专利名称：玉米wus1基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物学和基因工程技术领域，具体地说，涉及玉米基因启动子及其应用，尤其是在启动植物组织表达目的基因中的用途。
背景技术：
植物基因工程的目的是将外源基因导入受体植物后使其正确而有效地表达，而适合的启动子是外源基因有效表达的关键因素。目前，已有许多不同来源的启动子被用于植物品质改良基因工程、抗病育种基因工程以及植物生物反应器等基因工程领域。这些启动子中一大类是从根癌农杆菌中分离出来的，另一大类为植物本身来源的启动子。但是上述启动子控制的目的基因表达量往往较低，所以在植物植物遗传转化中通常选用植物病毒启动子。在植物基因表达中广泛应用的启动子主要是花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启 动子。但是从病毒中克隆出来的基因启动子序列应用到植物基因工程中可能存在潜在的生物不安全性，因此，从植物本身克隆活性强的启动子势在必行。目前已经从植物中克隆的可高效表达的组成型启动子主要有水稻肌动蛋白基因(actinl)启动子和玉米泛素基因(ubiquitin)启动子,种类较少。玉米WUS (wuschel)基因编码一转录因子，它的存在使周围细胞具有干细胞的特征，与之相关的信号系统近年逐步被阐明。在茎尖分生组织内WUS和CLV (clavata)之间形成一个反馈调节环，使得干细胞保持自我更新，维持茎尖的顶端优势。在胚胎分生组织内，CLV3的表达只依赖于WUS的存在，而在胚以后的发育中，CLV3的表达受到WUS和STM(shootmeristemless)的双重调节，启动器官发生。在花分生组织中，WUS和LFY (leafy)共同激活AG (agamous)基因的表达，WUS受AG的反馈抑制。由WUS建立的信号体系还参与胚珠的发育。当WUS蛋白和生长素共存时，可以高效启动体细胞胚的发生。细胞对WUS信号的感应性与细胞所处的微环境有关，WUS在不同环境条件下可以启动不同的下游基因表达。WUS基因启动子的克隆一方面将有利于玉米发育机制的研究，另一方面将可能提供另一种可启动目的基因高效表达的植物自身启动子。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种分离的多核苷酸。本发明的再一的目的是，提供一种上述多核苷酸的用途。本发明的另一的目的是，提供一种重组载体。本发明的第四个目的是，提供一种遗传工程化的宿主细胞。本发明的第五个目的是，提供一种制备转基因植物的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是
一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自下列中的一种a)由SEQ ID NO. 3所不的序列构成的核苷酸序列；或10与a)中所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是如上所述的多核苷酸在启动植物组织表达目的基因中的用途。所述的植物组织是根、托叶、叶和/或茎。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是
一种重组载体，所述的重组载体含有如上所述的多核苷酸，作为启动子元件。所述的重组载体还含有与所述的多核苷酸可操作地连接的目的基因。为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是
一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如上所述的重组载体；或其基因组中整合有外源的如上所述的多核苷酸。为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是
一种制备转基因植物的方法，所述的方法包括下列步骤a)提供含有作为启动子元件的如上所述的多核苷酸以及与所述多核苷酸可操作地连接的目的基因的构建物山)将所述构建物导入植物细胞、组织或器官；c)筛选出导入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞、组织或器官；d)使所述的植物细胞、组织或器官再生成植株。所述的植物为作物。所述的植物为禾本科植物。所述的禾本科植物选自水稻、玉米、小麦、大麦或高粱。本发明优点在于本发明克隆得到了 WUSl基因启动子，并证明该启动子能启动目的基因在水稻的根、托叶、叶和茎中表达，与转化PCAMBIA1301载体的阳性对照比较表明，该启动子驱动目的基因表达的效率与(CaMV) 35S启动子相当，是一种新的可用于植物基因工程的来源于植物的启动子，生物安全性强；同时，该启动子的克隆对于玉米发育机制的研究具备重要的参考价值。
附图I是PMD18-T载体图谱。附图2是pCAMBIA1301载体图谱。附图3是转基因植株各组织的⑶S染色结果，表达⑶S的细胞经染色呈蓝色，A-D分别是转化p-ZmPwl载体水稻的根、托叶、叶、茎的GUS染色结果；E_H分别是转化PCAMBIA1301载体水稻的根、托叶、叶、茎的GUS染色结果；I_L分别是未转化水稻的根、托叶、叶、茎的⑶S染色结果。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例I
I、材料
本实施例中所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知的常规方法；所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，测序由Invitrogen公司进行；PCR试剂盒、连接试剂盒和载体构建过程中的核酸内切酶均购自于自宝生物工程有限公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购于全式金生物技术有限公司，具体操作方法均参照试剂盒说明书进行；Trans5a化学感受态细胞、EH105农杆菌感受态细胞购于全式金生物技术有限公司；PMD18-T Vector和pCAMBIA1301购于宝生物工程有限公司，载体图谱分别如图I和图2所示；YEP液体培养基配方为牛肉浸膏10 g，酵母提取液10 g，NaCl 5 g，pH 7.0，对应的固定培养基添加I. 5%的琼脂；愈伤诱导培养基、继代培养基、液体共培养基、固体共培养基、筛选培养基、分化培养基均为水稻遗传转化常用培养基。2、方法和结果
2.1玉米基因的获得
首先在NCBI网站(http://www. ncbi.nlm.nih. gov)中以关键词“fKS7”搜索基因，获得玉米ri/分基因表达的核苷酸序列。
2. 2玉米WUSl基因启动子ZmPWl的克隆
将启动WUSl表达的启动子命名为ZmPWl，根据WUSl上游长度为528 bp的核苷酸序列设计扩增该片段的引物，上游加历HI (AAGCTT)酶切位点，下游加Afco I (CCATGG)酶切位点，引物序列如下上游引物(SEQ ID NO. 1):5’-CGCAAGCTTCCAAAATGTAGT GATGCA-3’；下游引物(SEQ ID NO. 2) :5’ - TGCCATGGATGCCTCAGCAGC TGGTCA -3’。提取玉米(Zea mays L. )B73基因组DNA并以此为模板，在SEQ ID NO. I和SEQ ID
NO. 2的引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系为
ToXPCRBuffer|5μ L
TbmMdNTPsI μ L
上游引物_1μ
ΙΟμΜ下游引物_I μ L
至~米Β73基因组DNAIOpg —
DNAPolymerase (21Ι/μ )O. 5 μ L
IdH2O139. 5~
PCR反应条件为预变性94°C，5分钟；变性:94°〇，30秒，退火571，40秒，延伸72°C，I分钟，变性至延伸总共循环34次；延伸完全72°C，10分钟。反应结束后，PCR产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化528 bp的目的片段即启动子ZmPWl，将其克隆到载体pMD18-T Vector，得到重组质粒载体pMD18_ZmPWl，再将该重组质粒载体转化到TranS5a化学感受态细胞中，PCR筛选阳性克隆，测序，测序结果表明启动子ZmPWl具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。2. 3 WUSl基因启动子ZmPWl表达载体的构建
将用PCR扩增得到并克隆于PMD18-T载体上的ZmPWl片段用Hind III和Afco I酶切并回收，与用相同酶切PCAMBIA1301载体回收的片段连接，构建表达载体p-ZmPWl，其载体构建图具体是hpt :潮霉素抗性基因，在该基因上游有一 nos启动子；ZmPWl :启动子ZmPWl ；gus glucoronidase基因，即⑶S报告基因；nos :终止子,在其下游是⑶S报告基因。取纯化后I μ g的p-ZmPWl质粒DNA加入到200 μ L ΕΗ105农杆菌感受态细胞中，混匀；冰浴5分钟后转入液氮中速冻I分钟，接着移至37°C水浴5分钟，加入I mL YEP液体培养基，28°C，250 rpm预表达4-5小时；10000 rpm离心30秒，弃上清，加入O. ImL YEP液体培养基，重新悬浮细胞；涂布于含100 μ g/mL卡那霉素(Kanamycin, Kan)和50 μ g/mL利福平的YEP固体平板上，28°C培养约48小时。挑取平板上长出的单菌落，接种于含100 μ g/mL Kan和50 μ g/mL利福平的YEP液体培养基中，最后提取质粒。所提质粒先用SEQID NO. I和SEQ ID NO. 2进行PCR初步鉴定，再用Hind III和Afco I酶切验证。2. 4农杆菌介导水稻遗传转化
通过农杆菌介导的遗传转化方法和共培养法将含有目的基因ZmPWl的农杆菌导入植物受体材料水稻中花11号。
2. 4. I水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养与继代培养
去壳的水稻成熟种子先用ddH20洗4-5次，再用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用含有1/1000吐温的20%次氯酸钠浸泡30分钟，期间不停的摇晃，进行表面灭菌，之后用无菌水冲洗3-4次，再将成熟种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在愈伤诱导培养基上，28°C弱光培养。约10-15天后，将愈伤组织转入继代培养基上，在相同条件下继代培养。每两周继代培养一次，继代两次后，挑取色泽淡黄的愈伤组织用于共培养。2.4.2用于转化水稻的农杆菌菌液的准备
将含有P-ZmPWl的农杆菌接种于YEP液体培养基(含有100 μ g/mL Kan和50 μ g/mL利福平)中，28°C振荡培养至OD6tltl=O. 6-1.0 ;室温下5000 rpm离心5分钟收集菌体，随后将其悬浮于液体共培养基中，调整菌体浓度至0D_=0. 4，即为转化水稻用的农杆菌悬浮液。2. 4. 3农杆菌侵染水稻愈伤组织
挑选状态较好(继代培养5-7天、色泽淡黄)的愈伤组织放入25 mL无菌三角瓶中，力口入适量农杆菌悬浮液以保证有足够的菌液与材料接触，280C，150 rpm摇床上培养20-30分钟，之后倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移至铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，22 °C暗培养2-3天。2. 4. 4抑菌处理
用ddH20清洗愈伤组织3-4次至清洗液清亮，弃去清洗液，用无菌滤纸吸干，转入含有500mg/L头孢霉素和200mg/L羧节青霉素的溶液中振荡灭菌半个小时以上，用无菌滤纸吸干，转至铺两层无菌滤纸的培养皿中干燥处理24-72小时；再将愈伤组织转移至加有500mg/L头孢霉素和50mg/L潮霉素的筛选培养基上，28°C光照培养约30天。2. 4. 5抗性愈伤组织的分化
从筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的潮霉素抗性愈伤转至含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，先28°C暗培养3天，然后转至30°C全光照条件下培养，一般经过15-20天左右，有绿点出现。30-40天后进一步分化出小苗。2.4.6生根、壮苗和移栽
待抗性愈伤组织分化出的小苗高度大于3cm时，移到生根培养基上，培养2-3周。选择高15cm以上、根系发达的小苗，用温水洗去培养基，在温室内移栽入土。水面以不淹没小苗为度，晴天需要遮荫到小苗成活(以吐水为准)。待转基因小苗生长健壮后移入田中生长。2.5转基因水稻的的鉴定
以提取的转基因水稻总DNA为模板，用PCAMBIA1301载体抗性筛选基因潮霉素的上游引物和下游引物配对扩增潮霉素基因，初步鉴定转基因植株。用于检测潮霉素抗性基因的引物序列如下上游引物(SEQ ID NO. 4) :5’-ACTCACCGCGACGTCTGT-3’ ；下游引物(SEQ IDNO. 5) :5’ -TTTCTTTGCCCTCGGACG-3’。2. 6转基因水稻各组织的⑶S染色
初步鉴定为转基因植株后，接着对转基因植株进行GUS组织染色。取转基因水稻的根、托叶、叶片、茎四种待检测的植物组织于离心管中，加入⑶S缓冲液浸没组织块，再加入5%(v/v)用量的⑶S染色液，混匀后37°C下保存16-24小时。叶片等绿色材料转入70%乙醇溶液中脱色2-3次，直至阴性对照材料呈白色。染色结果如图3所示，肉眼或显微镜下观察，白色背景下的蓝色小点即为GUS表达载体p-ZmPWl的表达区域，结果表明启动子ZmPWl能驱动基因在水稻的根、托叶、叶片、茎中表达，与35s启动子效果相当。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种分离的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸选自下列中的ー种 a)由SEQID NO. 3所示的序列构成的核苷酸序列；或b)与a)中所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.如权利要求I所述的多核苷酸在启动植物组织表达目的基因中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的植物组织是根、托叶、叶和/或茎。
4.ー种重组载体，其特征在于，所述的重组载体含有如权利要求I所述的多核苷酸，作为启动子元件。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体还含有与所述的多核苷酸可操作地连接的目的基因。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞 含有如权利要求4或5所述的重组载体；或 其基因组中整合有外源的如权利要求I所述的多核苷酸。
7.ー种制备转基因植物的方法，其特征在于，所述的方法包括下列步骤 a)提供含有作为启动子元件的如权利要求I所述的多核苷酸以及与所述多核苷酸可操作地连接的目的基因的构建物； b)将所述构建物导入植物细胞、组织或器官； c)筛选出导入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞、组织或器官； d)使所述的植物细胞、组织或器官再生成植株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的植物为作物。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的植物为禾本科植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的禾本科植物选自水稻、玉米、小麦、大麦或高粱。
全文摘要
本发明提供了玉米WUS1基因启动子，其具有如SEQIDNO.3所示的序列构成的核苷酸序列或与SEQIDNO.3所示的序列互补的核苷酸序列；本发明还提供了含有所述启动子的载体和宿主细胞；本发明还公开了所述启动子的用途。其优点在于克隆得到了WUS1基因启动子，并证明该启动子能启动目的基因在水稻的根、托叶、叶和茎中表达，与转化pCAMBIA1301载体的阳性对照比较表明，该启动子驱动目的基因表达的效率与(CaMV)35S启动子相当，是一种新的可用于植物基因工程的来源于植物的启动子，生物安全性强；同时，该启动子的克隆对于玉米发育机制的研究具备重要的参考价值。
文档编号C12N15/84GK102703450SQ201210163590
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月24日 优先权日2012年5月24日
发明者姜翠萍, 曹建刚, 朱苏文, 段思宇, 程备久, 竹荣梓, 项艳 申请人:安徽农业大学