专利名称：含hspa1a启动子与报告基因的重组质粒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，更具体地说，涉及含有HSPAlA基因的启动子和报告基因的重组质粒及其制备方法和应用。
背景技术：
当今世界，癌症日益成为人类健康的一大威胁。据统计，目前世界每年癌症死亡率呈持续上升之势，成为威胁人类健康的头号杀手。因此，肿瘤的防治一直是医药学工作者所 致力研究的一大难题。近年来光动力疗法正越来越多地用于肿瘤的治疗，成为有效治疗肿瘤的新技术。光动力疗法是一种依托肿瘤组织对光敏剂(通常指卟啉及卟啉类衍生物或拥有一定光物理活性的化合物)的选择性吸收，通过采用适当波长的光源对肿瘤病灶进行照射，引发光化学反应，导致单线态氧(1O2)及其他活性氧自由基(ROS)的形成。光诱导形成的ROS能引起氧化应激反应从而导致光敏剂聚集位点的损伤乃至于肿瘤的摧毁。作为光动力学疗法的主导，光敏剂对于TOT的应用和发展产生了至关重要的促进作用。光敏剂研制开发一直是相关领域研究者关注的焦点。临床用于PDT治疗的光敏剂通常与细胞膜、内质网、线粒体、溶酶体等细胞器膜或其中多个位点结合。由于细胞核不是光敏剂的首要分布位点，所以这种抗肿瘤疗法与传统的化疗或放疗相比，其基因毒性更小。PDT在体内的光损伤及细胞毒性程度，是多个因素决定的，它与使用的光敏剂、亚细胞定位、光敏剂与光照射的处理时间以及不同的光照条件有关。此外，肿瘤的类型及氧化水平也是决定因素之一。光动力疗法(PDT)所引起的氧化应激能够诱导应激蛋白编码基因的表达，其中包括热休克(hsp)家族蛋白。此类蛋白为高度保守的分子伴侣，在初期蛋白折叠、错叠蛋白重折叠及降解方面起到重要的作用。目前已有大量文献报道热休克蛋白(HSP)基因表达量在细胞应激环境上调。其中HSPAlA基因编码的HSP70蛋白被公认为氧化应激诱导性表达的主要热休克蛋白亚型。
发明内容
本发明的目的是，提供一种含有HSPAlA基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒；本发明的第二个目的是，提供所述重组质粒的制备方法；本发明的第三个目的是，提供所述重组质粒的一个新应用；本发明的第四个目的，提供一种光敏活性抗肿瘤物质的筛选方法。为了实现第一个目的，本发明提供的技术方案如下。提供一种含有HSPAlA基因核心启动子和报告基因的重组质粒，所述报告基因为萤火虫荧光素酶基因PGL3。为了实现第二个目的，本发明提供的技术方案如下。
一种含有HSPAlA基因核心启动子和报告基因的重组质粒的制备方法，包括以下步骤
(1)用pGL3-basic质粒转化常规制备的DH5α感受态细胞，进行扩增，碱裂解法制备pGL3-basic质粒，电泳检测质粒的纯度和含量，用Kpn I和HindIII对质粒进行双酶切，试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物；
(2)HSPAlA基因核心启动子序列的克隆、酶切及纯化，所用的引物为
引物 1: 5' -CGGGGTACCGCCTTTCAGGTTCACAATC-3'
引物 2: 5' -CCCAAGCTTCAATCAGCCGCTTCG-3'； 以基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增，用试剂盒凝胶回收PCR产物，将回收的PCR产物用Kpn I和HindIII双酶切；
(3)将上述获得的pGL3-basic载体和HSPAlA基因核心启动子片段进行连接反应；
(4)筛选重组子，将上述连接产物直接转化感受态大肠杆菌，经过含有氨苄青霉素的LB培养基中选择培养，从转化子的平板上随即挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法少量提取质粒备用，经过酶切、PCR、测序鉴定。为了实现第三个目的，本发明提供的技术方案如下。一种含有HSPAlA基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒在筛选光敏活性抗肿瘤物质方面的应用。作为一个优选方案，用pGL3-HSPAlA-promoter_basic质粒联合海肾突光素酶PRL-SV40质粒共转染耐药型肿瘤细胞系，通过同时检测两种荧光素酶活性来反应光动力学疗法在细胞内诱导的氧化应激反应程度，从而筛选光敏活性抗肿瘤物质。作为又一个优选方案，所述肿瘤细胞系为宫颈癌细胞系MCF-7。为实现第四个目的，本发明提供的技术方案如下。利用所述含有HSPAlA基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒，即pGL3-HSPAlA-promoter-basic质粒联合海肾荧光素酶pRL_SV40质粒共转染耐药型肿瘤细胞系，通过同时检测两种荧光素酶活性来反应光动力学疗法在细胞内诱导的氧化应激反应程度，从而筛选光敏活性抗肿瘤物质。本发明的积极效果是通过同时检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性来反应光敏化合物的光动力活性，即光动力学疗法在细胞内诱导的氧化应激反应，从而建立新型的光敏化合物的评价筛选方法。该方法在筛选光敏抗肿瘤活性物质、研究光敏剂诱导的光动力反应抗肿瘤作用机理以及体内外光动力疗法条件优化等方面有极佳的应用前景。
图I为HSPAlA基因启动子序列的克隆，其中Marker为DL2000，I和2为HSPAlA基因启动子片段(1132bp)。图2 为 pGL3_HSPAlA promoter-basic 重组质粒的 Kpn I 和 Hind III双酶切检测，其中 Marker 为 DL2000,1 和 2 为 pGL3_HSPAlA promoter-basic/ Kpn I + Hind III(4818bp+1132bp)。图3 为运用 pGL3_HSPAlA promoter-basic/ Kpn I +Hind III质粒在经金丝桃素诱导的光动力疗法处理后MCF-7细胞中荧光素酶活性的增长倍数，金丝桃素浓度范围为O—O.125 μ Μ,以每个浓度组非光照条件细胞荧光活性为对照。图4为检验经金丝桃素诱导的光动力疗法处理后MCF-7细胞中HSPAlA的蛋白表达水平，金丝桃素浓度范围为O. 015625— O. 125 μ Μ，β-acitin作为上样内参。图5为阳性药亚甲基蓝介导的光动力疗法(Me-PDT)处理后MCF-7细胞中荧光素酶活性的增长倍数，亚甲基蓝浓度为O—5 μ Μ,以每个浓度组非光照条件细胞荧光活性为对照。图6为阳性药酞菁锌介导的光动力疗法(ZnPc-PDT)处理后MCF-7细胞中荧光素酶活性的增长倍数，酞菁锌浓度为(Γ40μΜ，以每个浓度组非光照条件细胞荧光活性为对照。
具体实施方式
下面结合附图给出本发明所述的含HSPAlA启动子与报告基因的重组质粒及其制备方法和应用的具体实施方式
，本发明提供了 2个实施例，但是，本发明的实施不限于以下的实施例。实施例I
HSPAlA基因核心启动子序列和报告基因重组质粒的制备。一、试验材料
I、菌株、质粒
Cl)菌株大肠杆菌Ε. coliDH5a ,MCF-7购于中科院细胞所。(2)质粒pGL3-basic和pRL_SV40为本实验室保存。2、生化试剂
(1)ExTaq酶，限制性内切酶HindIII，KpnI 和 DNA Ligation Kit 购自 TaKaRa 公司。DL2000 marker 购自上海 MajorBio 公司。PRMI 1640 培养液(Hyclone) ; LipofectTransfection Reagent (TIANGEN, Beijing)；
(2)双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自VigOTous公司。质粒回收试剂盒和DNA片段回收试剂盒购自Tiangen公司；
(3)小牛血清购自民海生物公司。BSA,NaCl,NaF,Tris,EDTA, Trytone, Yeast Extract,PMSF, PAGE, SDS, Tween-20，G250，硼酸，甘氨酸，亮肽，蛋白显影液等试剂购自上海MajorBio公司。HSPA1A, β-actin抗体购买于protein tech公司。3、主要试剂的配制
100mg/mL 牛血清白蛋白(BSA):称取 BSA O. Ig 溶于 ImL O. 15 M NaCl，一 20°C保存。制作蛋白标准曲线时，用O. 15M NaCl进行100倍稀释成lmg/mL，一 20°C保存。蛋白电泳缓冲液(5X):称取Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g溶于IL超纯水，室温保存。蛋白转移缓冲液(5X ):称取Tris 29g，甘氨酸14. 5g,SDS I. 85g溶于IL超纯水，室温保存。临用前稀释为IX，每升加入甲醇200 mL。I. 5 M Tris · HCl (pH 8.8):称取 Tris 45. 43g 溶于 200mL，浓盐酸调 pH 至 8. 8，超纯水定容至250 mL，4°C保存。O. 5 M Tris · HCl (pH 6. 8):称取 Tris 15. 14g 溶于 200mL，浓盐酸调 pH 至 6. 8，超纯水定容至250 mL，4°C保存。30%丙烯酰胺称取丙烯酰胺29g，甲叉双丙烯酰胺Ig溶于100 mL，滤纸过滤于棕色瓶中4°C保存。TBS缓冲液(5X ):称取Tris 24. 2g，NaCl 80g溶于IL超纯水，室温保存。TBST 缓冲液(含 O . 1% Tween-20 的 TBS 缓冲液):量取 Tween-20 ImL 溶于 IL TBS,即可使用，最好现用现配。封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液)称取脱脂奶粉5g溶于IOOmL TBST，溶解后4 C保存。G250考马斯亮蓝溶液(测蛋白含量专用)称取G250 lOOmg，溶于50mL 95%乙醇，量取IOOmL磷酸，超纯水定容至1L，滤纸过滤，4°C保存。I M Tris · HCl (pH 7. 5):称取 Tris 30. 29g 溶于 200mL 超纯水，浓盐酸调 pH 至8. 8，超纯水定容至250 mL，4°C保存。I M DTT :称取 DTT 3. 085g 溶于 20mL O. OlM 乙酸钠溶液，_20°C保存。20mg/mL PMSF :称取 PMSF O. 2g 溶于 IOmL 异丙醇，-20°C保存。细胞总蛋白提取液称取NaCl O. 73g，NaF O. 524g，EDTA O. 931g，SDS O. 25g，去氧胆酸钠 2. 5g，量取 Triton-100 2. 5mL, I M Tris · HCl (pH 7.5) 2. 5mL，超纯水定容至250mL，4°C保存。用时每毫升提取液中加I μ L DTT(lM)、5yL PMSF (20mg/mL)、10 μ L亮肽(2. 5mg/mL)即可。SDS-聚丙烯酰胺分离胶(5mL)
权利要求
1.一种含有HSPAlA基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒，其特征在于，所述报告基因为萤火虫荧光素酶基因PGL3。
2.一种根据权利要求I所述的含有HSPAlA基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)用pGL3_basic质粒转化常规制备的DH5a感受态细胞，进行扩增，碱裂解法制备pGL3-basic质粒，电泳检测质粒的纯度和含量，用Kpn I和HindIII对质粒进行双酶切，试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物； (2)HSPAlA基因核心启动子序列的克隆、酶切及纯化，所用的引物为引物 I: 5' - CGGGGTACCGCCTTTCAGGTTCACAATC-3' 引物 2: 5' -CCCAAGCTTCAATCAGCCGCTTCG-3'； 以人基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增，用试剂盒凝胶回收PCR产物，将回收的PCR产物用Kpn I和HindIII双酶切； (3)将上述获得的pGL3-basic载体和HSPAlA基因核心启动子片段进行连接反应； (4)筛选重组子，将上述连接产物直接转化感受态大肠杆菌，经过含有氨苄青霉素的LB培养基中选择培养，从转化子的平板上随即挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法少量提取质粒备用，经过酶切、PCR、测序鉴定。
3.一种根据权利要求I所述的含有HSPAlA基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒在筛选光敏活性抗肿瘤物质方面的应用。
4.根据权利要求3所述的含有HSPAlA基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒在筛选光敏活性抗肿瘤物质方面的应用，其特征在于，用pGL3-HSPAlA-promoter-basic质粒联合海肾荧光素酶PRL-SV40质粒共转染耐药型肿瘤细胞系，通过同时检测两种荧光素酶活性来反映光动力学疗法在细胞内诱导的氧化应激反应程度，从而筛选光敏活性抗肿瘤物质。
5.根据权利要求4所述的含有HSPAlA基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒在筛选光敏活性抗肿瘤物质方面的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞系为宫颈癌细胞系MCF-7。
6.一种光敏活性抗肿瘤物质的筛选方法，其特征在于，利用权利要求I所述的含有HSPAlA基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒，即pGL3-HSPAlA-promoter-basic质粒联合海肾荧光素酶PRL-SV40质粒共转染耐药型肿瘤细胞系，通过同时检测两种荧光素酶活性来反应光动力学疗法在细胞内诱导的氧化应激反应程度，从而筛选光敏活性抗肿瘤物质。
全文摘要
本发明公开了一种含有HSPA1A启动子序列和报告基因的重组质粒及其制备方法和应用，将构建的HSPA1A启动子序列报告基因载体与pRL-SV40载体共转染到目标细胞系中，处以光敏剂介导的光动力疗法，通过同时检测萤火虫和海肾荧光素酶的活性来反映光动力疗法在细胞内诱导的氧化应激反应程度，从而建立光敏剂筛选新方法。该方法在筛选光敏抗肿瘤活性物质、研究光敏剂诱导的光动力反应抗肿瘤作用机理以及体内外光动力疗法条件优化等方面有极佳的应用前景。
文档编号C12N15/66GK102703484SQ201210163119
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月24日 优先权日2012年5月24日
发明者刘建文, 梁倩男, 江林, 沈克, 王傲雪, 程卓安, 谢晟, 赵宇侠, 郑媛虹 申请人:华东理工大学