单体速效胰岛素及其制法和用途的制作方法

专利名称：：单体速效胰岛素及其制法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医学和药物学领域。更具体地，本发明涉及新的胰岛素B链、新的单体速效胰岛素、以及含所述单体速效胰岛素的药物组合物。本发明还涉及所述的单体速效胰岛素的制法。
背景技术：
：糖尿病发病率逐年上升，并能引发心血管疾病致死，是当今威胁人类健康的主要疾病之一。根据theUnitedKingdomProspectiveDiabetesStudy的结果表明糖尿病的治疗措施定位为实施精细血糖控制从而避免糖尿病综合症。尽管胰岛素通常用于I型糖尿病，但是近期研究表明1/3的II型糖尿病人最终也是需要补充胰岛素以控制血糖浓度。正常人体内是以分泌胰岛素来调控血糖浓度，一般是在进餐后30-60分钟血液生理胰岛素浓度达到峰值，4-5小时后恢复到基础浓度，这样能够保证血糖浓度不因进餐而有大的波动。胰岛素必须以单体形式才能与其受体结合，然后发挥其生物学效应。而普通天然胰岛素制剂在中性注射浓度是聚合体，吸收缓慢，不能模拟体内胰岛素正常的生物学时相。而单体胰岛素由于在中性溶液高浓度不聚合而能很快吸收发挥作用(图1)。因此单体速效胰岛素成为治疗糖尿病及其他疾病的新一代药物。精细胰岛素治疗(intensiveinsulintreatment)模拟正常人体胰岛素分泌时相。通过在餐前注射速效胰岛素平稳餐后血糖浓度，及注射中效或长效胰岛素或胰岛素泵以维持餐间和夜间血糖浓度，预防出现夜间高血糖，从而可以降低糖尿病所引起的综合症的发病率和致死率。目前速效胰岛素主要通过基因工程方法获得。EliLilly公司开发的单体胰岛素Lyspro于1996年分别在欧洲和美国用于临床，取得很好效果。皮下注射Lyspro后15分钟起效。目前Novo公司研发的另一种单体胰岛素Aspart也已上市。(Howey，D.C.，etal.，Diabetes,1994,43:396_402；Torlone,E.etal.，Diabetologia,1994,37:713_720；Rami,B.etal.,Eur.J.Pediatr.1999,156:838_840；Vajo,Ζ.etal.Pharmacologicalreviews.2000,52:1_9)。从猪胰脏提取的猪胰岛素在临床上已经用了半个多世纪，其生产工艺已非常成熟，成本也较低。但近十年来，由于基因工程人胰岛素的出现和应用，猪胰岛素的市场受到很大冲击，出现过剩，最后可能完全被重组人胰岛素代替而退出市场。如何利用这一资源是一个迫在解决的问题。综上所述，本领域迫切需要开发各种新的单体胰岛素，尤其需要开发对猪胰岛素(包括基因工程制备的猪胰岛素)进行再加工方法，以便简便和低成本地提高猪胰岛素的利用价值。
发明内容本发明目的就是提供一种新的单体速效胰岛素。本发明的另一目的是提供含有该单体胰岛素的药物组合物。本发明再一目的是提供所述单体胰岛素的制法和用途。在本发明的第一方面，提供了一种胰岛素B链，所述的胰岛素B链在对应于天然胰岛素B链第22位上为酸性氨基酸，所述的酸性氨基酸选自谷氨酸或天冬氨酸。在另一优选例中，所述的胰岛素B链具有以下氨基酸序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式I其中，X为Glu，Asp。在本发明的第二方面，提供了一种胰岛素或其药学上可接受的盐，所述的胰岛素由胰岛素A链和B链构成，所述的胰岛素B链是本发明所述的胰岛素B链。在另一优选例中，所述的胰岛素是单体胰岛素，因而是速效胰岛素。在另一优选例中，所述胰岛素的结构如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式II其中，X为Glu，Asp。在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有本发明第二方面中所述的胰岛素或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型是片剂、针剂、颗粒剂、溶液剂。在本发明第四方面，提供了一种单体胰岛素表达前体，从氨基端至羧基端分别含有第1方面所述的胰岛素B链、连接肽、和胰岛素A链。在另一优选例中，所述的连接肽是Ala-Ala-Lys。在本发明的第五方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明上述的所述的胰岛素B链，或编码本发明上述的所述的单体胰岛素表达前体。在另一优选例中，所述的多核苷酸是DNA。在另一优选例中，所述的编码单体胰岛素表达前体的多核苷酸的序列是ttcgtt3-3-CCQ-Q-C3.CttgtgcggttcccacttggttgaggetttgtacttRRtttRCRRtRaaRaaRRtttcttctacactcctaaggetgetaagggtattgtcgaacaatgctgtacctccatetgctccttgtaccaattggaaaactactgcaac。在本发明的第六方面，提供了一种表达载体，它含有第五方面中所述的多核苷酸。在本发明的第七方面，提供了一种宿主细胞，它含有第六方面中所述的表达载体。在本发明的第八方面，提供了一种制备胰岛素的方法，包括以下步骤(a)在表达条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞含有编码单体胰岛素表达前体的DNA，从而表达出所述的单体胰岛素表达前体；其中所述的单体胰岛素表达前体从氨基端至羧基端分别含有胰岛素B链、连接肽、和胰岛素A链，其中胰岛素B链具有以下氨基酸序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGEXGFFYTPK,式中，X为Glu，Asp，而且，连接肽为Ala-Ala-Lys；(b)分离出所述的单体胰岛素表达前体；(c)用胰蛋白酶酶切割所述的单体胰岛素表达前体，从而切下连接肽，形成由胰岛素A链和胰岛素B链构成的胰岛素；(d)分离出单体胰岛素。在另一优选例中，所述的单体胰岛素具有式II所示结构GIVEQCCTSICSLYQLENYCN式IIFVNQHLCGSHLVEALYLVCGEXGFFYTPK其中，X为Glu，Asp。在本发明第九方面，提供了一种单体胰岛素或其药学上可接受的盐，所述的胰岛素由胰岛素A链和胰岛素B链构成，所述的胰岛素B链在B链羧基端去除8个氨基酸并且在对应于天然胰岛素B链的23和24位上添加了氨基酸GX’，其中X’为Phe或Phe-NH2。在另一优选例中，所述的胰岛素具有以下结构GIVEQCCTSICSLYQLENYCNιI式(III)FVNQHLCGSHLVEALYLVCGRGX'式中，X，为Phe、Phe-NH2或Phe-OH。在本发明的第十方面，提供了一种产生本发明第九方面中所述的单体胰岛素的制备方法，包括步骤(1)在胰蛋白酶催化下，将去B链羧端八肽胰岛素(DOI)与GX’接触，从而在去B链羧端八肽胰岛素(DOI)的羧基端与GX’之间形成肽键，形成权利要求1所述的单体胰岛素；或者，在胰蛋白酶催化下，将胰岛素或其前体与过量GX’接触，从而在胰岛素B22位上发生酶促转肽，形成权利要求11所述的单体胰岛素；(2)分离出所形成的权利要求11所述的单体胰岛素。在另一优选例中，将胰岛素或其前体与过量GX’之间的摩尔比为110至1100。在另一优选例中，所述的胰岛素或其前体或去B链羧端八肽胰岛素来源于人、或猪。在本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，它含有本发明第九方面中所述的所述单体胰岛素或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型是片剂、针剂、颗粒剂、或溶液剂。图1是生理分泌胰岛素、单体胰岛素、天然药剂胰岛素注射后血液浓度的时相图。横坐标为时间，纵坐标为血液中三种胰岛素的浓度。图2显示了B22Glu-desB30胰岛素的HPLC制备结果。C18柱(Beckman，4.6x250mm)，流动相B为含0.08%TFA的70%乙腈，流动相A为含0.1%TFA的水，梯度(流动相B30-50%/30min)，流速为2ml/min。横坐标为流出时间，纵坐标为A28(lnm。图3显示了pH8.3聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。胶浓度为15%，考马斯亮兰染色。从左到右分别为泳道1单链胰岛素前体(上)，猪胰岛素(下)；泳道2:B22Glu-desB30胰岛素。图4显示了在中性溶液中的脱锌猪胰岛素浓度对其凝胶层析行为的影响。Superdex75柱，流动相为pH7.4的磷酸缓冲液，流速为0.5ml/min；多肽浓度从低到高分别为38μM(0.22mg/mL)、75μM(0.43mg/mL)、150μM(0.86mg/mL)、300μΜ(1·73mg/mL)、600(3.46mg/mL)μΜ。横坐标为保留时间(单位分钟)，纵坐标为A230nm0图5显示了在中性溶液中B22GlU-desB30胰岛素的浓度对其凝胶层析行为的影响。SuperdeX75柱，流动相为pH7.4的磷酸缓冲液，流速为0.5ml/min；多肽浓度从低到高分别为2，5，10mg/mL。横坐标为保留体积(单位毫升)，纵坐标为A28(lnm。图6显示了B22GlU-desB30胰岛素的远紫外(上)和近紫外(下)圆二色谱分析。实线表示样品B22GlU-desB30胰岛素，虚线表示样品去B链羧端丙氨酸胰岛素。样品浓度为35μM，缓冲液为20毫摩ρΗ7.4磷酸钾。图7显示了在中性溶液中DHI-NH2的浓度对其凝胶柱层析行为影响。SuperdeX75柱，流动相为PH7.4的磷酸缓冲液，流速为0.5ml/min;多肽浓度从低到高分别为38μM(0.19mg/mL)、75μΜ(0·38mg/mL)、150μM(0·76mg/mL)、300μM(1·52mg/mL)、600μM(3.04mg/mL)。横坐标为保留时间(单位分钟)，纵坐标为A23(lnm。图8显示了脱锌胰岛素和DHI-NH2在中性溶液下SuperdeX75柱层析所得到的分配系数(Kd)值与多肽浓度关系曲线。横坐标为多肽浓度，纵坐标为Kd值。具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，发现胰岛素B链C端肽段，对胰岛素的自身聚合具有重要影响。更出乎意料的是，将去B30胰岛素B22位由碱性氨基酸突变为酸性氨基酸后居然可以得到胰岛素类似物B22E去B30胰岛素，该胰岛素不仅具有单体胰岛素(生理pH值、较高浓度时不聚合)的性质，而且整体生物活力为正常胰岛素的50%。此外，替换掉这一碱性氨基酸，还减少蛋白酶酶切位点，从而降低生产过程中的风险，便于重组生产。目前已知道去B链羧端八肽胰岛素(DOI)和去B链羧端七肽胰岛素(DHpI)几乎没有胰岛素活性。本发明人还发现，胰岛素B链C端肽段对胰岛素的结构与功能都起着非常重要的作用。胰岛素晶体结构分析证明B21-B23形成β-转折，而B24-B26形成分子间的反平行结构。这些对胰岛素形成二聚体极其重要。本发明人意外发现，在B链羧端八肽胰岛素(DOI)基础上，在胰岛素B链的羧基端通过胰蛋白酶酶促合成或胰蛋白酶酶促转肽反应，可以极其方便低廉地添加氨基酸GX’，从而形成既具有较高活性的小胰岛素分子(具有约40%天然活性)，而且不会形成二聚体，因而是一种具有较高活性的单体胰岛素分子。具体地，在本发明的第一部分提供了新的胰岛素B链(B22为酸性氨基酸)、含该B链的单体胰岛素、含所述单体胰岛素的药物组合物。本发明的胰岛素类似物B22E去B30胰岛素(B22EDes-B30胰岛素)或B22D去B30胰岛素(B22DDes-B30胰岛素)，用甲醇酵母表达其前体，经酶切得到高纯度的样品。并证明其具有单体胰岛素(生理PH值、较高浓度时不聚合)的性质，整体生物活力为正常胰岛素的50%。第二部分提供了新的B链羧端缩短的去六肽胰岛素(DHI)及其衍生物(DHI-NH2)。它们是以(1)人或猪胰岛素的大片段，即去B链C端八肽胰岛素(DOI)为原料经与甘氨酸·苯丙氨酸二肽或二肽酰胺酶促合成或(2)猪胰岛素、人胰岛素或单链胰岛素前体为原料与二肽或二肽酰胺经胰蛋白酶在B22位酶促转肽而得。实验证明这类胰岛素类似物在中性溶液中和较高浓度时仍为单体胰岛素，并具有40%胰岛素体内活力。术语如本文所用，术语“B22Glu-desB30胰岛素”指B链22位氨基酸为谷氨酸的去B链羧端丙氨酸胰岛素。其中胰岛素B链的基本结构如下FVNQHLCGSHLVEALYLVCGEXGFFYTPK式I(SEQIDNO1)其中，X为Glu，Asp。更佳地，所述的胰岛素B链如下所示FVNQHLCGSHLVEALYLVCGEEGFFYTPK(SEQIDNO2)如本文所用，术语“DHI”是指去B链羧端六肽后所形成的胰岛素。一种优选的DHI的基本结构为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式中，X，为Phe、Phe-NH2、Phe-0H、或其他能使其成为单体的基团。在式III中，RGX，分别对应于天然胰岛素B链的第22、23和24位。如本文所用，“本发明的多肽”指B22Glu-desB30、含B22Glu-desB30的胰岛素和DHI,DHI-NH2以及它的衍生物(包括药学上可接受的盐)。如本文所用，术语“D0I”是指胰岛素B链C端截去八个氨基酸所形成的胰岛素类似物。本发明多肽及其制备方法本发明的多肽可以是重组多肽或酶促合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是酶促合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。以B22Glu-desB30胰岛素为例，本发明的B22Glu-desB30胰岛素核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明中，B22Glu-desB30胰岛素多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含B22Glu-desB30胰岛素编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的Iac或trp启动子真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS细胞等动物细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结I=IO在一优选例中，本发明的B22GlU-desB30胰岛素是先以单体胰岛素表达前体形式表达，然后在经酶切处理得到B22GlU-desB30胰岛素。从氨基端至羧基端，单体胰岛素表达前体分别含有本发明的胰岛素B链、连接肽、和胰岛素A链。连接肽没有特别限制，只要起连接作用，并且在与A链相连的氨基酸残基为Lys或Arg即可。一类连接肽例子是(Ala)2_5Lys，例如Ala-Ala-Lys。酶切处理可以用任何切割Lys和/或Arg的酶，例如胰蛋白酶。酶切条件可根据选用的酶而变化。一种优选的酶切条件是溶剂=IOOmM碳酸氢铵缓冲液，pH:7-8，底物浓度，约10mg/ml，胰蛋白酶用量，约为底物质量1/100，4-25°C，1_6小时。B22Glu-desB30胰岛素前体酶切后，用反向疏水层析等方法分离酶切产物，即可获得本发明第一部分的B22Glu-desB30胰岛素。本发明式III所示的单体胰岛素，可以用人胰岛素、猪胰岛素或其前体或去B链羧端八肽胰岛素为原料，用本领域常规的胰蛋白酶酶促合成或胰蛋白酶酶促转肽反应制备。一种优选方法方法是在胰蛋白酶催化下，将去B链羧端八肽胰岛素(DOI)与GX’接触，从而在去B链羧端八肽胰岛素(DOI)的羧基端与GX’之间形成肽键，从而形成式III所示的单体胰岛素。然后，分离出所述的单体胰岛素。在优选例中，所述的胰蛋白酶酶促合成条件通常为PH6-8.5，温度30°C-37°C，时间6_24小时。另一种优选方法是在胰蛋白酶催化下，将胰岛素或其前体与过量GX’接触，从而在胰岛素B22位上发生酶促转肽，形成式II所示的单体胰岛素。然后，分离出所述的单体胰岛素。较佳地，胰岛素或其前体与过量GX’的摩尔比为110至1100。在优选例中，所述的胰蛋白酶酶促转肽条件通常为PH6.5-8.5，温度30°C_37°C，时间6_20小时。药物组合物本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明单体胰岛素或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。适用于本发明的药学上可接受的载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。本发明药物组合物可用于治疗糖尿病及其并发症。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明所述的单体速效胰岛素或其药学上可接受的盐施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明的单体胰岛素不仅可以单独使用，还可以与其他治疗糖尿病的药物(如其他胰岛素)一起使用。本发明的主要优点在于(1)本发明的胰岛素具有强的单体性质，即在中性pH(如生理pH)下，较高浓度时仍不会聚合。(2)含有该结构的胰岛素的药物组合物用于注射以外的给药途径，有很高的生物利用度。(3)将国际市场丰富而又濒临被淘汰的猪胰岛素通过酶促方法转变为附加值更高的单体速效胰岛素类似物，改善了使用天然胰岛素必须通过解聚过程而带来的滞后效应，同时制法简便、低廉。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1基因工程表达B22Glu_desB30胰岛素在本实施例中，将B22Glu-desB30胰岛素的B链C端用连接肽(如Ala-Ala-Lys)与其A链N端相连构成表达前体(EPIP)，因为前体的结构有利于胰岛素在生物合成后折叠并形成正确的二硫键。步骤如下用DNA合成方法得到前体基因，序列如下所示；ttcgttaaccaacacttgtgcggttcccacttggttgaggetttgtacttggtttRCRRtRaaRaaRRtttcttctacactcctaaggetgetaagggtattgtcgaacaatgctgtacctccatetgctccttgtaccaattggaaaactactgcaac(SEQIDNO:3)两端添加BamHl和EcoRl酶切位点后，利用BamHl和EcoRl酶切位点克隆到PPIC9K(购自INVITR0GEN公司)质粒中得到pPIC9K/EPIP。pPIC9K/EPIP，经BglII线性化处理后转化到常规的甲醇酵母P.pastoris(购自INVITR0GEN公司)中，用高浓度G418选出转入前体基因的菌株，得到多个表达EPIP的甲醇酵母工程菌。对选出的工程菌通过高密度发酵，得到发酵产物。发酵产物经疏水层析得到EPIP。结果表明，EPIP经胰蛋白酶酶切(溶剂100mM碳酸氢铵缓冲液，pH:7.8，4°C，2小时)处理后，经分子筛层析，HPLC(图2)纯化得到高纯度的B22GlU-desB30胰岛素(图3)。质谱测定分子量为5677.8，与理论值相一致。实施例2脱锌胰岛素自聚合性质的测定在本实施例中，用常规方法测定对脱锌胰岛素的自聚合性质。在中性溶液中较高浓度的胰岛素以单体、二体、六体的混合物形式存在。用分子筛层析Superdex75(HR10/30)柱，流动相为磷酸盐缓冲液，pH7.4，流速为0.5ml/min,上样量为40微升，室温，230nm检测，多肽浓度从低到高分别为38μΜ(0.22mg/mL)、75μM(0.43mg/mL)、150μM(0.86mg/mL)、300μΜ(1·73mg/mL)、600(3.46mg/mL)μΜ。用分配系数Kd描述混合物的平均分子量。Kd=(Vr-VtlV(Vc-Vtl),其中Vr为流出体积，Vtl为外水体积，Vc为总的柱床体积。结果表明，随着脱锌胰岛素浓度的上升，其在Superdex75柱上的保留时间缩短、峰的不对称性增强，Kd值不断减小(图4，表1，图8)，说明较高浓度的胰岛素在中性溶液中是不均一的含有多种聚合体的混合物。天然胰岛素药剂浓度为250μM(l.5mg/ml)，根据上述结果在注射浓度下胰岛素是以聚合物的形式存在。表1天然胰岛素在分子筛Superdex75(HR10/30)柱层析上的Kd值<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例3B22Glu-des-B30胰岛素自聚合性质在分子筛柱层析上的测定在本实施例中，对实施例1制备的单体胰岛素用常规方法测定其自聚合性质。除多肽浓度以外，实施条件同实施例2。多肽浓度为2mg/ml，5mg/ml，10mg/ml.随着多肽的浓度的上升，B22Glu-desB30胰岛素的出峰时间，峰形和Kd值不随多肽浓度变化而变化(图5，表2)。这说明在注射浓度500μΜ(3π^/πι1)Β2261ιι-(Θ8Β30胰岛素是以单体的形式存在。表2B22Glu-desB30胰岛素在分子筛柱Superdex75(HR10/30)柱层析上的Kd值<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例4B22Glu-desB30胰岛素自聚合性质在圆二色谱仪上的测定一、方法pH7.4磷酸钾缓冲液，样品浓度35μM，室温，Jasco-715旋光分光计，远紫外光谱在0.Icm宽的样品池中从250nm扫描到190nm，，近紫外光谱在l.Onm宽的样品池中从245nm扫描到300nm。二、结果B22Gludes-B30胰岛素与同浓度的去B链羧端丙氨酸胰岛素相比，在208nm和273nm的吸收负值明显减少(图6)，表明在中性溶液即使较低的多肽浓度下，B22GlU-des-B30胰岛素溶液中的单体含量也要高于同浓度的去B链羧端丙氨酸胰岛素。去B链羧端丙氨酸胰岛素的聚合性质与天然胰岛素相同。实施例5B22Glu-desB30胰岛素体内生物活性测定一、方法小鼠惊厥法(中国药典，1985)雄性昆明小鼠，体重为18_22g，按体重随机分四组，每组10只，实验前禁食2小时。样品用盐酸调至PH值为2.5的生理盐水溶解，当多肽浓度为lmg/ml时，280nm吸收值为1。估计样品效价为标准品的50%，高剂量为0.27U/ml，低剂量为0.135U/ml，溶剂为盐酸调节PH为2.5的生理盐水。25°C，15分钟内每只小鼠皮下注射0.2ml，置于37°C观察90分钟，惊厥的、死亡的、使其仰卧后3秒内不能自行翻身者均认为是阳性反应。数据按质反应测定法计算。二、结果小鼠惊厥法测得活性为13.5U/mg，可信限率FLV0^23.5%(<30%)(表3)；实验中所用的标准品为中检所提供的27U/mg的胰岛素。B22GlU-desB30胰岛素的活性为天然胰岛素的50%。表3小鼠惊厥法测定B22Glu-desB30胰岛素的生物活性(中国药典，1985版)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例6以DOI为原料酶促合成DHI-NH2或DHI60mgDOI(去B链羧端八肽猪胰岛素)和120mg的H-Gly-Phe-NH2溶于2毫升含0.2MTris,70%1.4-丁二醇和10%DMSO中，pH调至7.6，加入TPCK-处理的胰蛋白酶，溶液在37°C下反应20小时，酶总共用6mg，分三次加入，即0，2和6小时。反应完后经S印hadexG50凝胶过滤除去酶及多余小肽，主峰冻干后经DEAE-S印haroseCL-6B柱层析分离，得到纯的DHI-NH2。DHI-NH2的质谱鉴定为5067，符合理论分子量5068。以DOI为原料用GlyPhe和胰蛋白酶酶促缩合可得DHI，DHI的质谱测定为5069，符合理论分子量5069.6。按实施例5的条件测得DHI和DHI-NH2整体生物活力为10.8IU/mg,为天然胰岛素的40%。实施例7胰蛋白酶酶促转肽方法制备DHI和DHI-NH2猪胰岛素，人胰岛素或者它们的前体在过量GX’存在下，通过胰蛋白酶在B22位上的转肽反应而得到DHI或DHI-NH2。现以人胰岛素前体为例人胰岛素前体冻干粉用DMSO溶解，加入10倍过量的GX’(克分子比，其中V=Phe)。加入1，4-丁二醇，用氨水调pH至6.5-7.0，加水至DMSO水1，4_丁二醇=151570(体积比)。前体的浓度为20-30mg/ml，然后加入前体1/5重量的胰蛋白酶。35摄氏度下反应过夜。反应液用酸丙酮沉淀，离心，去上清液，沉淀除去丙酮后用离子交换或HPLC分离，得目的产物。结果与实施例6相同，DHI的质谱测定为5069，符合理论分子量5069.6。按实施例5的条件测得DHI和DHI-NH2整体生物活力为10.9IU/mg,为天然胰岛素的40%。实施例8DHI-NH2胰岛素自聚合性质的测定实施条件完全同实施例2。随着多肽浓度的上升，DHI-NH2胰岛素的出峰时间，峰形和Kd值几乎不随多肽浓度的变化而变化(图7，表4，图8)。这说明DHIX系列胰岛素为单体胰岛素。表4DHI_NH2在分子筛Superdex75(HR10/30)柱层析上的Kd值<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例9药物组合物按以下配方混合各组分，制得胰岛素B22Glu-Des30(式II)和DHI(式III)的注射剂。配方A<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>配方B<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求一种单体胰岛素或其药学上可接受的盐，所述的胰岛素由胰岛素A链和胰岛素B链构成，其特征在于，所述的胰岛素B链在B链羧基端去除8个氨基酸并且在对应于天然胰岛素B链的23和24位上添加了氨基酸GX’，其中X’为Phe或Phe-NH2。2.如权利要求1所述的胰岛素或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的胰岛素具有以下结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式(III)式中，X’为Phe、Phe-NH2或Phe-OH。3.—种产生权利要求1所述的单体胰岛素的制备方法，其特征在于，包括步骤(1)在胰蛋白酶催化下，将去B链羧端八肽胰岛素(DOI)与GX’接触，从而在去B链羧端八肽胰岛素(DOI)的羧基端与GX’之间形成肽键，形成权利要求1所述的单体胰岛素；或者，在胰蛋白酶催化下，将胰岛素或其前体与过量GX’接触，从而在胰岛素B22位上发生酶促转肽，形成权利要求1所述的单体胰岛素；(2)分离出所形成的权利要求1所述的单体胰岛素。4.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述单体胰岛素或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。全文摘要本发明涉及新的胰岛素B链、单体速效胰岛素、以及含所述单体速效胰岛素的药物组合物。本发明还涉及所述的单体速效胰岛素的制法和用途。文档编号C07K14/62GK101817878SQ20101012712公开日2010年9月1日申请日期2006年4月29日优先权日2006年4月29日发明者崔大敷,张友尚,朱尚权,石嘉豪,费俭,都海娟,陆怡申请人:上海生物泰生命科技研究有限公司