专利名称：：聚羟基乙酸-猪胰岛复合物的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种猪胰岛移植复合物的制备方法。
背景技术：
：猪的胰岛素分子与人胰岛素分子最为接近，仅有1个氨基酸不同。猪胰岛素与人胰岛素血糖调定点相似，猪胰岛细胞能在人血清中存活并增殖，临床实验已证明猪胰岛可有效、安全的治疗人类I型糖尿病。猪胰岛组织来源广泛，是人类i型糖尿病和部分n型糖尿病胰岛细胞移植的主要供体来源。胰岛移植成功的关键在于患者是否得到了相当数量的具有活性和功能的猪胰岛细胞。移植前体外培养是保存猪胰岛移植物的主要方法，该方法即可以降低猪胰岛的免疫原性，又能起到纯化胰岛、延长移植物保存时间的作用。虽然体外培养技术不断发展，但由于目前体外培养环境与体内环境仍然存在较大差异，因此猪胰岛细胞在体外很难存活、不易在体外培养，大大影响了胰岛移植的成功率。
发明内容本发明的目的是为了解决目前猪胰岛体外培养环境与体内环境存在差异，导致猪胰岛细胞在体外很难存活、不易在体外培养的问题，而提供的一种聚羟基乙酸-猪胰岛复合物的制备方法。聚羟基乙酸-猪胰岛复合物按以下步骤制备一、处理聚羟基乙酸支架，将聚羟基乙酸支架用浓度为10mg/mL的多聚赖氨酸溶液包埋30min，然后放入超净台内吹干，再浸泡入体积浓度为75%的乙醇溶液中30min，之后用PBS缓冲液冲洗34次，再放入超净台内吹干，并用紫外灯照射lh;二、三维微重力细胞培养，将聚羟基乙酸支架放入三维微重力组织细胞培养系统的组织培养容器中，加入lmL培养基，然后将猪胰岛细胞均匀地放在聚羟基乙酸支架上，再加入RPMI-1640培养液，之后将组织培养容器中的气泡排空、盖紧组织培养容器盖，放入体积分数为95%空气、5%C02、37。C的恒温培养箱中进行微重力培养，即得到聚羟基乙酸-猪胰岛复合物；其中步骤二中三维微重力组织细跑培养系统的旋转速度在匀加速的情况下，在24小时中由15r/min增至45r/min，并保持45r/min的转速继续培养35天；步骤二中加入的培养基按以下步骤制备先将10.4g的RPMI-1640培养基干粉溶于1L超纯水中，再加入浓度为1Ommol/L的Hepes23g，并用NaHC03溶液调pH值到7.4，滤过除菌后加入超纯水体积10%20%胎牛血清，再加入青霉素和链霉素使培养基中青霉素终浓度为100U/mL、链霉素终浓度为10(^g/mL。聚羟基乙酸(Polyglycolicacid,PGA)是结构最简单的线性脂肪族聚酯，具有可生物降解性和生物相容性，是一种可体内吸收的高分子材料。由于羟基乙酸是机体代谢的中间产物，在体内水解后最终形成二氧化碳和水，而不会在人体组织和器官内聚集(特别是不会在重要的人体组织和器官内聚集)。多孔的PGA细胞生物支架有助于猪胰岛细胞黏附生长，从而为猪胰岛细胞体外生存提供支持和附着的空间。本发明制备的聚羟基乙酸-猪胰岛复合物提高了猪胰岛细胞体外培养的质量及体外存活的时间，并可改善猪胰岛细胞的活性和分泌胰岛素的功能，增加了具有活性和功能的猪胰岛细胞的数量，从而达到了提高胰岛移植成功率的目的，并为以后的糖尿病治疗奠定了物质基础。图1是具体实施方式四中聚羟基乙酸支架的IOO倍扫描电镜图，图2是具体实施方式四中聚羟基乙酸支架的200倍扫描电镜图，图3是具体实施方式四中聚羟基乙酸支架的300倍扫描电镜图，图4是具体实施方式四中聚羟基乙酸支架的500倍扫描电镜图，图5是具体实施方式八制备的聚羟基乙酸-猪胰岛复合物的倒置显微镜观察图，图6是具体实施方式八中将聚羟基乙酸支架上的猪胰岛细胞洗脱下来进行AO-PI免疫荧光染色后的倒置荧光显微镜观察结果图。具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式聚羟基乙酸-猪胰岛复合物按以下步骤制备一、处理聚羟基乙酸支架，将聚羟基乙酸支架用浓度为10mg/mL的多聚赖氨酸溶液包埋30min，然后放入超净台内吹干，再浸泡入体积浓度为75%的乙醇溶液中30min，之后用PBS缓冲液冲洗34次，再放入超净台内吹干，并用紫外灯照射lh;二、三维微重力细胞培养，将聚羟基乙酸支架放入三维微重力组织细胞培养系统的组织培养容器中，加入lmL培养基，然后将猪胰岛细胞均匀地放在聚羟基乙酸支架上，再加入RPMI-1640培养液，之后将组织培养容器中的气泡排空、盖紧组织培养容器盖，放入体积分数为95%空气、5%C02、37"C的恒温培养箱中进行微重力培养，即得到聚羟基乙酸-猪胰岛复合物；其中步骤二中三维微重力组织细胞培养系统的旋转速度在匀加速的情况下，在24小时中由15r/min增至45r/min，并保持45r/min的转速继续培养35天；步骤二中加入的培养基按以下步骤制备先将10.4g的RPMI-1640培养基干粉溶于1L超纯水中，再加入浓度为10mmol/L的Hepes23g，并用NaHC03溶液调pH值到7.4，滤过除菌后加入超纯水体积10%20%胎牛血清，再加入青霉素和链霉素使培养基中青霉素终浓度为100U/mL、链霉素终浓度为100jig/mL。本实施方式步骤二中使用的三维微重力组织细胞培养系统购自于上海易扩仪器有限公司。本实施方式可选用产品名称为"高密度、高活性、高分化"的三维微重力组织细胞培养系统即RCCSTM细胞生物反应。本实施方式中使用的药品、试剂和培养基等均容易购得，若无注明则浓度为产品标注浓度。在计算本实施方式步骤二培养箱中各气氛体积时空气氛中所含有的co2忽略不计，即步骤二培养箱中C02的体积分数(5%)中不包括空气中原含有的C02。本实施方式步骤二微重力旋转培养过程中不得有空气进入三维微重力组织细胞培养容器内，否则会由于机械性的剪切力而损伤细胞。容器内的气体交换是依靠容器内的一个气体通透膜进行的。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤一多聚赖氨酸溶液中多聚赖氨酸的相对分子质量为1.5xl043xl04。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤一多聚赖氨酸溶液中多聚赖氨酸的相对分子质量为2xl042.5xl04。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤一中聚羟基乙酸支架的纤维直径为1317|mi，网孔直径为100150pm，孔隙率为96%98%。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式聚羟基乙酸支架的IOO倍扫描电镜图(SEM)如图1所示，聚羟基乙酸支架的200倍扫描电镜图(SEM)如图2所示，聚羟基乙酸支架的300倍扫描电镜图(SEM)如图3所示，聚羟基乙酸支架的500倍扫描电镜图(SEM)如图4所示。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤一中聚羟基乙酸支架的厚度为12mm，长度为46mm，宽度为46mm。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一的不同点是用质量浓度8.4%的NaHC03溶液调pH。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤二中所加入的培养基制备后放于4'C环境中储存。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式八本实施方式聚羟基乙酸-猪胰岛复合物按以下步骤制备-一、处理聚羟基乙酸支架，将聚羟基乙酸支架用浓度为10mg/mL、相对分子质量为1.5xl043xl04的多聚赖氨酸溶液包埋30min，然后放入超净台内吹干，再浸泡入体积浓度为75%的乙醇溶液中30min，之后用PBS缓冲液冲洗34次，再放入超净台内吹干，并用紫外灯照射lh，其中聚羟基乙酸支架的纤维直径为1416|am，网孔直径为110140pm，孔隙率为97%,厚度为1.21.8mm，长度为4.55.5mm，宽度为4.55.5mm;二、三维微重力细胞培养，将聚羟基乙酸支架放入三维微重力组织细胞培养系统的组织培养容器中，加入lmL培养基，然后将猪胰岛细胞均匀地放在聚羟基乙酸支架上，再加入RPMI-1640培养液，之后将组织培养容器中的气泡排空、盖紧组织培养容器盖，放入体积分数为95%空气、5%C02、37"C的恒温培养箱中进行进行微重力培养，即得到聚羟基乙酸-猪胰岛复合物；其中步骤二中三维微重力组织细胞培养系统的旋转速度在匀加速的情况下，在24小时中由15r/min增至45r/min，并保持45r/min的转速继续培养35天；步骤二中加入的培养基按以下步骤制备先将10.4g的RPMI-1640培养基干粉溶于1L超纯水中，再加入浓度为1Ommol/L的Hepes23g，并用质量浓度为8.4%的NaHC03溶液调pH值到7.4，滤过除菌后加入超纯水体积20%胎牛血清，再加入青霉素和链霉素使培养基中青霉素终浓度为100U/mL、链霉素终浓度为100pg/mL。活体新生猪的胰腺切取后装入有400mL低温Hanks液的胰腺容器内，胰腺容器外有两层无菌塑料袋，塑料袋与胰腺容器之间用盐水冰屑填充。猪胰腺的冷保存时间不宜超过50分钟，猪胰腺取出胰腺容器后应立即放入层流间进行胰腺细胞的分离与纯化。猪胰岛细胞分离与纯化①将猪胰腺置于超净工作台上，快速修剪胰腺周围的组织、脂肪、血管及外科被膜，保留固有被膜；②沿着十二指肠找到主胰管，用5G套管针插入，用缝合线将套管针固定；③向套管针内注入预冷的质量浓度为0.25n/。的胶原酶V消化液1020mL，使胰腺全部膨胀，胰腺呈淡粉色；④将膨胀的胰腺放入玻璃容器内，在38.5土0.5t:水浴中震荡消化，震速为100120r/min;⑤在消化过程中间歇性加入浓度为O.lmmol/L的NaOH溶液，使消化液pH值维持在7.8左右；⑥从消化20分钟后开始每间隔4分钟取样一次，用双硫腙(DTZ)染色镜检，镜检见大部分结构完整的胰岛从外分泌组织中脱落出来，立即用4t:、含20%(体积)胎牛血清的Hanks液进行终止消化；⑦充分混匀后用30目钢网过滤，收集消化后胰岛细胞；⑧速度沉降离心法进行胰岛纯化，分别取样镜检计数、估计纯度、进行生物学活性及组织学鉴定。本实施方式其它与实施方式一相同。将本实施方式PGA上的猪胰岛细胞经双硫腙(DTZ)染色，在倒置显微镜(invertedmicroscope)下观察(如图5所示)可见大量圆形、椭圆形或不规则形红色细胞团，触之易碎，包膜不明显，也有散在单个染色细胞；外分泌组织不着色，二者容易区分。本实施方式纯化后胰岛直径在5040(^m之间，在显微镜下计数直径》50pm的胰岛细胞，根据公式胰岛纯度=染色胰岛数量/细胞团总数(染色胰岛及未染色胰岛)xiooy。，计算出本实施方式胰岛细胞纯度>80%。共培养本实施方式制备的聚羟基乙酸-猪胰岛复合物，共培养条件如下将己经处理及消毒过的PGA细胞支架放入微重力容器中，加入lmL培养基，然后将猪胰岛细胞缓慢均匀地放在PGA支架上，再加入RPMI-1640培养液，将微重力容器中的气泡排空，盖紧容器盖，与微重力仪器(RCCS)连接，然后放入体积分数为95%空气、5%C02、37。C的恒温培养箱中进行培养，并将培养箱外面的操作旋扭打开，培养箱内的容器开始旋转，调整微重力仪器的旋转速度，旋转的速度由慢(15r/分钟)到快(45r/分钟)缓慢调节，最后速度达到45r/分钟，在旋转培养中不得有空气进入，否则会损伤细胞，经过微重力培养PGA-猪胰岛复合物形成。对聚羟基乙酸支架上的猪胰岛细胞进行吖啶橙-碘化丙锭(AO-PI)荧光双染检测胰岛细胞的活性和生存率，吖啶橙(AO)可使活细胞发出绿色荧光，碘化丙锭(PI)可是死细胞或正在死亡的细胞发出红色荧光，在倒置荧光显微镜下可以观察到，绿色荧光的活细胞和红色荧光的死细胞，可以鉴定PGA上猪胰岛细胞的活性及生存率。本实施方式将聚羟基乙酸支架上的猪胰岛细胞洗脱下来进行AO-PI免疫荧光染色并进行倒置荧光显微镜(invertedfluorescencemicroscope)观察，观察结果如图6所示。从图6中可以看出绿色荧光的活细胞(浅色)多，红色的死细胞较少，说明猪胰岛细胞在PGA支架上能粘附生长，活性好。应用公式胰岛生存率=(绿色荧光胰岛/红绿色荧光胰岛总数)X100%，可计算出猪胰岛生存率。本实施方式制备的聚羟基乙酸-猪胰岛复合物与无PGA支架猪胰岛细胞培养组相比，统计数据如表l所示。与无PGA支架猪胰岛细胞培养组相比本实施方式猪胰岛细胞生存率统计分析结果显示;<0.05，本实施方式中猪胰岛细胞生存率明显高于无支架组。表l猪胰岛细胞生存率比较(h幼)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*经w/汰s，丄amk^检验与静止培养比较p<0.05。共培养本实施方式制备的聚羟基乙酸-猪胰岛复合物，应用MTT(四唑盐比色试验)检测本实施方式PGA支架上猪胰岛细胞的成活性以判断猪胰岛细胞与PGA支架材料的生物相容性，与无PGA支架猪胰岛细胞培养组相比，统计数据如表3所示。与无PGA支架猪胰岛细胞培养组相比本实施方式的MTT检测结果显示;0.05，说明本实施方式猪胰岛细胞与PGA支架的生物相容性好。表3猪胰岛MTT检测结果比较(f土幼)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*经w/汰s，丄amkfa检验与静止培养比较/<0.05。以上检测结果证明，PGA-猪胰岛复合物可明显提高猪胰岛培养的质量并延长体外存活的时间，还可改善猪胰岛的活性和分泌胰岛素的功能，并可获得一定数量的具有活性和功能的猪胰岛细胞。说明本实施方式PGA-猪胰岛复合物是一种理想的治疗糖尿病的移植物。权利要求1、聚羟基乙酸-猪胰岛复合物的制备方法，其特征在于聚羟基乙酸-猪胰岛复合物按以下步骤制备一、处理聚羟基乙酸支架，将聚羟基乙酸支架用浓度为10mg/mL的多聚赖氨酸溶液包埋30min，然后放入超净台内吹干，再浸泡入体积浓度为75％的乙醇溶液中30min，之后用PBS缓冲液冲洗3～4次，再放入超净台内吹干，并用紫外灯照射1h；二、三维微重力细胞培养，将聚羟基乙酸支架放入三维微重力组织细胞培养系统的组织培养容器中，加入1mL培养基，然后将猪胰岛细胞均匀地放在聚羟基乙酸支架上，再加入RPMI-1640培养液，之后将组织培养容器中的气泡排空、盖紧组织培养容器盖，放入体积分数为95％空气、5％CO2、37℃的恒温培养箱中进行微重力培养，即得到聚羟基乙酸-猪胰岛复合物；其中步骤二中三维微重力组织细胞培养系统的旋转速度在匀加速的情况下，在24小时中由15r/min增至45r/min，并保持45r/min的转速继续培养3～5天；步骤二中加入的培养基按以下步骤制备先将10.4g的RPMI-1640培养基干粉溶于1L超纯水中，再加入浓度为10mmol/L的Hepes2～3g，并用NaHCO3溶液调pH值到7.4，滤过除菌后加入超纯水体积10％～20％胎牛血清，再加入青霉素和链霉素使培养基中青霉素终浓度为100U/mL、链霉素终浓度为100μg/mL。2、根据权利要求1所述的聚羟基乙酸-猪胰岛复合物的制备方法，其特征在于步骤一多聚赖氨酸溶液中多聚赖氨酸的相对分子质量为1.5xl043xl04。3、根据权利要求l或2所述的聚羟基乙酸-猪胰岛复合物的制备方法，其特征在于步骤一中聚羟基乙酸支架的纤维直径为1317)im，网孔直径为100150pm，孔隙率为96%98%，厚度为12mm，长度为46mm，宽度为46mm。4、根据权利要求3所述的聚羟基乙酸-猪胰岛复合物的制备方法，其特征在于步骤二中用质量浓度8.4%的NaHC03溶液调pH。5、根据权利要求l、2或4所述的聚羟基乙酸-猪胰岛复合物的制备方法，其特征在于步骤二中所加入的培养基制备后放于4"C环境中储存。全文摘要聚羟基乙酸-猪胰岛复合物的制备方法，它涉及一种猪胰岛移植复合物的制备方法。它解决了目前猪胰岛体外培养环境与体内环境存在差异，导致猪胰岛细胞在体外很难存活、不易在体外培养的问题。制备方法一、处理聚羟基乙酸支架，二、三维微重力细胞培养。本发明制备的聚羟基乙酸-猪胰岛复合物提高了猪胰岛细胞体外培养的质量及体外存活的时间，并可改善猪胰岛细胞的活性和分泌胰岛素的功能，增加了具有活性和功能的猪胰岛细胞的数量，从而达到了提高胰岛移植成功率的目的，并为以后的糖尿病治疗奠定了物质基础。文档编号C12N5/06GK101434934SQ20081020980公开日2009年5月20日申请日期2008年12月26日优先权日2008年12月26日发明者姜再兴,纯宋,谷红波,黄玉东申请人:哈尔滨工业大学