专利名称：分离筛选絮凝破乳双功能菌株的方法及其所使用的培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分离筛选菌株的方法及其所使用的培养基。
背景技术：
利用现有工程菌株处理含油污水或含油污泥时，通常需要具有破乳功能的 工程菌株和具有絮凝功能的工程菌株分两阶段完成进行处理，因此存在工艺时 间长、能耗高、费用大、设备多等问题。如果将两类工程菌株放在同一环境中 处理含油污水或含油污泥，虽然可以解决上述问题；但是由于两类工程菌株的 生存条件势必存在差异，因此将两类工程菌株放在同一环境中必然无法同时满 足两类工程菌株的生存需要，导致工程菌株功能的降低，影响破乳或絮凝的效 果，影响含油污水或含油污泥的处理效果。
发明内容
本发明目的是为了解决现有处理含油污水或含油污泥方法中需要工程菌 株分破乳和絮凝两阶段处理，工艺时间长、能耗高、费用大、设备多的问题及 两类工程菌株无法在同一环境中同时高效地处理含油污水或含油污泥的问题， 而提供的一种分离筛选絮凝破乳双功能菌株的方法及其所使用的培养基。通过 本发明的方法和培养基可以分离筛选出具备絮凝及破乳双功能的工程菌株解 决现有技术存在的上述问题。
分离筛选絮凝破乳双功能菌株的方法按以下步骤实现 一、将采集样品在 好氧条件下进行倍比稀释，得到不同浓度的倍比稀释液；二、将固体培养基在 沸水浴中融化，然后冷却至温度为45 55°C，随即将不同浓度的倍比稀释液 分别涂布在固体培养基表面，而后在温度为30 32'C的条件下恒温培养至管 中有菌落出现；三、挑取单菌落放在液体培养基上，然后在30 32。C的条件 下恒温培养2 3天；四、分离纯化至有纯菌株出现，即可分离筛选出絮凝破. 乳双功能菌株；其中步骤二中固体培养基由3.0g的牛肉膏、10.0g的蛋白胨、 l.Og的酵母膏、5.0g的氯化钠、20.0g的琼脂粉、50mL的绵羊鲜血和1000mL 的蒸馏水制成；步骤三中液体培养基由3.0 4.0g的NH4N03、 3.0 4.0g的K2HP04、 4.0 6.0g的KH2P04、 0.1 0.2g的MgS04.H20、 0.5 lmL的微量 元素溶液、40mL的液体石蜡、0.5 1.0g的酵母膏、8.0 10.0g的葡萄糖溶于 lOOOmL的蒸馏水组成。
分离筛选絮凝破乳双功能菌株使用的培养基分为固体培养基和液体培养 基；其中固体培养基由3.0g的牛肉膏、10.0g的蛋白胨、l.Og的酵母膏、5.0g 的氯化钠、20.0g的琼脂粉、50mL的绵羊鲜血和lOOOmL的蒸馏水制成；液伴 培养基由3.0 4.0g的NH4N03、 3.0 4.0g的K2HP04、 4.0 6.0g的KH2P04、 0.1 0.2g的MgSO4'H2O、0.5 lmL的微量元素溶液、40mL的液体石蜡、0.5 l.Og的酵母膏、8.0 10.0g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸馏水组成。
本发明在含有油污的水和含有油污的土壤中分离筛选絮凝破乳双功能菌 株能同时产生破乳活性成分和絮凝活性成分，具有破乳率高和絮凝率高的特 点，筛选用培养基的针对性强。本发明的方法具有工艺时间短、节约能源、费 用小、设备简单的优点。
图1为具体实施方式
十二分离筛选出絮凝破乳双功能菌株的电镜扫描图， 图2为具体实施方式
十二分离筛选出絮凝破乳双功能菌株的破乳率随破乳时 间变化曲线图，图3为具体实施方式
十二分离筛选出絮凝破乳双功能菌株对高 岭土悬浊液絮凝率曲线图。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式分离筛选絮凝破乳双功能菌株的方法按以下 步骤实现 一、将采集样品在好氧条件下进行倍比稀释，得到不同浓度的倍比 稀释液；二、将固体培养基在沸水浴中融化，然后冷却至温度为45 55°C， 随即将不同浓度的倍比稀释液分别涂布在固体培养基表面，而后在温度为 30 32。C的条件下恒温培养至管中有菌落出现；三、挑取单菌落放在液体培养 基上，然后在30 32"的条件下恒温培养2 3天；四、分离纯化至有纯菌株 出现，即可分离筛选出絮凝破乳双功能菌株；其中步骤二中固体培养基由3.0g 的牛肉膏、10.0g的蛋白胨、l.Og的酵母膏、5.0g的氯化钠、20.0g的琼脂粉、50mL的绵羊鲜血和lOOOmL的蒸馏水制成；步骤三中液体培养基由3.0 4.0g 的NH4N03、 3.0 4.0g的K2HP04、 4.0 6.0g的KH2P04、 0.1 0.2g的 MgS04'H20、 0.5 lmL的微量元素溶液、40mL的液体石蜡、0.5 1.0g的酵 母膏、8.0 10.0g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸馏水组成。
本实施方式步骤二中固体培养基与步骤三中液体培养基均处于好氧状态。 本实施方式步骤二中固体培养基(除绵羊鲜血外其它成分)采用蒸煮方法 配制，配制参数灭菌温度为12rC，灭菌时间为20min;绵羊鲜血在灭菌后 加入。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中采集样 品为含有油污的水或含有油污的土壤。其它步骤及参数与具体实施方式
一相 同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中冷却至 温度为48 52。C。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中冷却至
温度为49 51。C。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中冷却至
温度为50。C。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中在温度
为3rc的条件下恒温培养至管中有菌落出现。其它步骤及参数与具体实施方 式一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中液体培
养基由3.2 3.8g的NH4N03、 3.2 3.8g的K2HP04、 4.2 5.8g的KH2P04、 0.12 0.18g的MgSCVH20、 0.6 0.9mL的微量元素溶液、40mL的液体石蜡、 0.6 0.9g的酵母膏、8.4 9.6g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸馏水组成。其它步 骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中液体培 养基由3.4 3.6g的NH4N03、 3.4 3.6g的K2HP04、 4.6 5.2g的KH2P04、 0.14 0.16g的MgSCVH20、 0.7 0.9mL的微量元素溶液、40mL的液体石蜡、 0.7 0.9g的酵母膏、8.8 9.4g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中液体培
养基由3.5g的NH4N03、 3.5g的K2HP04、 5.0g的KH2P04、 0.15g的 MgSCVH20、 0.8mL的微量元素溶液、40mL的液体石蜡、0.8g的酵母膏、9.0g 的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式
一相 同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中微量元 素溶液由lOOOmg WCaCl2.H20、 1000 mg的FeS04'7H20、 1400mgEDTA溶 于lOOOmL的蒸馏水制成。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中在 3rc的条件下恒温培养2天。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十二本实施方式分离筛选絮凝破乳双功能菌株的方法按以
下步骤实现 一、将含有油污的土壤在好氧条件下进行倍比稀释，得到不同浓
度的倍比稀释液；二、将固体培养基在沸水浴中融化，然后冷却至温度为48°C， 随即将不同浓度的倍比稀释液分别涂布在固体培养基表面，而后在温度为
3rc的条件下恒温培养至管中有菌落出现;三、挑取单菌落放在液体培养基上，
然后在3rc的条件下恒温培养3天；四、分离纯化至有纯菌株出现，即可分
离筛选出絮凝破乳双功能菌株；其中步骤二中固体培养基由3.0g的牛肉膏、 10.0 g的蛋白胨、l.Og的酵母膏、5.0g的氯化钠、20.0g的琼脂粉、50mL的 绵羊鲜血和1000mL的蒸馏水制成；步骤三中液体培养基由3.5g的NH4N03、 3.5g的K2HP04、 4.5g的KH2P04、 0. 2g的MgS04'H20、 0.75mL的微量元素 溶液、40mL的液体石蜡、0.8g的酵母膏、9.0g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸馏 水组成。
本实施方式分离筛选出絮凝破乳双功能菌株(用XH-1表示)通过电镜扫 描(图1)表述菌体形态。从图1中可以清楚看出菌株XH-1长短多变、有荚 膜、无鞭毛、表面光滑、圆整突起、边缘规则、有芽孢并兰氏染色呈阳性，此 菌株的形态特征与莫海威芽孢杆菌(B。"7/"smq/"ve"w、)相同；经测试此菌 株适宜在温度为20 30°C、 pH为6.0 8.0的条件下生长且好氧，在培养基上 生长时呈淡黄色，易挑取。本实施方式分离筛选出絮凝破乳双功能菌株XH-1和相近菌株16S rDNA 序列构建的NJ系统发育树，经测定XH-1菌为革兰氏阳性杆菌、菌株长短多 变、需氧、产生芽孢、XH-1菌株16SrDNA序列与S"c/〃m m07'avera/s (DQ993678)相似性为99%，可确定此菌株为芽孢杆菌属莫海烕芽孢杆菌
挑取一环本实施方式得到纯菌株转接于250mL装有100mL已灭菌的液体 培养基(本实施方式所使用)的三角瓶中，制得细胞全培养液，然后向5mL 模拟0/W型乳状液的比色管中加入2mL细胞全培养液，振荡摇匀，静置，开 始计时。经测得，该纯菌株15小时以内破乳率在85%以上，24小时以内可达 100%。测试结果如图2所示，从图2可以看出本实施方式分离出的纯菌株破 乳率随时间的变化近似为一级反应，开始时破乳速度较快，随时间的延长，乳 化液体积的减少，破乳速率变慢；而随着破乳过程的进行乳状液含油量下降， 菌液浓度也下降，当乳化液中油量降到一定程度后，小油滴聚集速度下降，导 致破乳速度减慢。
挑取本实施方式得到纯菌株转接装有250mL装有lOOmL种子培养基的三 角瓶中，在温度为3(TC、摇床转速为150 r/min的条件下培养24摇瓶培养方 法在500 mL三角瓶中装入250 mL发酵培养基，灭菌后按10%的接种量将 种子培养基中接入发酵培养基中，制备生物絮凝剂。向1000mL待测水样(采 用自来水按照5g/L的比例加入高岭土——250目，山东济宁泰丰研究所出品 的悬浊液)中依次投加生物絮凝剂和助凝剂CaCl2。以相同条联混凝搅拌仪搅 拌后静置20min，对沉后水浊度与絮凝率的测定，进行5次重复对比试验，使 用浊度仪测定上清液的浊度，经测得，该菌株的絮凝率均在90%以上，最高可 达99.4%测试结果如图3所示。
具体实施方式
十三本实施方式分离筛选絮凝破乳双功能菌株所使用的培 养基分为固体培养基和液体培养基；其中固体培养基由3.0g的牛肉膏、lO.Og 的蛋白胨、l.Og的酵母膏、5.0g的氯化钠、20.0g的琼脂粉、50mL的绵羊鲜 血和1000mL的蒸馏水制成；液体培养基由3.0 4.0g的NH4NO3、3.0 4.0g的 K2HP04、 4.0 6.0g的KH2P04、 0.1 0.2g的MgS04.H20、 0.5 lmL的微量 元素溶液、40mL的液体石蜡、0.5 1.0g的酵母膏、8.0 10.0g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸馏水组成。
本实施方式中固体培养基(除绵羊鲜血外其它成分)采用蒸煮方法配制， 配制参数灭菌温度为12rC，灭菌时间为20min;绵羊鲜血在灭菌后加入。
具体实施方式
十四本实施方式与具体实施方式
十三不同的是液体培养基
由3.2 3.8g的NH4N03、 3.2 3.8g的K2HP04、 4.2 5.8g的KH2P04、 0.12 0.18g的MgS(VH20、 0.6 0.9mL的微量元素溶液、40mL的液体石蜡、0.6 0.9g的酵母膏、S.4 9.6g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸馏水组成。其它步骤及 参数与具体实施方式
十三相同。
具体实施方式
十五本实施方式与具体实施方式
十三不同的是液体培养基 由3.5g的NH4N03、 3.5g&K2HP04、 4.8g的KH2P04、 0.16g的MgS04'H20、 0.8mL的微量元素溶液、40mL的液体石蜡、0.7g的酵母膏、9.0g的葡萄糖溶 于lOOOmL的蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式
十三相同。
具体实施方式
十六本实施方式与具体实施方式
十三不同的是微量元素溶 液由lOOOmg的CaCl2'H20、 1000 mg的FeS04.7H20、 1400 mg EDTA溶于 lOOOmL的蒸馏水制成。其它步骤及参数与具体实施方式
十三相同。
权利要求
1、分离筛选絮凝破乳双功能菌株的方法，其特征在于分离筛选絮凝破乳双功能菌株的方法按以下步骤实现一、将采集样品在好氧条件下进行倍比稀释，得到不同浓度的倍比稀释液；二、将固体培养基在沸水浴中融化，然后冷却至温度为45～55℃，随即将不同浓度的倍比稀释液分别涂布在固体培养基表面，而后在温度为30～32℃的条件下恒温培养至管中有菌落出现；三、挑取单菌落放在液体培养基上，然后在30～32℃的条件下恒温培养2～3天；四、分离纯化至有纯菌株出现，即可分离筛选出絮凝破乳双功能菌株；其中步骤二中固体培养基由3.0g的牛肉膏、10.0g的蛋白胨、1.0g的酵母膏、5.0g的氯化钠、20.0g的琼脂粉、50mL的绵羊鲜血和1000mL的蒸馏水制成；步骤三中液体培养基由3.0～4.0g的NH4NO3、3.0～4.0g的K2HPO4、4.0～6.0g的KH2PO4、0.1～0.2g的MgSO4·H2O、0.5～1mL的微量元素溶液、40mL的液体石蜡、0.5～1.0g的酵母膏、8.0～10.0g的葡萄糖溶于1000mL的蒸馏水组成。
2、 根据权利要求1所述的分离筛选絮凝破乳双功能菌株的方法，其特征 在于步骤二中冷却至温度为48 52°C。
3、 根据权利要求1或2所述的分离筛选絮凝破乳双功能菌株的方法，其特征在于步骤二中在温度为3rc的条件下恒温培养至管中有菌落出现。
4、 根据权利要求3所述的分离筛选絮凝破乳双功能菌株的方法，其特征 在于步骤三中液体培养基由3.2 3.8g的NH4N03、3.2 3.8g的K2HP04、 2 8g的KH2P04、 0.12 0.18g的MgS04vH20、 0.6 0.9mL的微量元素溶液、 40mL的液体石蜡、0.6 0.9g的酵母膏、8.4 9.6g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸 馏水组成。
5、 根据权利要求l、 2或4所述的分离筛选絮凝破乳双功能菌株的方法， 其特征在于步骤三中微量元素溶液由lOOOmg的CaCl2'H20、 1000 mg的 FeS04 7H20、 1400 mg EDTA溶于lOOOmL的蒸馏水制成。
6、 分离筛选絮凝破乳双功能菌株所使用的培养基，其特征在于分离筛选 絮凝破乳双功能菌株所使用的培养基分为固体培养基和液体培养基；其中固体 培养基由3.0g的牛肉膏、10.0g的蛋白胨、l.Og的酵母膏、5.0g的氯化钠、 20.0g的琼脂粉、50mL的绵羊鲜血和lOOOmL的蒸馏水制成；液体培养基由(3.0 4.0g的NH4N03、 3.0 4.0g的K2HP04、 4.0 6.0g的KH2P04、 0.1 0.2g 的MgSCVH20、 0.5 lmL的微量元素溶液、40mL的液体石蜡、0.5 (1.0g的 酵母膏、8.0 10.0g的葡萄糖溶于lOOOmL的蒸馏水组成。
7、 根据权利要求6所述的分离筛选絮凝破乳双功能菌株所使用的培养基， 其特征在于液体培养基由3.2 3.8g的NH4N03、 3.2 3.8g的K2HP04、 (4.2 5.8g的KH2P04、 0.12 0.18g的MgS04'H20、 0.6 0.9mL的微量元素溶液、 40mL的液体石蜡、0.6 0.9g的酵母膏、8.4 9.6g的葡萄糖溶于(lOOOmL的蒸 馏水组成。
8、 根据权利要求6或7所述的分离筛选絮凝破乳双功能菌株所使用的培 养基，其特征在于微量元素溶液由lOOOmg的CaCl2'H20、 1000 mg的 FeS04-(7H20、 1400 mg EDTA溶于lOOOmL的蒸馏水制成。
全文摘要
分离筛选絮凝破乳双功能菌株的方法及其所使用的培养基，它涉及一种分离筛选菌株的方法及其所使用的培养基。它解决现有处理含油污水或含油污泥方法中需要工程菌株分破乳和絮凝两阶段处理，工艺时间长、能耗高、费用大、设备多的问题及两类工程菌株无法在同一环境中同时高效地处理含油污水或含油污泥的问题。分离方法一、制备不同浓度的倍比稀释液；二、使管中有菌落出现；三、挑取单菌落恒温培养；四、分离纯化至有纯菌株出现，即可分离。本发明分离筛选絮凝破乳双功能菌株能同时产生破乳活性成分和絮凝活性成分，具有破乳率高和絮凝率高的特点。筛选用培养基的针对性强。本发明的方法具有工艺时间短、节约能源、费用小、设备简单的优点。
文档编号C12R1/07GK101434925SQ20081020975
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月22日 优先权日2008年12月22日
发明者宁 侯, 旸 徐, 絮 李, 李大鹏, 放 马, 利 魏 申请人:哈尔滨工业大学