的并且是庞大的并且是固有地比用于生物识别的现有的线性TOF质谱仪更不灵敏的。这些FTMS仪器如轨道阱(Orbitrap?)和FT-1CR MS仪器可以提供非常高的灵敏度，但具有它们的质量范围上的限制并且不适于典型地由一个MALDI离子源产生的更大的单电荷种类。
【发明内容】
[0012]针对此背景，本发明的一个目的是解决本领域中的问题。
[0013]根据本发明的一个第一方面，提供了一种识别样品的方法，该方法包括:
[0014](a)从有待识别的样品产生样品离子；
[0015](b)在一个时间tQ将这些样品离子引入一个样品多通飞行时间(TOF)质谱仪中并且导致这些离子中的至少一些沿该TOF质谱仪中的一个路径重复地行进，其中具有不同m/z的离子在飞行时间中分离，并且进一步地，其中具有至少一个第一 m/z的离子追上具有至少一个不同的第二 m/z的离子；
[0016](c)在一个时间h Ot0)开始将这些样品离子从该TOF喷射；
[0017](d)检测这些被喷射的离子；并且
[0018](e)产生该样品的一个第一指纹，该第一指纹包含多个峰，每个峰由具有一个特定质荷比的离子产生并且按照对在A时或之后它们从该多通TOF中喷射的顺序的依次关系来排列，但其中这些峰中的至少一些不按照m/z的依次顺序来排列，对于识别该有待识别的样品，该第一指纹与一个已知样品的指纹的库是可比较的。
[0019]本发明是特别有用的，其中有待识别的样品是一种微生物，该微生物的实例包括细菌或真菌。因此，在此种情况下，该指纹是一种生物指纹并且该库或数据库是已知微生物的指纹中之一。然而，还可以将本发明应用于识别除微生物外的其他生物样品，以及应用于非生物样品。在以下的描述中，将对一种微生物的情况做出具体参照，但应理解的是，这是为了说明并且仅仅是一个属类样品的实例。
[0020]本发明人已经认识到，质谱对于产生可以用于识别微生物的指纹不是必须的。具体地，已经认识到，获得具有以上升的或下降的m/z排序的组分分子的正式质谱不是必须的。所必需的只是产生一个特征信号(signature)，其中这些组分峰被良好分离，并且其顺序对应于或至少可以被映射到一个参考谱中的峰的顺序。在一个最简单的实施例中，这意味着该样品微生物的所产生的第一生物指纹中的峰是按照与一个样品库中(例如，从相同微生物材料产生的)的一个参考生物指纹中的峰相同的顺序。然而，作为一个替代方案，在该样品和参考指纹中的一者或另一者中的峰可以按照不同顺序来产生，使用软件操纵一者或另一者或两者以将在这些样品和参考指纹之一中的这些峰位置映射至如这些样品和参考指纹中的另一者中的相同峰的相同位置。
[0021 ] 前提是用于获得这些参考和样品指纹的这个或这些装置的谱测定参数是相同的，然后，其中这些样品和参考微生物材料相对应，当将离子在同一时间h开始从该多通TOF中喷射时，甚至当峰顺序与逐渐增加或减少的质荷比不具有直接关系时，因相同离子产生的峰应在每个指纹中以相同的相对位置出现。然而，在这些谱测定参数不同时，必须将一个转换因子或卷积应用到这些样品和参考指纹中的一者或两者，以便因相同离子产生的峰在每个指纹中以相同的相对位置出现。例如，在使用一个多反射(MR) TOF作为该多通TOF的情况下，如果将用于获得一个参考生物指纹的MR TOF中的这些镜通过不同于用于分析该样品并且获得该样品生物指纹的MR TOF中的离子镜的一个距离分开，那么这些MR TOF中的一者或另一者中的停留时间需要进行调整。这是因为，由于这些离子镜的不同间距，在注入每个MR TOF之后中在相同的时间在每个MR TOF中，具有一个给定的质荷比的离子将在一个完全不同的位置，并且潜在地在一个不同方向上行进。优选地，以实质上相同的峰分辨率获得这些样品和参考指纹中的每一个。
[0022]尽管在此阐述的方法的增加的质量范围和灵敏度提供了对将样品指纹与一个库或数据库中的参考指纹相匹配的更好的置信度，但通过在该TOF中用不同的离子停留时间重复该方法可以实现仍更好的置信度。通过这样做，离子以一个不同顺序被喷射，并且当从该第一离子停留时间中获得时，可能重叠的峰可以被消歧。当然，一个第二参考指纹数据库(对于该第二停留时间)可以是所希望的或者必须的。在一个优选的实施例中，该产生的指纹包含对于每个峰的离子丰度的定量指示以及还有峰分离的定量指示(即，将这些峰关于例如从该阱中的离子喷射时间沿该指纹的“X”轴分离)两者。此类信息优化了可供用于尝试将一个样品指纹与一个已知(参考)指纹的库相匹配的比较算法的信息。然而，应该理解的是本发明在它的最广泛的意义上不是如此受限制的；例如，可行的是，仅使用时间分离(例如，以去掉任何丰度信息，以便所有峰具有相同高度)并且仍以获得一个指纹，该指纹对于获得与一个参考数据库的匹配是足够的。
[0023]作为一个另外优选的选择，可以将一个或多个锁定质量离子(具有已知的m/z并且因此具有从该多通TOF中的可预测的喷射时间)与这些样品离子一起(或之后)引入该多通TOF中。一个或多个锁定质量离子的检测可以用于调节该指纹中这些样品离子的位置或确实用以推断这些样品离子的位置，而不直接测量它们。
[0024]在此使用的术语“多通T0F”是指一种TOF质谱仪，该TOF质谱仪具有用于已被弓I入的离子的一个闭合路径，使得这些离子中的至少一些、优选全部的离子重复地(即，多次)遵循该闭合路径。较轻的离子将比较重的离子行进得快并且因此将沿该闭合路径行进的次数多于这些较重的离子。有时，在被引入之后，这些较轻离子中的一些将已经沿该闭合路径行进比这些较重离子至少多一次并且因此将追上此类较重离子。具有一个闭合路径的此类多通TOF的实例包括一个多反射(MR)T0F，该多反射(MR)TOF具有一对彼此相对的离子镜，使得将离子在这些离子镜之间重复地反射，或者一个多轮次TOF质谱仪(MULTUM)，该多轮次TOF质谱仪具有多个扇形静电场以维持这些离子在闭合路径上行进多个循环或轨道。
[0025]在本发明的方法中，这些离子中的至少一些沿该多通TOF质谱仪中的路径行进多次，其中具有不同m/z的离子在飞行时间中分离并且这些离子中的一些追上其他离子。也就是，在追上其他离子时，这些离子中的一些沿该路径行进比其他离子至少多一次。典型地，在几次反射或通过之后一些离子追上其他离子。与一个开放路径或线性TOF相比，这提供了更高分辨率的峰分离，由于在一个多通TOF的情况下的有效分离长度可以长得多。可以获得高达100，000的质量分辨率，例如其中使用高的源加速和后加速。本发明的TOF安排与使用大TOF离子镜的开放MR-TOF系统相比还提供高灵敏度。
[0026]该离子源是用于产生引入一个TOF质谱仪中的离子的一个典型的源，在微生物的情况下优选为一个MALDI源。然而，可以使用一个电喷射(ESI)或其他离子源，取决于该样品类型。
[0027]根据本发明的一个第二方面，提供用于识别样品的一个多反射飞行时间(MR T0F)质谱仪，该多反射飞行时间质谱仪包括:
[0028]一个用于产生样品离子的离子源；
[0029]一个闭合镜MR TOF安排，该闭合镜MR TOF安排具有第一和第二离子镜，这些离子镜被放置为沿一个反射轴彼此相对；
[0030]沿该反射轴放置的并且配置的一个双向离子偏转器安排；
[0031](i)以便在引入该闭合镜MR TOF安排中之后在一个时间&开始，将从该离子源引入该闭合镜MR TOF安排中的并且以从该第一离子镜至该第二离子镜的一个第一方向沿该反射轴行进的样品离子偏转到一个离子检测器安排中；并且
[0032](ii)以便也在所述时间&开始，将从该离子源引入该闭合镜MR TOF安排中的并且以从该第二离子镜至该第一离子镜的一个第二方向沿该反射轴行进的样品离子偏转到该离子检测器安排中。
[0033]通过使用一个双向离子偏转器，可以将该闭合镜MR TOF的全部内容物偏转离开该反射轴并且偏转出该镜安排。这进而允许以高分辨率产生数据(这是该闭合镜MR TOF的一个固有特征)，但还允许获得一个比之前宽得多的质量范围，这进而增加该指纹中的数据点的数目，导致更多的数据以决定一个样品微生物与一个参考数据中的微生物是否匹配。
[0034]优选地，该离子检测器安排包括或包含一个转换倍增极或后加速倍增极、一个电子倍增器和/或一个数字化器和用于存储所获得的数据的计算机。在特别优选的实施例中，将在该第一与第二离子镜之间以一个第一方向行进的离子偏转出去，但仍总体上以该第一方向行进至一个第一离子检测器，同时将在该第二与第一离子镜之间以该离子镜中的相反方向行进的离子偏转出去，再次仍总体上以相同方向行进至一个第二检测器。
[0035]因此该优选的安排不要求一个具有亚纳秒响应的检测系统，由于这些离子包不需要是小于3纳秒-5纳秒。
[0036]根据本发明的仍一个另外方面，为代表多个不同参考样品的一个参考指纹数据库提供了一种产生参考指纹的方法，该方法包括:[0037](a)从该参考样品中产生参考离子(b)
[0038]在一个时间h将这些参考离子引入一个参考多通TOF质谱仪中并且导致这些离子中的至少一些沿该TOF质谱仪中的一个路径重复地行进，其中具有不同m/z的离子在飞行时间中分离并且进一步其中具有至少一个第一 m/z的离子追上具有至少一个不同的第二 m/z的离子；
[0039](c)在一个时间& Ot0)开始将这些参考离子从该参考多通TOF中喷射；
[0040](d)检测这些被喷射的离子；并且
[0041](e)广生该参考样品的参考指纹，其中该参考指纹的每个峰由具有一个特定质荷比的离子产生并且按照对在A时或之后它们从该多通TOF中喷射的顺序的依次关系来排列，但其中这些峰中的至少一些不按照m/z的依次顺序来排列，该参考指纹与来自一个有待识别的样品的指纹是可比较的，以确定是否来自该样品的指纹是与该产生的参考指纹的一个匹配。
[0042]当然可以使用相同类型的TOF组成(构成)该库，如现在或将用于随后样品分析。另一方面，该参考指纹的数据库或库可以使用潜在地在一个不同国家的一个不同的TOF(或许具有如上所解释的不同谱参数)来创建。
[0043]还将理解的是，所获得的样品指纹的比较(或，确实，甚至从该样品TOF获得的原始数据的数据处理)可以在本地至该样品TOF或远程地在一个不同计算机中或确实通过访问在另一个国家的一个库来进行。
[0044]因此，提供了使用一个小尺寸的廉价的质谱仪的一种高分辨率细菌MALDI识别的方法-设备。该分辨率可以接近FTMS的分辨率，但要求在仪器内仅几毫秒的停留时间。由于提供了非常长的飞行路径，当与高分辨率常规TOF相比时，用于高分辨率MALD1-T0F的初始束流参数(具有纳秒或甚至亚纳秒脉冲宽度)是非常宽容的。因此，不要求窄的脉冲检测系统。
[0045]也不存在对如对于FTMS的情况的C-阱和rf切换的要求。可以使用用于将电压供应至该镜系统和该离子喷射的一个稳定高压电源(HV PSU)(两正和两负)和一个低电压(数千伏特)快速脉冲发生器以一种简单方式来实施本发明。虽然该HV PSU原则上可以是一个单一 HV PSU，但实际上一个或两个高压电源和一个脉冲发生器是所希望的，以便实施延迟式提取，这有益于减少与中性基质(MATRIX)分子的碰撞并且最小化源后衰变(PSD)。本发明的各种其他重要的和/或优选的方法将从以下具体描述中并且从所附权利要求的审阅中变得清楚。
[0046]附图简要说明
[0047]本发明可以通过多种方式来进行实践，现在将仅通过举例并参考附图对这些方式中的一些予以说明，其中:
[0048]图1示出了根据表示本发明的第一实施例的一种用于识别微生物有机体的设备；
[0049]图2示出了根据表示本发明的第二实施例的一种用于识别微生物有机体的设备；
[0050]图3示出了根据表示本发明的第三实施例的一种用于识别微生物有机体的设备；图4示出了根据表示本发明的第四实施例的一种用于识别微生物有机体的设备；
[0051]图5示出了在图1至5中的设备中，对于多个不同反射次数，飞行时间对m/z的示意图。[0052]优选实施例的详细描述
[0053]首先参见图1，示出了一个多反射飞行时间(MR T0F)质谱仪仪器10。仪器10包括总体上由参考号12表明的一个闭合镜MR TOF安排和总体上在参考号55处示出的一个尚子检测安排。
[0054]在一个离子源处产生离子并且然后使用离子光学器件将其向闭合镜MR T0F12引导。该离子源和光学器件总体上以方块形式在参考号15处示出。该离子源和离子光学器件的具体安排不形成本发明的一部分并且无论如何将是本领域的普通技术人员所熟悉的。优选地，该离子源是一个基质辅助激光解吸电离(MALDI)源，尽管可以使用其他离子源如一个电喷射源。然而，对于2011年而言，细菌电喷射电离不是一种已建立的技术。
[0055]由该离子源产生并且由离子光学器件15引导的离子被引导朝向闭合镜MR TOF安排12的一个反射轴W。将该轴分别地建立在一个第一离子镜20与一个第二离子镜20'之间。使用一个小偏转器或轴向地通过关闭这些镜之一，来自该源的离子可以进入该XX'轴。该轴上注入可以接受一个更大的质量范围，但在正在被开启或关闭的镜上可能存在电压稳定性问题。
[0056]一旦注入闭合镜MR TOF安排12中，离子沿轴XX^在第一与第二离子镜20、20'之间来回移动并且这由图1中的离子束30表明。
[0057]闭合镜MR TOF安排12还包括用于离子束30的一个屏蔽物40。
[0058]在第一与第二离子镜20、20'之间是一个离子偏转器装置50，该离子偏转器装置的目的和优选构型将在以下更详细地进行解释。离子偏转器装置50是双向的；也就是，它被安排为将从第一离子镜20向第二离子镜2(V行进的并且因此以从左至右的方向(如图1中所看到的)的离子偏转离开轴XX^并且偏转出闭合镜MR TOF安排12，并且它还被安排为将以从右至左的方向(如图1中所看到的)在第二离子镜2(V与第一离子镜20之间行进的离子偏转出闭合镜MR TOF安排12`。
[0059]通过双向离子偏转器装置50被偏转离开图1中的镜轴XX'的离子进入离子检测器安排55，在其中可以检测它们。在图1的具体安排中，通过离子偏转器装置50将如图1中所看到的在分别地第一与第二离子镜20、2(V之间以从左至右的方向行进的离子向一个第一转换倍增极或后加速倍增极60偏转。如将由本领域的普通技术人员理解的是，二次发射发生在第一倍增极60的表面上。来自第一倍增极60的二次电子进而撞击在一个第一电子倍增器70上，这产生一个电子簇射。该电子簇射在电子倍增器70的一个阳极(未示出)处结束，并且该阳极进而当它处于接地电势时，直接地，或者当它是浮动的(接地电势以上)时，例如通过使用电容或电感耦合，被连接到一个数字化器80。电子倍增器70还可以作为一个电子放大器和一个光子放大器的组合来形成(例如，通过使用多个微通道板或一个电子倍增器，之后是将这些电子转化为光子的一个闪烁器，之后是将这些光子输出进行组合的一个或两个光电倍增器)。
[0060]同时，通过离子偏转器装置50将沿闭合镜MR TOF安排12的轴XX'从右至左，也就是，在第二与第一离子镜2(V、20之间行进的离子向位于远离第一倍增极60的一个第二转换倍增极或后加速倍增极60'偏转。该第二倍增极60'进而产生撞击在一个第二电子倍增器70'的二次电子。通过第二电子倍增器70'将这些二次电子倍增以产生一个平行电子簇射，该平行簇射电子(如上所解释的)被第二电子倍增器70'的一个阳极捕获，该阳极进而直接或间接地被耦合至一个数字化器80。因此，数字化器80接收一个入射电流，该入射电流代表在闭合镜MR TOF安排12中以两个方向行进的离子(当将这些离子由离子偏转装置50从闭合镜MR TOF安排12中喷射出来时)。
[0061]将代表被喷射离子的丰度的信号数字化并且由一个计算机90收集。该计算机可以是多反射飞行时间仪器10的一个专用部分，或者可以可替代地是一个单独的、独立的个人计算机，例如，处于与仪器10的一个数据端口(未示出)的有线或无线通讯。计算机90例如经由因特网直接地或间接地与一个单独的信息库或信息数据库通讯。再次本发明的优选实施例的这种特征将在以下进一步详细进行解释。
[0062]在使用图1的安排中，将离子作为一个短脉冲注入闭合镜MR TOF安排12中，在其中它们沿轴XX^在第一与第二离子镜20、20'之间振荡多次。在一个任意时间h将这些离子注入并且允许其来回移动多次，从而扩展了这些离子的有效路径长度。具有不同质荷比的离子在闭合镜MR TOF安排12内以不同速度行进并且因此在飞行时间内分离以形成一系列的离子包。
[0063]在离子已进行多次横穿闭合镜MR TOF安排12之后，在一个第二时间tJH。)，离子偏转器装置50被激励以导致沿轴XX'行进的离子被偏转离开该轴至离子偏转器安排55，如上所解释的。当然，在时间^时的离子不是一个无限窄的束，而是反而沿轴XX'被分离出去。因此，对于在时间h之后将离子从阱中排空将存在一个有限时间，由于这些单独的离子包一个接一个到达离子偏转器50，以便该第一离子包可以在时间h到达，且随后的包在t/ pt" i到达(其中，t' J" J"，At1X然而，为了便于解释，在以下描述中，我们引用一个单一喷射时间(例如，ti)，但应理解的是，该时间简单地表示在其过程中将离子从该MR TOF中喷射的时间窗口的开始(或一个平均)。
[0064]因为离子偏转器装置50是双向的，基本上闭合镜MR TOF安排12内的所有离子可以在该时间h开始被喷射。在将离子注入该MR TOF中与从该阱开始喷射之间的时间差(Vt0)以下被称为闭合镜MR TOF安排12内的停留时间。
[0065]因为闭合镜MR TOF安排12内的上述离子分离，将一系列的离子包从镜轴TL'喷射。在每个包内的离子的相对量值与由离子检测器安排55检测到的信号直接成正比。换句话说，检测器安排55产生一系列具有不同强度的峰，每个强度与每个离子包中的离子的相对丰度成比例。
[0066]然而，与现有技术相比，并且如在发明概述中所解释的，本发明人已认识到，尽管每个峰当然是具有一个特定质荷比的离子的结果，然而一种细菌种类的准确识别不要求给每个峰分配一个质量(也就是，不需要产生质谱)。相反，仅仅必要的是，闭合镜MR TOF安排12内的任何离子的最小停留时间Uftci)是足够长的，使得这些不同离子种类可以适当地分离，以便可以充分区分分离的峰。唯一的其他要求是将这些离子种类以一个特定顺序喷射。其原因在于，因为具有不同质荷比的离子以不同频率在闭合镜MR TOF安排12内振荡，所以不同离子包的相对位置(根据它们的质荷比进行分离)在&之后的不同时间h、t2、t3等等将是不同的。应注意，这不一定意味着时间h必须始终是相同的；确实在本发明的特别优选的方面，可以使用多个停留时间，并且同样地可以使用不同的停留时间产生谱。然而，必须可能的是通过停留时间的知识或与它相关联或衍生自它的参数将一个此类谱映射至另一个。要求一致性的原因是以便该产生的生物指纹可以与在已使用已知微生物建立的一个生物指纹的库或数据库中的等价的谱进行对等比较。
[0067]通过参见图5可以更好地理解实施本发明的原理，该图是对于不同反射次数的总飞行时间对m/z的示意图。如从图5中可以看出，例如，在3毫秒的总TOF (即，trt0=3毫秒)处，多个离子可以重合:例如已经历100次反射的具有刚刚高于两百的m/z的离子将与具有刚刚大于350的m/z并且已经历80次反射的离子，以及具有m/z=600并且已经历60次反射的离子，在该离子偏转器中重合。已具有不同反射次数的具有许多其他m/z的离子也将重合。为了清楚起见，仅在图5中示出了反射I次、20次、40次、60次…，但已经历2次、3次、4次、5次、6次…21次、22次、23次…反射的具有其他m/z的离子的重合也存在。然而，应注意，并非所有离子将必然重合，特别在高分辨率下，因为该m/z不是一个连续统，并且并非所有离子的组合将存在于一个谱内。
[0068]因此，所产生的谱不指定质量数、但反而指定一个“谱指纹”或“生物标识符”，其中该谱的纵轴仍是峰强度但该X轴不再是质量、质荷比、或飞行时间(其当然与m/z相关)。它是某一任意的谱或指纹坐标，具有的唯一要求是它是至少一致的或一致地已知的。
[0069]图6a和6b分别示出一个模拟的指纹和它的一个特写部分。在每个图中，该纵(y)轴表示由该样品获得的一个给定离子的丰度，以任意单位。该横(X)轴是时间单位；在本实例中，该时间是从将该样品注入该MR TOF中至从其进行喷射以及随后的检测(这是为什么该原点是在4毫秒处，而不是在零处)。图6a和6b的指纹不是来自一个真实的生物样品，而代替地是使用来自蛋白质组学实验的伪随机数据模拟的，以说明本发明的原理。在图6a中，示出了大约500个峰，尽管正常地获得小得多的数目的峰，由于当与一个数据库中的参考指纹相比时，一个小得多的数目典型地是足以准确识别一个样品。
[0070]图6a中的峰对应于从400道尔顿至24，000道尔顿的质量范围，尽管，如将理解的，这些峰是按照在时间h之后从该MR TOF中喷射的顺序，而不是按照逐渐上升的或下降的m/z顺序来排列的。
[0071]应注意，该非常宽的模拟峰(图6b中可见)是比在一个真实仪器中发现的宽得多的，其中这些峰的FWHM典型地将会预期为`I纳秒至最高达10纳秒的量级(与一个传统的TOF装置中的典型的亚纳米峰宽相比)。
[0072]图2至4示出了用于产生参考或样品谱指纹的仪器10的替代安排。图2至4中的许多部件对应于图1的部件并且因此用同样的参考号进行标记。
[0073]在图2中，闭合镜MR TOF安排12与图1的那个是相同的并且如所述的与那个图相关联。然而，图2的离子检测器安排55'不同于图1的那个。在图2的安排中，该离子检测器安排仍包括第一和第二转换倍增极或后加速倍增极60、60'以分别接收在各自方向上被偏转离开离子轴XX^的离子。然而，与图1的安排相比，在图2中，每个倍增极60、6(V产生撞击在一个单一电子倍增器70上的二次电子，该单一电子倍增器进而产生由一个数字化器80检测的二次电子。该数字化器进而与计算机90通讯。
[0074]在仍表示实施本发明的一个替代仪器10的图3的安排中，闭合镜MR TOF安排12再次与图1和2中示出的那个是相同的。然而，这次，离子检测器安排55"不包括任何转换倍增极。在图2的具体安排中也未示出后加速倍增极，尽管实际上使用后加速可以依然是所希望的，因为它有益于检测具有相对高的m/z的离子。
[0075]在图2的实施例中，将离子偏转离开镜轴XX'至对应的第一和第二电子倍增器70、70'上。这些进而各自产生由一个单一的数字化器80检测的二次电子簇射。该计算机收集由数字化器80数字化的数据。
[0076]最后，在图4中，离子偏转器装置50由第一和第二相对的扇形电场仪器组成，当被激励时，其使离子以相反方向行进离开镜轴XX^并且将每个离子引导到一个单一的电子倍增器70上。该单一的电子倍增器进而产生用于由数字化器80数字化的并且随后由计算机90收集的一个单一的二次电子簇射。
[0077]现在将描述该数据库的汇编的方式以及它在识别样品微生物中的使用。为了创建一种已知微生物的指纹，使用以上技术分析该微生物的一个样品，优选在如在图1至4中所示的一个仪器10中，但代替地任选地在一个TOF谱仪的常规安排中，其中该常规TOF的分辨率与图1至4的装置的分辨率是广泛地可比较的。虽然优选用于获得该已知微生物的一个谱指纹的闭合镜MR TOF安排12的参数可以是固定的(也就是，例如，在第一与第二离子镜20、20'之间的分离可以始终是相同的)，但这不是必须的。所必需的只是这些谱参数是至少已知的，这样使得使用这些已知微生物创建的参考谱指纹可以被映射(如有必要)到使用具有不同参数的仪器创建的样品指纹上。其一种实现方式是通过将一个内部校准物与该样品微生物一起使用，以便校准物的峰(或锁定质量)在该谱指纹内出现。优选地，使用两种或更多种锁定质量化合物。通过这样做，始终可能的是将不同的谱/指纹去卷积为一个标准化或可比较的形式。典型地在软件中进行该映射。以下将关于图8进一步描述使用锁定质量来帮助峰映射。
[0078]同样将理解的是，该已知微生物的数据库或库和它们的谱指纹可以是非常大的(均就保持在该数据库中的微生物的数目，和由此产生的计算机数据的容量而言)。这样，对于将该已知微生物的数据库或库在本地保持在，例如，计算机90的硬盘驱动器上可能既不实际也是不希望的。相反，可以优选的是例如经由因特网将该库维持在一个中央资料库以远程访问。在图1至4中示意性地示出了这种情况。当然，该数据库可以是在与仪器10不同的国家中。
[0079]—旦已经将该数据库或库建立，使用图1至4的仪器10分析有待识别的一个微生物的样品。该分析以之前所述的方式产生一个谱指纹。然后将在计算机90处产生的样品指纹经由因特网发送以在库100处与不同已知微生物的指纹进行比较，并且可以再次使用因特网将结果从库100中返回到计算机90中。其中需要进行转换，因为用于产生该样品指纹的参数不同于用于产生这些参考指纹的那些，转换可以发生在本地计算机90处或在本地至库/数据库100或在别处。比较的结果可以按已知方式作为按照在该样品微生物与库100中的已知微生物之间的匹配的可能性的顺序来排列的一系列潜在(已知的)微生物来提供。
[0080]尽管一个样品谱指纹与一个相对应的或映射的库谱指纹的一个单一比较是有效的，但在一个优选的实施例中，使用闭合镜MR TOF安排12内的不同停留时间，获得一个样品微生物的两个或更多个谱指纹。可以将从具有不同停留时间的相同样品提供的每个谱指纹映射到数据库100中的等价的多个参考谱指纹，然后可以实现对一个匹配(或另外地)的额外的置信度。例如，使用多个离子种类，在任何给定的停留时间下，存在具有完全不同质荷比的两个离子种类在这些离子被喷射的点处重叠的可能性，甚至尽管这些离子种类中之一将已经沿行(traversed)闭合镜MR TOF安排12—个不同于其他离子种类的数目的次数。通过使用多个停留时间，将发生在两种情况下的这种重叠的机会明显地减少或完全消除。
[0081]通过参见图7a和7b可以更好地理解该原理，图7a和7b分别示出了具有2个不同离子停留时间的模拟指纹。因为在图7b的指纹中(停留时间不小于4毫秒，也就是，在这些偏转器被激励以排空该阱之前，这些离子在这些离子镜之间在阱中来回移动至少4毫秒)，这些离子在该阱中驻留不长于在图7a的情况下(最小停留时间为2毫秒)，所以当这些偏转器被激励时，在各个情况下特定的离子种类将在该阱中的不同的相对位置。举一个具体实例，在图7b的指纹中(最小离子停留时间为4毫秒)，对应于具有m/z=2722.387和m/z=3961.83的离子的峰各自在t=4，040, 597.7纳秒时到达这些偏转器，尽管以相反方向行进到该双向偏转器中。因为它们同时到达，它们将是难以进行区分。
[0082]然而，通过重复该实验并且产生具有仅2毫秒的最小停留时间的一个指纹，来自具有m/z=2722.387和m/z=3961.83的离子的峰分别在2，020，299纳秒和2，020，367纳秒到达该双向偏转器(并且因此将被良好区分)。可以构建算法以使用来自由相同样品获得的两个(或更多个，当然)指纹的数据，但使用不同的最小停留时间，以便允许在这些指纹中的一个或其他中的重叠峰的消歧。
[0083]图8示出根据本发明的一个实施例的一个指纹的一部分的示意性图解。图8中的部分指纹不是从伪随机数据或类似物模拟的，而简单地展示了峰的一个可能构型，而未尝试示出该峰宽，由于这与本解释不是密切相关的。如以上所介绍的，可能并且确实希望的是将一个或多个锁定质量与有待识别的样品一起引入。锁定质量是具有已知m/z的离子，这些离子具有足够丰度的轮廓分明的峰以在质谱中提供一个清楚的参考点。在本发明的背景下，使用一个或多个(优选多于一个)锁定质量。该目的并非改进一个质谱本身，因为，如将理解的，本发明的指纹不是质谱、而代替地是每个样品和锁定质量离子的离子丰度的表示，对某一任意数值如喷射时间进行作图并且这些离子按照从该阱中喷射的顺序或按照被映射到从该阱中喷射的顺序的一个顺序进行排列。这个或这些锁定质量相反允许将校正应用到X (喷射时间，例如)和y (丰度)轴中的任一个或两个中的不同峰的位置，因为来自它们的预期的丰度/时间的测量的锁定质量峰的X和/或y方向中的任何偏移可以用于将一个校正应用到未知来源的其他峰上。
[0084]可以从图8中标记为A和B的峰看出这个原理；每个是从用虚线图示的预期位置偏移的(在高度和时间两者上)。该偏移可以用于提供用于所有其他峰的一个校正因子。
[0085]尽管在一些实施例中仅使用锁定质量以允许在其中的峰(来自锁定质量离子和样品离子两者)各自具有测量的丰度和喷射时间的基础上的一个指纹的校正，但通过使用多个锁定质量，根据本发明的其他实施例，进一步可能的是完全放弃测量样品离子的喷射时间的需要。相反，此类喷射时间可以从这些锁定质量的所确定的位置中推断出来。
[0086]尽管已经描述了一些具体实施例，但设想了不同的变更。例如，可以例如在一个折线安排中，使用多个偏转器的组合，而不是图1至4的单一离子偏转器装置。还将认识到这些偏转器不需要精确地在这些离子镜的中间；它们可以偏移至一侧或另一侧。此外，这些镜本身不需要是相同的。
[0087]所述的技术可以同样地在如在大阪大学(Osaka University)开发的并且例如由Toyoda等人,质谱杂志(J.Mass Spectrom.), 2003年,第38卷,第1125页至第1142页描述的一个多轮次飞行时间质谱仪(“MULTUM”)中使用。该装置具有一个八字形安排并且可以更易于排空，因为需要仅仅关闭这些扇形电场中之一就做到这点。
[0088]此外，尽管在产生细菌和霉菌的谱指纹中已经描述了具体实施例，设想该技术同样可应用于其他生物样品。该分辨率当然是足以允许细菌菌株以及种类的分析。
【权利要求】
1.一种识别样品的方法，该方法包括: (a)从有待识别的样品中产生样品离子； (b)在一个时间tO将这些样品离子引入一个样品多通飞行时间(TOF)质谱仪中并且导致这些离子中的至少一些沿该TOF质谱仪中的一个路径重复地行进，其中具有不同m/z的离子在飞行时间中分离，并且进一步地，其中具有至少一个第一 m/z的离子追上具有至少一个不同的第二 m/z的离子； (c)在一个时间tl(HO)开始将这些样品离子从该TOF喷射； (d)检测这些被喷射的离子；并且 (e)产生一个第一样品指纹，该第一样品指纹包含多个峰，每个峰由具有一个特定质荷比的离子产生并且按照对在tl时或之后它们从该多通TOF中喷射的顺序的依次关系来排列，但其中这些峰中的至少一些不按照m/z的依次顺序来排列，为了该样品的识别，该第一样品指纹与来自具有已知身份的样品的一个参考指纹的库是可比较的。
2.如权利要求1所述的方法，其中，该样品是一种微生物并且该库是一个已知微生物的参考指纹的库。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，进一步包括: 将该获得的第一样品指纹与一个参考指纹的库进行比较。
4.根据权利要求3所述的方法，进一步包括: 当获得该样品指纹与来自该库中的已知样品之一的一个参考指纹的匹配或最佳适配时，识别出该样品。
5.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中，这些峰关于从该多通TOF中喷射的时间进行分离。
6.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中，该来自具有已知身份的样品的参考指纹的库是使用一个或多个参考TOF产生的，该一个或多个参考TOF具有与用于识别该样品的样品TOF实质上相同的谱仪参数，样品离子在该多通TOF中的停留时间被定义为在将样品离子注入该多通TOF中与开始从其喷射之间的时间段，(tl-tO)，实质上与从用于产生这个或这些参考多通TOF中的参考指纹的库的来自已知样品的离子的停留时间是相同的。
7.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，该来自具有已知身份的样品的参考指纹的库是使用一个或多个参考多通TOF产生的，该一个或多个参考多通TOF具有与用于识别该样品的样品多通TOF不同的谱仪参数，该方法进一步包括将一个校正算法应用到该样品指纹和/或该参考指纹上，使得该样品多通TOF中的样品离子种类的有效停留时间被定义为在将样品离子注入该多通TOF中与开始从其喷射之间的时间段，时间(tl-tO)，对这些不同的多通TOF的谱参数中的差异进行调整，并且这个或多个参考TOF中的参考离子种类是相同的。
8.如以上 任何一项利要求所述的方法，进一步包括: (f)在一个时间t2(古tO;tl)，将从该样品产生的另外的样品离子引入该样品多通TOF中； (g)在一个时间t3(H2)开始将这些另外的样品离子从该TOF中喷射，其中该TOF中的另外的样品离子的一个第二停留时间，被定义为在将这些另外的样品离子注入该多通TOF中与将这些另外的样品离子从其开始喷射之间的时间段，(t3-t2)，是不同于用于产生该第一指纹的那些样品离子的停留时间(tl-to)； (h)检测这些被喷射的另外的样品离子；并且 (i)产生一个第二样品指纹，该第二样品指纹与该来自具有已知身份的样品的参考指纹的库也是可比较的。
9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，该样品多通TOF包括第一和第二离子镜，该第一和第二离子镜被安排为彼此相对，以便形成具有一个镜像反射轴的、用于离子行进的一个闭合路径，该样品TOF进一步包括沿所述反射轴放置的一个双向偏转器安排；该方法进一步包括: 在所述时间tl开始，使用该双向偏转器安排将以从该第一离子镜至该第二离子镜的一个第一方向沿该镜轴行进的样品离子偏转离开该镜轴，向一个用于检测的检测器安排偏转 还在所述时间tl开始，使用该双向偏转器安排将以从该第二离子镜至该第一离子镜的一个第二方向沿该镜轴行进的样品离子偏转离开该镜轴，向该用于检测的检测器安排偏转。
10.如权利要求8所述的方法，其中，该样品多通TOF包括第一和第二离子镜，该第一和第二离子镜被安排为彼此相对，以便形成具有一个反射轴的一个闭合路径，该样品TOF进一步包括沿所述反射轴放置的一个双向偏转器安排；该方法进一步包括: 在所述时间tl和t3开始，使用该双向偏转器安排将以从该第一离子镜至该第二离子镜的一个第一方向沿该镜轴行进的样品离子偏转离开该镜轴，向一个用于检测的检测器安排偏转； 在所述时间tl和t3开始，使用该双向偏转器安排将以从该第二离子镜至该第一离子镜的一个第二方向沿该镜轴行进的样品`离子偏转离开该镜轴，向该用于检测的检测器安排偏转。
11.如权利要求9或权利要求10所述的方法，其中，该检测器安排包括第一和第二检测器，该方法进一步包括将以该第一方向行进的样品离子向该第一检测器偏转，同时将以该第二方向行进的样品离子向该第二检测器偏转。
12.如权利要求11所述的方法，进一步包括使这些检测器中的离子进行后加速。
13.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，该样品多通TOF包括多个扇形电场和/或扇形磁场，它们被安排为形成用于离子行进的一个闭合赛道或八字形路径，该样品TOF进一步包括沿着所述离子行进路径放置的一个偏转器安排；该方法进一步包括: 在所述时间tl时或之后，使用该偏转器安排将沿该离子路径行进的样品离子向一个用于检测的检测器安排偏转。
14.如以上任何一项权利要求所述的方法,进一步包括将各自具有一个已知身份和在该多通TOF中的停留时间的锁定质量离子与这些样品离子一起引入，该检测这些被喷射的离子的步骤(d)包括检测这些样品离子和这些锁定质量离子两者，并且步骤(e)包括产生一个样品指纹，该样品指纹包括由这些样品离子和这些锁定质量离子两者获得的峰。
15.如权利要求14所述的方法，进一步包括使用这些锁定质量离子的已知身份和停留时间来校正该指纹中的样品峰的位置和/或高度。
16.一个用于识别样品的多反射飞行时间(MR T0F)质谱仪，包括:一个用于产生样品离子的离子源； 一个闭合镜MR TOF安排，该闭合镜MR TOF安排具有第一和第二离子镜，该第一和第二离子镜被放置为沿一个反射轴彼此相对； 沿该反射轴放置的并且配置的一个双向离子偏转器安排； (i)以便在引入该闭合镜MR TOF安排中之后在一个时间tl开始，将从该离子源引入该闭合镜MR TOF安排中的并且以从该第一离子镜至该第二离子镜的一个第一方向沿该反射轴行进的样品离子偏转到一个离子检测器安排中；并且 (?)以便也在所述时间tl开始，将从该离子源引入该闭合镜MR TOF安排中的并且以从该第二离子镜至该第一离子镜的一个第二方向沿该反射轴行进的样品离子偏转到该离子检测器安排中。
17.如权利要求16所述的MRTOF质谱仪，其中，该检测器安排包括一个数据收集装置，该数据收集装置被配置为采集由多个数据峰组成的一个样品指纹，每个峰由具有一个特定质荷比的离子产生并且按照对在tl时或之后它们从该多通TOF中喷射的顺序的依次关系来排列，但其中这些峰中的至少一些不按照m/z的依次顺序来排列。
18.如权利要求16或17所述的MRTOF质谱仪，其中，将该双向离子偏转器安排沿该反射轴放置在该第一离子镜与第二离子镜之间的大体上中间。
19.如权利要求16、权利要求17、或权利要求18所述的MRTOF质谱仪，其中，该离子检测器安排包括第一和第二离子检测器，该第一离子检测器被安排为检测由该双向离子偏转器偏转的并且已经恰在反射之前在该闭合镜MR TOF安排中以所述第一方向行进的样品离子，该第二离子检测器被安排为检测由该双向离子偏转器偏转的并且已经恰在反射之前在该闭合镜MR TOF安排中以所述第二方向行进的样品离子。
20.如当从属于权利要求17或权利要求18时的权利要求19、或当从属于权利要求17时的权利要求18所述的MR TOF质谱仪，其中，该第一检测器包括在一个第一电子倍增器上游的一个第一转换或后加速倍增极，并且该第二检测器包括在一个第二电子倍增器上游的一个第二转换或后加速倍增极，该检测器安排进一步包括用于将该第一和第二电子倍增器的输出进行数字化的一个数字化器，该数据收集装置与用于采集所述样品指纹的数字化器进行通讯。
21.如当从属于权利要求17或权利要求18时的权利要求19、或当从属于权利要求17时的权利要求18所述的MR TOF质谱仪，其中，该第一检测器包括一个第一转换或后加速倍增极，其中该第二检测器包括一个第二转换或后加速倍增极，并且其中该离子检测器安排进一步包括在该第一和第二倍增极下游的一个电子倍增器以及用于将该电子倍增器的输出进行数字化的一个数字化器，该数据收集装置与用于采集所述样品指纹的数字化器进行通讯。
22.如当从属于权利要求17或权利要求18时的权利要求19、或当从属于权利要求17时的权利要求18所述的MR TOF质谱仪，其中，该第一检测器包括一个第一电子倍增器，其中该第二检测器包括一个第二电子倍增器，该离子检测器安排进一步包括用于将该第一和第二电子倍增器的输出进行数字化的一个数字化器，该数据收集装置与用于采集所述样品指纹的数字化器进行通讯。
23.如权利要求16至22中任一项所述的MRTOF质谱仪，其中，该双向离子偏转器是一个双向扇形电场离子偏转器。
24.如权利要求16至23中任一项所述的MRTOF质谱仪，其中，该离子源是一个基质辅助激光解吸电离(MALDI)离子源。
25.如权利要求16至24中任一项所述的MRTOF质谱仪，其中，该第一和/或第二检测器包括后加速装置。
26.如权利要求16至25中任一项所述的MRTOF质谱仪，其中，该第一和/或第二检测器包括或包含多个放大装置如微通道板、闪烁器、和/或光电倍增器的组合。
27.一种为代表多个不同参考样品的参考指纹的数据库产生参考指纹的方法，该方法包括: (a)从该参考样品中产生参考离子(b) 在一个时间tO将这些参考离子引入一个参考多通TOF质谱仪中并且导致这些离子中的至少一些沿该TOF质谱仪中的一个路径重复地行进，其中具有不同m/z的离子在飞行时间中分离，并且进一步地，其中具有至少一个第一 m/z的离子追上具有至少一个不同的第二 m/z的离子； (c)在一个时间tlOtO)开始将这些参考离子从该参考多通TOF中喷射； (d)检测这些被喷射的离子；并且 (e)广生该参考样品的参考指纹，其中该参考指纹的每个峰由具有一个特定质荷比的离子产生并且按照对在tl时或之后它们从该多通TOF中喷射的顺序的依次关系来排列，但其中这些峰中的至少 一些不按照m/z的依次顺序来排列，该参考指纹与一个来自有待识别的样品的样品指纹是可比较的，以确定是否该样品指纹是与该产生的参考指纹的一个匹配。
28.如权利要求27所述的方法，其中，该参比样品和该有待识别的样品各自是一种微生物。
29.如权利要求27或权利要求28所述的方法，进一步包括: 将该产生的参考指纹保存在代表多个不同样品的参考指纹的一个数据库或库中。
30.根据权利要求29所述的方法产生的一个参考指纹的数据库或库。
【文档编号】H01J49/00GK103635988SQ201280033278
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年6月19日 优先权日:2011年7月4日
【发明者】A·詹纳考普洛斯 申请人:塞莫费雪科学（不来梅）有限公司