专利名称：一种甘精胰岛素及其类似物的制备方法
技术领域：
本发明涉及了一种甘精胰岛素及其类似物的制备方法，具体地讲，本发明涉及一种利用基因工程制备重组的甘精胰岛素及其类似物的前体、并将前体该转化成为甘精胰岛素及其类似物的方法，此类类似物的主要结构特征在于C末端含多个碱性氨基酸。
背景技术：
甘精胰岛素是将人胰岛素A链上天然排列在第21位的天门冬酰胺(Asn)置换为甘氨酸(Gly);在B链第30位的苏氨酸(Thr)上添加2个精氨酸(Arg)而合成的人胰岛素类似物。精氨酸的加入使这种胰岛素分子表面增加了正电荷，等电点从5. 4上升到6. 7，使甘精胰岛素在弱酸环境中呈无色透明溶液状，而在接近中性的生理条件下溶解度降低，溶液出现沉淀而呈浑浊状。甘精胰岛素经皮下注射后，分子会立即聚合，并在皮下形成甘精胰 岛素的沉淀物，延缓溶解和吸收的时间，起到长效的作用。而将人胰岛素A21位上的天门冬酰胺置换成甘氨酸，增加了甘精胰岛素在弱酸环境中的稳定性，提高了制剂的稳定性。现有的研究表明，甘精胰岛素每日只需皮下注射一次，作用可以持续24小时，且无明显峰值，可以较好的模拟正常基础胰岛素的分泌。甘精胰岛素在疗效相近的基础上比中性精蛋白锌(NPH)胰岛素有更低的低血糖发生率。甘精胰岛素的制备方法与胰岛素类似，可采用基因工程技术先制备前体，再经过转肽制备成品。其中，前体的制备方法仅需在胰岛素原的基础上将表达的氨基酸序列进行相应的改动，可以使用同样的表达载体及宿主菌，比较经典的工艺为Eli Lilly的工艺US4，430，266、Novo 的工艺 US 4，916，212、Sanof i (Hoechst)的工艺 US 5，663，291 ;而转肽的方法则由于末端两个精氨酸的引入而与胰岛素的工艺不同，在Sanofi-Aventis的专利申请(US 2009/0192073 Al)中，采用先制备Arg(B31)Arg(B32)Gly(A21)胰岛素前体，用胰酶转肽后得Arg(B31)Arg(B32)Gly (A21)胰岛素及Arg(B31)Gly (A21)胰岛素两种结构，分离后前者为甘精胰岛素，后者在酸性条件下胰酶的作用下加入带保护基团的Arg，最后脱保护得甘精胰岛素及其类似物。这种方法的缺点在于前体转肽后形成的两种结构理论得率为各50%，且结构较为一致，分离得率低。引入保护基团的Arg的反应条件均为偏酸性12°C左右(需制冷)，得率偏低，在其实施例中加保护基团的Arg的得率报道为> 60%。而且，US2009/0192073使用含保护基团的碱性氨基酸，成本过高。
发明内容
本发明的目的提供一种甘精胰岛素及其类似物的制备方法。在本发明的制备方法中避免使用含保护基团的碱性氨基酸，从而降低了成本；而且，该方法同时避免了制备过程中形成两种不同结构的Arg(B31)Arg(B32)Gly (A21)胰岛素和Arg (B31) Gly (A21)胰岛素，从而简化了分离步骤，提高了产物收率。一方面，为实现本发明的发明目的，本发明提供了一种甘精胰岛素及其类似物的制备方法，该方法包括如下步骤
(I)利用基因工程方法制备B链C端含多个碱性氨基酸的甘精胰岛素及其类似物的前体；(2)利用氨基酸侧链保护剂使胰酶特异性识别精氨酸或赖氨酸，在保护剂、胰酶的作用下获得带保护基团的甘精胰岛素及其类似物；或者不保护直接使用特异作用于Arg的梭菌蛋白酶或特异作用于Lys的胞内蛋白酶Lys C ；(3)任选地通过加入羧肽酶而脱除C末端未保护的碱性氨基酸；(4)脱保护得到甘精胰岛素及其类似物。 上述的制备方法中，甘精胰岛素及其类似物优选为通式I所表示的、具有A链和B链的物质A 链=Gly-AS-ASO-R1B 链Phe-B2-B29- (R2) m_ (R3) η(通式I)其中，在上述通式I的Α、Β链间及链内二硫键的位置同人胰岛素或动物源胰岛素；Α2-Α20.Β2-Β29表示与人胰岛素或动物源胰岛素相同的氨基酸残基，Α2-Α20对应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素类似物的A链序列，Β2-Β29对应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素类似物的B链序列；R1是Asn、Ser和Gly残基中的一个；R2和R3分别是Arg残基、Lys残基中的一种,其中，如果R2是Arg残基,则R3是Lys残基；如果R2是Lys残基，则R3是Arg残基；m是1-4之间的整数；η是O或I。在上述制备方法的步骤(2)中，氨基酸侧链保护剂是指精氨酸或赖氨酸的保护齐U，这类保护剂能可逆地与精氨酸或赖氨酸残基反应。例如，对链内的Lys进行保护时，可使用酸酐类保护剂如琥珀酸酐、柠康酐等(此处可以多列举其它的保护剂)。在上述制备方法的步骤(3)中，脱保护包括调节pH、通过透析或柱上脱保护。另一方面，为实现本发明的发明目的，本发明还提供了一种如通式I所表示的甘精胰岛素及其类似物。再一方面，为实现本发明的发明目的，本发明还提供了一种甘精胰岛素及其类似物的前体，其中，该前体含有通式I的A链及B链的一段氨基酸序列，而且，B链与A链之间有连接肽，该前体序列中η = I。优选地，上述前体中的连接肽是包括C肽、小C肽在内的各种连接肽，该连接肽的特点在于C末端为通式I中的R3。优选地，B链N端可融合有未切掉的信号肽序列、有助于复性的分子伴侣序列或其它连接肽序列，该连接肽的特点在于C末端为通式I中的R3。根据本发明，在前体结构上稍作改动就能应用于C末端2个以上碱性氨基酸的甘精胰岛素及其类似物的生产中，应用范围广。胰酶酶切识别为点为碱性氨基酸的C末端，因而在使用胰酶直接酶转时，只能直接获得C端带一个碱性氨基酸的肽链，本发明的技术特点在于对碱性氨基酸Lys和Arg其中的一种进行保护修饰，使胰酶只作用于没有保护的另外一种碱性氨基酸，从而可得到如通式I中表示的C端带多个碱性氨基酸的肽链。本发明提供的制备甘精胰岛素及其类似物的方法更为简便，得率高，而且应用范围更广，适用于两个以上的碱性氨基酸的引入。US2009/0192073 Al中所报道的两个碱性氨基酸的得率为>60%，按该申请的技术路线，可以推算如果要引入三个碱性氨基酸，可以保证的得率仅为> 36%。下面结合附图和具体实施方式
，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的常规条件。除非另外说明，否则所有百分比和分数按重量计。
图I显示了由甘精胰岛素前体获得成熟的甘精胰岛素的转肽过程；图2为发酵后全菌蛋白SDS-PAGE图，图中泳道I为重组大肠杆菌全菌蛋白，图中箭头所示的目标蛋白条带为所表达的甘精胰岛素前体的融合蛋白，其分子量约17. 8KD ；图3为发酵后取发酵液进行Tricine SDS-PAGE分析的结果，图中泳道1、2、3为不同时间发酵时间的重组酵母上清，依次为诱导72h、60h和48h的结果，图中箭头所示为分泌 表达的甘精胰岛素前体；图4为大肠杆菌表达前体蛋白粗纯品的SDS-PAGE图，图中泳道1、2为大肠杆菌表达前体蛋白粗纯品；图5为酵母表达前体蛋白粗纯品的SDS-PAGE图，图中泳道I为酵母表达的前体蛋白的粗纯品；图6为酵母表达前体粗纯后的HPLC分析图，其分析条件为A 0. 1% TFA B 0. 1% TFA 80% 乙腈C 8 柱 15cm I. Oml/min 30% 45% B 梯度洗脱；图7为纯化后的甘精胰岛素的HPLC分析图，其分析条件为A 0. 1% TFA B 0. 1% TFA 80% 乙腈C8 柱 15cm I. Oml/min 30% 45% B 梯度洗脱；图8为产物的质谱分析图。
具体实施方案I、重组制备甘精胰岛素前体利用基因工程技术大肠杆菌或酵母表达氨基酸序列为含B-Arg(B31)Arg(B32)Lys-A Gly (A21)的甘精胰岛素前体序列，其中如为融合表达，载体蛋白的C端与目标序列的连接以Lys结尾，如AB链间引入完整的C肽或其它连接肽的C端也以Lys结尾，即所表达的蛋白的通式为x-B-Arg(B31)Arg(B32)Lys-y-A Gly(A21)(见附图I中结构I)，其中如存在X，y则为C末端为Lys的序列(X指的是目标序列N端融合的序列，包含载体蛋白序列，有助于蛋白折叠的分子伴侣及其它连接序列；y指的是类C肽及其它连接序列)。2、折叠正确的前体如为大肠杆菌表达产物，通过包含体复性得到折叠正确的产物，V8蛋白酶切鉴定，如酵母表达产物则V8蛋白酶切鉴定二硫键后直接使用。3、链内Arg的保护对折叠正确的前体内的Arg进行修饰保护，可使胰酶及羧肽酶不识别带保护基团的Arg，可用的修饰剂有2，3 丁二酮、苯甲酰甲醛、环己二酮、己二醛、甲基己二醛、茚三酮等。
4、转肽(由甘精胰岛素前体获得成熟的甘精胰岛素)使用胰酶酶解肽键内的Lys的羧基端，对Arg保护后的甘精胰岛素前体进行转肽，得到带保护基团的甘精胰岛素及其类似物A链Gly(A21)，B链B_pArg(B31)pArg(B32)Lys0其中pArg表示带保护基团的Arg,AB链间由二硫键相连,结构如附图I中结构3。此步也可以直接使用特异作用于Lys的胞内蛋白酶Lys C。接着在羧肽酶的作用下，去除C端多余的Lys，得到带保护基团的甘精胰岛素A链Gly(A21)，B链B_pArg (B31) pArg (B32)，AB链间由二硫键相连，结构如附图I中结构4。最后通过透析柱层析降低修饰剂浓度、调节PH等方法除去保护基团后得到甘精胰岛素A链Gly(A21)，B链B_Arg(B31)Arg(B32)，AB链间由二硫键相连，结构如附图I中结构5，转肽过程如附图I所示，其中B22位的Arg由于位阻关系，该位点的保护效率不影响最终结果，因而附图中未标注是否带保护基团。5、其它结构同理，如需制备C末端含两个或两个以上Arg的甘精胰岛素及其类似物，仅需在基因工程制备前体时，表达结构蛋白的通式为X-B-(Arg)nLys-y-A Gly (A21)，其中如存在x，y则为C末端为Lys的序列。按照2-4描述的方法进行操作即能得到通式为A链Gly (A21)，B链=B-(Arg) η胰岛素类似物或者按2_4描述的方法，省去羧肽酶B酶解的步骤，就能获得A链Gly(A21)，B链B-(Arg) nLys胰岛素类似物。如需制备C末端含多个Lys的甘精胰岛素及其类似物，仅需在基因工程制备前体时，表达结构蛋白的通式为x-Β-(Lys)nArg-y-AGly (A21),其中如存在x,y则为C末端为Arg的序列。制备折叠正确的前体后，对链内的Lys进行保护，可使用酸酐类保护剂如琥珀酸酐、柠康酐等，或不保护直接使用特异作用于Arg的梭菌蛋白酶。同样的操作方法即可获得通式为A链Gly (A21)，B链B-(Lys)n胰岛素类似物或者省去羧肽酶的步骤获得A链Gly(A21)，B链B-(Lys)n Arg胰岛素类似物。如需制备A，B链内有突变的胰岛素类似物，仅需改变前体表达时的氨基酸序列。此A、B链内有突变的胰岛素类似物，优选的突变位点为A21位，其优选的氨基酸序列为Gly、Asn、Ser0优选实施例实施例I :利用大肠杆菌表达系统构建基因工程菌选择大肠杆菌偏爱密码子，利用融合PCR技术获得表达甘精胰岛素前体的基因片段，使其翻译出的氨基酸序列为F VNQHL CG SHLVEALYLVCGERGFF YT PKTRRKEAEDLQVGQVE LGGGPGAGSLQPLALEGSLQRKGIVEQCCTS I CSLYQL EN YC G，为提高表达量以及复性效率，在N端融合一段蛋白以连接肽GSK连接，本实施例选用的融合序列为葡萄球菌蛋白A(SPA)上的一段，M ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQ SLK DD PSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNK。引入NdeI EcoR I酶切位点后连接入表达载体PET 17b中，经常规基因工程作后获得表达甘精胰岛素前体的基因工程菌，发酵后全菌蛋白SDS-PAGE见附图2，附图2中的目标蛋白条带为所表达的甘精胰岛素前体的融合蛋白，成功获得了甘精胰岛素前体的融合蛋白，目标蛋白条带占菌体总蛋白的25%以上。实施例2 :利用毕赤酵母表达系统构建基因工程菌选择毕赤酵母偏爱密码子，利用融合PCR技术获得表达甘精胰岛素前体的基因片段，使其翻译出的氨基酸序列为F V N Q H L CG SHLVEALYLVCGER G F F YTPKTRRKGIVEQCCTSICSLYQLENY C G,为提高信号肽的切割效率并保证N端的完整性，在N端加入连接片段K REEAEAEAEPK ，引入Xho I EcoR I酶切位点后连接入载体pPIC 9中，再以Sal I/Sac I克隆入表达载体PPIC 9k中，经常规基因工程作后获得表达甘精胰岛素前体的基因工程菌，发酵后取发酵液进行Tricine SDS-PAGE分析，结果见附图3，附图3中的目标蛋白条带为分泌表达的甘精胰岛素前体，成功分泌表达了甘精胰岛素前体。实施例3 :表达产物的粗纯实施例I中大肠杆菌表达产物，用50mM PB+2mM EDTA, pH7. 5破菌；用50mMTris-HCl+2mM EDTA+0. 5%Triton X-100,pH8. 0 ；50mMTris-HCl+2mM EDTA+IM Urea,pH8. 0依次洗包；用50通 Tris-HCl+2mM EDTA+8M Urea，pH9.0变性；50mM Tris_HCl+2mM EDTA+8MUrea+0. 3M Na2S03, pH9. 0 磺化；50mM Gly+2mM EDTA+IM Urea+lmM β -Me, pH9. 5 复性后，上Q柱，pH8. O盐浓度梯度洗脱后得到粗纯的前体蛋白，SDS-PAGE分析，结果见附图4，结果表明，经复性粗纯后能获得纯度较高的前体蛋白，分子量约17. 8KD，主要的杂质为复性过程 中形成的二聚体。实施例2中酵母表达产物稀释后调pH至4. 0，上CM柱pH及盐梯度洗脱，得粗纯的前体蛋白，Tricine SDS-PAGE分析结果如附图5所示粗纯后条带单一，HPLC分析如附图6所示，纯度在96%以上。实施例4 :利用环己二酮保护的甘精胰岛素转肽取含折叠正确的B-Arg(B3l)Arg(B32)K-A Gly (A21)的粗蛋白，以 O. 25M ρΗ9· O 的硼酸钠作为缓冲体系，根据需保护的Arg的摩尔浓度按照25倍过量加入环己二酮，25度反应6小时。按目标蛋白与胰酶的质量比2000 1，加入胰酶，5度作用2. 5小时，加入自制重组羧肽酶B粗品，25度反应3小时。调节pH至3. O以下，终止酶转反应。柱层析去除残留的胰酶和羧肽酶以及体系中多余的环己二酮。调节pH至9. OJ^pH 9. O的Tris-乙酸缓冲体系透析或上柱后用PH 9. O的Tris-乙酸脱保护基即得到甘精胰岛素A链Gly (A21)，B链B-Arg (B31) Arg (B32)，反相纯化分离，HPLC分析如附图7所示获得了高纯度的蛋白，质谱分析见附图8，甘精胰岛素理论分子量6063，图中3032. 5峰为双电荷峰，结果显示成功获得的高纯度蛋白分子量与甘精胰岛素一致。实施例5 :利用柠康酐保护的甘精胰岛素及其类似物转肽取含折叠正确的B-Lys (B31) Lys (B32) Arg-A Gly (A21)的粗蛋白，以 O. 25M ρΗ9· O的硼酸钠作为缓冲体系，根据需保护的Lys的摩尔浓度按照25倍过量加入柠康酐，25度反应6小时。按目标蛋白与胰酶的质量比2000 1，加入胰酶，5度作用2. 5小时，加入自制重组羧肽酶B粗品，25度反应3小时。调节pH至3. O以下，终止酶转反应，脱除柠康酐保护基团，即得到甘精胰岛素及其类似物A链Gly(A21)，B链B_Lys (B31) Lys (B32)。
权利要求
1.一种制备甘精胰岛素及其类似物的方法，该方法包括如下步骤 (1)利用基因工程方法制备B链C端含多个碱性氨基酸的甘精胰岛素及其类似物的前体； (2)利用氨基酸侧链保护剂使胰酶特异性识别精氨酸或赖氨酸，在保护剂、胰酶的作用下获得带保护基团的甘精胰岛素及其类似物；或者不保护直接使用特异作用于Arg的梭菌蛋白酶或特异作用于Lys的胞内蛋白酶Lys C ； (3)任选地通过加入羧肽酶而脱除C末端未保护的碱性氨基酸； (4)脱保护得到甘精胰岛素及其类似物。
2.如权利要求I所述的方法，其中，所述的甘精胰岛素及其类似物为通式I所表示的、具有A链和B链的物质 A 链 iGly^O-R1 B 链Phe-B2-B29- (R2) m_ (R3) η (通式I) 其中，在上述通式I的A、B链间及链内二硫键的位置同人胰岛素或动物源胰岛素；A2-A20.B2-B29表示与人胰岛素或动物源胰岛素相同的氨基酸残基，A2-A20对应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素类似物的A链序列，B2-B29对应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素类似物的B链序列； R1是Asn、Ser和Gly残基中的一个； R2和R3分别是Arg残基、Lys残基中的一种，其中，如果R2是Arg残基，则R3是Lys残基；如果R2是Lys残基，则R3是Arg残基；m是1-4之间的整数；n是0或I。
3.如权利要求2所述的方法，其中，m= 2。
4.如权利要求I所述的方法，其中，在所述方法的步骤(2)中，所述氨基酸侧链保护剂是精氨酸或赖氨酸的保护剂，该保护剂能可逆地与精氨酸或赖氨酸残基反应。
5.如权利要求4所述的方法，其进一步包括对链内Arg进行修饰保护，所用的修饰剂为2，3 丁二酮、苯甲酰甲醛、环己二酮、己二醛、甲基己二醛、或茚三酮，优选为环己二酮。
6.如权利要求1-5之一所述的方法，其中，在所述方法的步骤(3)中，脱保护包括调节pH、通过透析或柱上脱保护。
7.一种采用如权利要求1-6之一所述方法制备的甘精胰岛素及其类似物，其中，所述的甘精胰岛素及其类似物为通式I所表示的、具有A链和B链的物质 A 链 iGly^O-R1 B 链Phe-B2-B29- (R2) m_ (R3) η (通式I) 其中，在上述通式I的A、B链间及链内二硫键的位置同人胰岛素或动物源胰岛素；A2-A20.B2-B29表示与人胰岛素或动物源胰岛素相同的氨基酸残基，A2-A20对应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素类似物的A链序列，B2-B29对应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素类似物的B链序列； R1是Asn、Ser和Gly残基中的一个； R2和R3分别是Arg残基、Lys残基中的一种，其中，如果R2是Arg残基，则R3是Lys残基；如果R2是Lys残基，则R3是Arg残基；m是1-4之间的整数；n是0或I。
8.如权利要求7所述的甘精胰岛素及其类似物，其中，m= 2。
9.一种制备如权利要求7-8之一所述甘精胰岛素及其类似物的前体，其中，该前体含有如下通式I的A链及B链的一段氨基酸序列，而且，B链与A链之间有连接肽 A 链 iGly^O-R1 B 链Phe-B2-B29- (R2) m_ (R3) η (通式I) 其中，在上述通式I的A、B链间及链内二硫键的位置同人胰岛素或动物源胰岛素；A2-A20.B2-B29表示与人胰岛素或动物源胰岛素相同的氨基酸残基，A2-A20对应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素类似物的A链序列，B2-B29对应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素类似物的B链序列； R1是Asn、Ser和Gly残基中的一个； R2和R3分别是Arg残基、Lys残基中的一种，其中，如果R2是Arg残基，则R3是Lys残基；如果R2是Lys残基，则R3是Arg残基；m是1-4之间的整数，优选为2 ;n = I。
10.如权利要求9所述的前体，其中，所述前体中的连接肽是包括C肽、小C肽在内的各种连接肽，该连接肽的C末端为通式I中的R3 ;优选地，所述前体的B链N端融合有未切掉的信号肽序列、有助于复性的分子伴侣序列或其它连接肽序列，该连接肽的C末端为通式I中的R3。
全文摘要
本发明公开了一种甘精胰岛素及其类似物的制备方法，该方法包括如下步骤(1)利用基因工程方法制备B链C端含多个碱性氨基酸的甘精胰岛素及其类似物的前体；(2)利用氨基酸侧链保护剂使胰酶特异性识别精氨酸或赖氨酸，在保护剂、胰酶的作用下获得带保护基团的甘精胰岛素及其类似物；或者不保护直接使用特异作用于Arg的梭菌蛋白酶或特异作用于Lys的胞内蛋白酶Lys C；(3)任选地通过加入羧肽酶而脱除C末端未保护的碱性氨基酸；(4)脱保护得到甘精胰岛素及其类似物。本发明的制备方法更为简便，得率高，而且应用范围更广，适用于两个以上的碱性氨基酸的引入。
文档编号C12P21/06GK102816785SQ201210163529
公开日2012年12月12日 申请日期2012年5月24日 优先权日2012年5月24日
发明者夏晶 申请人:上海华谊生物技术有限公司