专利名称：利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，通过构建人工 组合型启动子文库并以之替代染色体上自身启动子的方法，来调节并优化相关代谢通路中 多个基因的表达，从而使所选择的微生物能有效地产生所需产物，属于微生物基因改造技 术领域。
背景技术：
微生物(例如Escherichia coil)作为工业反应器广泛用于化学品、酶以及活性 药物成分、农业化学品和生物燃料的大规模生产。然而，自然界存在的菌株在理想条件下很 少具有优良表现。所以用生物方法生产这些化学物质的最大挑战在于如何优化细胞代谢性 能以便减低生产成本。用于改善菌株性能的常用策略是改变基因表达，目前可以采用多种方法达到此目 的，其中一种方法是在选定的宿主菌中利用多拷贝质粒表达同源或者异源基因。使用质粒 表达重组基因的优势在于高拷贝数，然而，质粒的存在及维持本身对宿主细胞是一种代谢 负担，这对高拷贝数质粒尤其如此；而且，这种方法也有赖于质粒的稳定性。另一种方法是 在染色体水平上调节基因表达，例如1)对基因组进行随机突变；2)对具可诱导启动子的 基因采用不同浓度诱导物诱导；3)改变染色体的基因调控区。随机突变已经广泛应用于有关基因型的改良，例如要求菌株代谢物的过量表达或 对毒性化合物的高耐受。然而，随机突变非常耗时。同时，由于缺乏对有关突变体的遗传特 性的认识，很难对菌株作进一步改造。使用不同浓度的诱导物滴定诱导性启动子体系是调控基因表达的另一种常用手 段。为了获得特定单一蛋白的高表达，诱导性表达比较可取。然而，诱导性体系常常伴随着 诱导物毒性和诱导物介导的多效性作用，而且，诱导物的大范围使用时成本很高。细胞间的 异质性对采用这项策略也是一个问题。启动子对基因表达是一个关键因子。启动子内部区域结构可直接影响基因的转 录功能。因此，获得高基因表达量的一种有效手段是在染色体水平上直接改变启动子结 构。例如，构建一个可调控的人工启动子文库来取代自身的启动子，这调控区包含-35序列 盒，-10序列盒和位于两个序列盒之间的一个连接区(Hammer et al.，2006)。类似的方法 是构建组合型启动子(Cox，et al.，2007)，包含了对应于启动子基因的三个编码片段的序 列单元。这些单元对应于-35盒的45bp上游区域(远端)，_35和-IObp盒之间的17bp区 域(中间)，_10盒的30bp下游区域(近端)。通过对这些片段的随机装配，形成了一个多 元化和新的启动子库。然而，上述方法都存在一定的缺陷。这些方法每次只能研究一个基因、或限于一个 调节单元。因此，在基因工程领域，迫切需要开发一种快速有效的方法，有助于代谢通路中 多个基因的最适表达，优化目的产物的生产。
发明内容
本发明的目的就是为了解决现有技术中存在的上述问题，提供一种利用组合型启 动子调节染色体基因组功能的方法，采用模块化组合的方式构建组合型启动子文库，通过 改变启动子序列、核糖体结合位点(RBS)序列和转录调控单元序列，从而调控特定细胞通 路中多个基因的表达。本发明的技术解决方案是利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其 特征在于构建人工组合型启动子文库并以之替代染色体上自身启动子，利用该组合型启 动子文库调节并优化相关代谢通路中多个基因的表达，使所选择的微生物能有效地产生所 需产物；所述组合型启动子文库具有启动子活性，由多个插入性DNA序列盒经同源重组组 装而成，每一对需要连接的DNA分子中，一条DNA分子的远端区包含另一条DNA分子近端区 的同源区，每个插入性DNA序列盒包括特定序列的选择性标记、改造的调控子文库、改造 的核心启动子文库和改造的核糖体结合位点文库。进一步地，上述的利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其中，对于单 个插入性DNA序列盒，创建标记基因的方法包括a)获得一个插入性DNA序列盒，包含第一个重组酶位点，第二个重组酶位点和位 于第一个和第二个重组酶位点之间的选择标记基因；b)获得第一条寡聚核苷酸，包含i)与靶染色体基因的自身启动子的上游区同源 的第一个核酸片段， )与标记基因的5’端同源的第二个核酸片段；c)获得第二条寡聚核苷酸，包含i)与上述的标记基因的3’端同源的第三个核酸 片段， )与启动子转录调控子的上游区同源的第四个核酸片段；d)在带有插入性DNA序列盒的扩增反应中，混合第一条寡聚核苷酸和第二条寡聚 核苷酸，获得具有同源末端的选择性标记基因的双链扩增产物文库。更进一步地，上述的利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其中，所述 标记基因包括，氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性 基因、嘌呤霉素抗性基因、四环素抗性基因；步骤a)所述重组酶位点包含FRT或LoxP。更进一步地，上述的利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其中，对于 单个插入性DNA序列盒，创建可以被转录因子识别的转录调控子文库的方法包括a)获得插入性DNA片段，包含第一个同源区、第二个同源区、位于第一个和第二个 同源区之间的转录调控子，所述转录调控子包含激活剂、抑制剂或双调控剂；b)获得第一条寡聚核苷酸，包含i)与筛选标记基因的下游区同源的第一个核酸 片段， )与转录调控子的5’端同源的第二个核酸片段；c)获得第二条寡聚核苷酸，包含i)与上述转录调控子的3’端同源的第三个核酸 片段， )与核心启动子的上游区同源的第四个核酸片段；d)在插入性DNA序列盒的扩增反应中，混合第一条寡聚核苷酸和第二条寡聚核苷 酸，获得具有同源末端的转录调控子的双链扩增产物文库。更进一步地，上述的利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其中，对于 单个插入性DNA序列盒，创建核心启动子文库的方法包括a)获得插入性DNA序列盒，包含第一个同源区、第二个同源区和位于第一个和第 二个同源区之间的核心启动子；
b)获得第一条寡聚核苷酸，包含i)与转录调控子的3’端同源的第一个核酸片段， )靶基因的改造型核心启动子，包含"35热点区(-35到-30)、连接区和-10热点区(-12 到_7)，连接区序列包含14-20个核苷酸，介于-35区和-10区之间，上述的启动子前体改造 后含有至少一个核苷酸修饰位点，-35区和-10区分别包含启动子的4-6个修饰性核苷酸， iii)与启动子的核糖体结合位点的上游区同源的第三个核酸片段；c)获得与第一条寡聚核苷酸互补的第二条寡聚核苷酸；d)在退火反应中混合第一条寡聚核苷酸和第二条寡聚核苷酸，获得人工启动子的 双链DNA文库。更进一步地，上述的利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其中，对于 单个插入性DNA序列盒，创建核糖体结合位点文库的方法包括a)获得插入性DNA序列盒，包含第一个同源区、第二个同源区和位于第一个和第 二个同源区之间的核糖体结合位点；b)获得第一条寡聚核苷酸，包含i)与靶染色体基因启动子的下游区同源的第一 个核酸片段， )具有靶基因的改造型核糖体结合位点的第二个核酸片段，iii)与靶染色 体基因自身启动子的上游区同源的第三个核酸片段；c)获得与第一条寡聚核苷酸互补的第二条寡聚核苷酸；d)在退火反应中混合第一条寡聚核苷酸和第二条寡聚核苷酸，获得包含改造型核 糖体结合位点的双链DNA文库。再进一步地，上述的利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其中，利用 所述组合型启动子文库调节并优化相关代谢通路中多个基因表达的方法是a)获得包含 所述组合型启动子的PCR产物文库；b)使用PCR产物转化细菌宿主细胞；c)获得生长的转 化型细菌；d)筛选靶染色体基因高表达的转化型细菌。综上，本发明提供了一种通过构建人工启动子文库调节特定细胞通路中的多基因 表达的方法。人工启动子文库包括核心启动子、核糖体结合位点和转录调控区，通过改造这 些区域的DNA序列，改变DNA结构或转录因子的结合效率，从而获得包含任何活性启动子 的组合型文库。本发明同时与创建可编码移动性抗生素抗性序列盒和人工组合型启动子 的PCR产物有关，PCR产物由电转化到合适的受体菌，其片段末端的短同源序列通过噬菌体 介导的Red/ET重组技术与染色体进行同源重组，利用抗生素抗性筛选理想重组产物，然后 通过无缝位点特异性重组从受体菌敲除抗生素抗性序列盒，仅保留靶基因上游的工程启动 子。该过程可多次重复以构建多染色体位点中多种整合的菌株，每一个人工组合型启动子 均可准确、同时或单独调控细胞中几种基因活性。因此，本发明可以适用于真核和原核细胞 中代谢优化和代谢控制分析。
图1是本发明的方法步骤示意图。其中，步骤(A)，组合型启动子包含选择性标记(SM)，转录调控元件文库(RE)，核心启动 子文库(CP)，核糖体结合位点文库(RBS)，两个同源臂(a和b代表)。该组合型启动子通过 PCR进行装配。PCR引物使用下划线、斜体字母(P-f和P-r)和箭头标记；步骤(B)，在E. coli基因组中使用构建的组合型启动子盒取代靶基因的自身启动子。
具体实施例方式下面结合具体实例对本发明技术方案作进一步说明。其中，所述“微生物”一词是 指包括细菌在内的原核生物和包括酵母、真菌及高等生物在内的真核微生物。本发明牵涉多种DNA片段同时组装的方法。为了实现这个目的，进行连接的DNA片 段设计如下对每一对需要连接的片段，一个DNA片段的远端区需要包含与另一DNA片段的 近端区序列同源的区域。为了促使DNA片段按照预定的方向和顺序连接，每一套选择的识 别序列的远端和近端区都是独一无二的(与其它DNA片段对的识别序列区域不同)。这种 方法可以使大量DNA片段连接起来。同时，本发明提供了来源于多个DNA片段的组合型启 动子盒通过同源重组进行组装的方法，其中同源重组包括需要连接的DNA片段，设计如下 对每一对需要连接DNA分子，DNA分子的远端区和另一个DNA分子的近端区具有序列同源 区。对于每个插入性DNA序列盒，本发明提供了组合型启动子文库创建的方法，包括在特 定序列中含有筛选性标记的插入性DNA序列盒；改造的调控单元文库；改造的核心启动子 文库和改造的核糖体结合位点文库，因此组合型启动子盒具有启动子活性。本发明提供了创建标记基因DNA序列盒的方法，包括a)获得一个插入性DNA序 列盒，含有第一个重组酶位点、第二个重组酶位点和位于两种重组酶位点之间的选择性标 记基因；b)获得第一个寡聚核苷酸，包含i)与自身启动子上游区域同源的第一个核酸片 段，置换靶染色体基因的启动子；ii)与标记基因的5’端同源的第二个核酸片段；c)获得第 二条寡聚核苷酸，包含i)与上述的标记基因的3’端同源的第三个核酸片段，ii)与启动子 的转录调控子的上游区域同源的第四个核酸片段；d)在带有插入DNA序列盒的扩增反应中 混合第一条寡聚核苷酸和第二条寡聚核苷酸，获得具有同源末端的筛选性标记基因的第二 条链扩增产物文库。所述“重组酶位点”包括但不局限于FRTs、LoXP的基因；所述“标记基 因”包括但不局限于氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、潮霉素 抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、四环素抗性基因等；所述扩增步骤可以采用PCR。同时，本发明还提供了创建可以被转录因子识别的转录调控子文库的方法，包括 a)获得一个插入性DNA序列盒，包含第一个同源区，第二个同源区和一个位于第一个和第 二个同源区之间的转录调控子；b)获得第一条寡聚核苷酸，包含i)与筛选标记基因的下游 区同源的第一个核酸片段， )与转录调控子的5’端同源的第二个核酸片段；c)获得第二 个寡核苷酸，包括i)与上述的转录调控子的3’端同源的第三个核酸片段；ii)与靶基因核 心启动子的上游区域同源的第四个核酸片段；d)在带有插入性DNA序列盒的扩增反应中混 合第一条寡聚核苷酸和第二条寡聚核苷酸，获得带有同源末端的转录调控子的双链扩增产 物文库。转录调控子是(但不局限于)激活剂(例如AraC)、抑制物(例如LaCI、TetR)、 和/或两种调控物(例如IcI)。扩增步骤是PCR。此外，本发明提供了创建核心启动子的方法，包括a)获得一个插入性DNA序列 盒，包含第一个同源区、第二个同源区和位于第一个和第二个同源区之间的改造型核心启 动子。b)获得第一条寡聚核苷酸，包括i)与上述的转录调控子的3’端同源的第一个核 酸片段， )含有靶基因的改造型核心启动子的第二个核酸片段，包含-35热点区域(-35 到-30)、一个链接区和一个-10热点区(-12到-7)，因此连接序列包括14-20个核苷酸，位于-35区和-10区之间，其中上述的启动子前体被改造成为包含至少一个改造型核酸位点， 其中-35区和-10区分别包含启动子4-6个改造型核苷酸，iii)与启动子的核糖体结合位 点的上游区同源的第三个核酸片段；c)获得与第一条寡聚核苷酸互补的第二条寡聚核苷 酸；d)在退火反应中混合第一条寡聚核苷酸和第二条寡聚核苷酸获得含有人工启动子的 双链DNA产物。最后，发明还提供了创建核糖体结合位点(RBS)文库的方法，包括a)获得一个插 入性DNA序列盒，包括第一个同源区，第二个同源区和位于第一和第二同源区之间的核糖 体结合位点；b)获得第一条寡聚核苷酸，包括i)与靶染色体基因的改造型启动子的下游 区同源的第一个核酸片段；ii)含有靶基因的改造型核糖体结合位点的第二个核酸片段， iii)与靶染色体基因置换的自身启动子的下游区同源的第三个核酸片段；c)获得与第一 条寡聚核苷酸互补的第二条寡聚核苷酸；d)在退火反应中混合第一条寡聚核苷酸和第二 条寡聚核苷酸，获得包含改造型核糖体结合位点的双链DNA文库。改造型启动子还包括连接序列的改造。连接序列一般是15-20核苷酸，常见的是 16-18个核苷酸。改造可能包括1，2，3，4或者5个碱基对添加到连接区或者1，2，3，4，5或 更多碱基对的置换。理想的改造是一个或者两个碱基对添加到连接区，其中添加可能是任 何一个A，T，C或者G核苷酸。组合型启动子可以通过四个片段的同源重组进行装配，四个片段包括筛选性标 记、改造型调控子文库、改造型核心启动子文库和改造型核糖体结合位点文库。每一片段应 该在单链片段的一端终止，5’末端磷酸的A或A’，也可能是3’突出末端。每一 A片段需包 含与至少一个B序列完全互补的序列，一个根据片段排列的顺序选择的序列。这种组装可 以采用许多方法实现，包括(不局限于)体外反应例如融合PCR、USER(尿嘧啶特异性切除 反应)、友好型克隆技术等。同时，组装也可以在体内完成。合成的DNA片段可以先后或者 同时退火成为线性载体，终止于序列C的单链区的一端，与序列A完全互补。载体的另一端 终止于序列D的单链区，与序列B完全互补。下一步是使用退火复合物转化宿主细胞，首选 E. coil或Saccharomyces Cerevisiae0 一旦进入宿主细胞，任何序列缺口将被填充，退火 的片段将被连接在一起。每一个A和A’片段存在对应于另外一个序列的独特序列，例如 每一个片段存在一个相关的独特单链序列，这有利于退火后载体片段重排的形成。退火反 应在单链结合蛋白存在或者不存在情况下均可进行，首选宿主是E. coil或Saccharomyces cerevisiae。应用核酸外切酶是产生单链片段中末端区的首选方法，例如λ核酸酶；Τ5核 酸酶、Τ7核酸酶；外切核酸酶iii ；T4聚合酶。另外，本发明提供了构建高表达靶染色体的细菌文库的具体方法，包括a)获得 上述人工启动子的PCR产物文库；b)通过λ -Red介导的重组将PCR产物整合到细菌染色 体产生转化的细菌；c)筛选生长的转化型细菌；d)获得转化型细菌文库，具有高表达的靶 染色体基因。根据该方法，可以从文库中筛选转化型细菌，筛选的转化细胞一部分含有低表 达的靶基因，另一部分具有高表达的靶基因。根据本发明技术方案，可以创建表达盒文库，每一表达盒包含至少一个靶向基因 和相关启动子，其中每一启动子包含一条核酸，它的序列根据文库中另外一条发生随机突 变。本发明可以在靶向和非靶向细胞中高通量扫描具有可视检测标记的转化细胞，评价每 一个预筛选的转化细胞特性，并根据靶向细胞中启动子的活性和非靶点细胞中活性的缺失，选择性状优良的转化细胞。本发明的可视检测标记在采用荧光扫描活性细胞筛分(FACS)技术或微流体技术 可能产生阳性或者阴性筛选。检测标记包括各种酶，辅基，荧光标记，发光标记、生物发光标 记等。合适荧光蛋白实例包括(但不局限于)黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、 青色荧光蛋白(CFP)等。合适的生物荧光标记包括(但不局限于)荧光酶、荧光素、水母素 等。可视的检测信号的酶体系包括(但不局限于)半乳糖苷酶、糖皮质激素酶、过氧化物酶等。通过以上描述可以得知，本发明提供了调控特定细胞通路中多基因表达的简单而 有效的方法，包括构建启动子区文库、重组各种转录调控子和核糖体结合位点、筛选具有 相对理想表达的细胞。下面以玉米黄质(crt基因编码)在E. coil菌株BW25113中的生物 合成通路为例验证本发明，图1是示意过程。大部分E. coil菌株包括BW25113在内并不具有玉米黄质代谢能力，Pantoea ananatis的玉米黄质生物合成要求五种同源基因(crtE，crtB, crtl，crtY和crtZ)，首先， 将五种基因导入E. coli(BW25113)染色体，产生番茄红素，这是一种在番茄和其它蔬菜中 产生的具有强大抗氧化的物质。本发明以玉米黄质生物合成为例，是因为可以在添加相应 糖的MacConkey琼脂pH指示板中筛选重组DNA片段。通过λ-Red介导的重组将Crt基因 整合到E. coli染色体。麦芽糖、L-岩藻糖、D-木糖、乳糖和蜜二糖等非必需糖的降解标记 位点可用于多步生物合成通路的位点特异性整合。因此，crt基因和位于FRT旁侧的抗生 素抗性基因的表达盒可以取代基因malEre、fucPIK、xylAB, IacZYA和melAB。其次，设计并构建Escherichia coli的组合型随机启动子，每一启动子包含三个 序列区，分别是转录调控子、核心启动子和核糖体结合位点。通过随机组合转录调控子、核 心启动子和核糖体结合位点的DNA序列，很可能改变DNA结构和转录子与启动子序列的结 合，通过这种方法可以获得包含任何活性启动子的组合型文库。然后，采用PCR合成玉米黄质生物合成通路中5个基因的启动子文库，包括选择性 标记、改造型元件、同源区，全部或者部分置换crt基因的上游区，以调控玉米黄质生物合 成。PCR产物通过电转化合适受体菌后，利用噬菌体Red/ET重组技术将PCR片段末端的短 同源区与染色体同源重组。最后，根据抗生素抗性筛选理想重组产物。以上述结论为指导，通过位点特异性重组从菌株中敲除抗生素抗性序列盒，人工 组合型启动子则精确定位于靶点基因的上游。文库中每一人工组合型启动子可以准确、同 时或单独调控细胞中几种酶活性，因此这种方法适用于真核和原核细胞中代谢优化和代谢 控制分析。综上所述，本发明提供了一种通过构建人工启动子文库来调节特定细胞通路中的 多基因表达的方法。需要注意的是，该方法适用于各种微生物基因改造，以上描述中的相关 条件均为非限制性条件。凡在本发明的启示下，仅作相关条件的等同替换或等效变换所形 成的技术方案，均在本发明要求保护的范围之内。
权利要求
利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其特征在于构建人工组合型启动子文库并以之替代染色体上自身启动子，利用该组合型启动子文库调节并优化相关代谢通路中多个基因的表达，使所选择的微生物能有效地产生所需产物；所述组合型启动子文库具有启动子活性，由多个插入性DNA序列盒经同源重组组装而成，每一对需要连接的DNA分子中，一条DNA分子的远端区包含另一条DNA分子近端区的同源区，每个插入性DNA序列盒包括特定序列的选择性标记、改造的调控子文库、改造的核心启动子文库和改造的核糖体结合位点文库。
2.根据权利要求1所述的利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其特征在 于对于单个插入性DNA序列盒，创建标记基因的方法包括，a)获得一个插入性DNA序列盒，包含第一个重组酶位点，第二个重组酶位点和位于第 一个和第二个重组酶位点之间的选择标记基因；b)获得第一条寡聚核苷酸，包含i)与靶染色体基因的自身启动子的上游区同源的第 一个核酸片段， )与标记基因的5’端同源的第二个核酸片段；c)获得第二条寡聚核苷酸，包含i)与上述的标记基因的3’端同源的第三个核酸片段， )与启动子转录调控子的上游区同源的第四个核酸片段；d)在带有插入性DNA序列盒的扩增反应中，混合第一条寡聚核苷酸和第二条寡聚核苷 酸，获得具有同源末端的选择性标记基因的双链扩增产物文库。
3.根据权利要求2所述的利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其特征在 于步骤a)所述重组酶位点包含FRT或LoxP。
4.根据权利要求2所述的利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其特征在 于所述标记基因包括，氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、潮霉 素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、四环素抗性基因。
5.根据权利要求1所述的利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其特征在 于对于单个插入性DNA序列盒，创建可以被转录因子识别的转录调控子文库的方法包括，a)获得插入性DNA片段，包含第一个同源区、第二个同源区、位于第一个和第二个同源 区之间的转录调控子；b)获得第一条寡聚核苷酸，包含i)与筛选标记基因的下游区同源的第一个核酸片段， )与转录调控子的5’端同源的第二个核酸片段；c)获得第二条寡聚核苷酸，包含i)与上述转录调控子的3’端同源的第三个核酸片段， )与核心启动子的上游区同源的第四个核酸片段；d)在插入性DNA序列盒的扩增反应中，混合第一条寡聚核苷酸和第二条寡聚核苷酸， 获得具有同源末端的转录调控子的双链扩增产物文库。
6.根据权利要求5所述的利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其特征在 于步骤a)所述转录调控子包含激活剂、抑制剂或双调控剂。
7.根据权利要求1所述的利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其特征在 于对于单个插入性DNA序列盒，创建核心启动子文库的方法包括，a)获得插入性DNA序列盒，包含第一个同源区、第二个同源区和位于第一个和第二个 同源区之间的核心启动子；b)获得第一条寡聚核苷酸，包含i)与转录调控子的3’端同源的第一个核酸片段， )靶基因的改造型核心启动子，包含"35热点区(-35到-30)、连接区和-10热点区(-12 到_7)，连接区序列包含14-20个核苷酸，介于-35区和-10区之间，上述的启动子前体改造 后含有至少一个核苷酸修饰位点，-35区和-10区分别包含启动子的4-6个修饰性核苷酸， iii)与启动子的核糖体结合位点的上游区同源的第三个核酸片段；c)获得与第一条寡聚核苷酸互补的第二条寡聚核苷酸；d)在退火反应中混合第一条寡聚核苷酸和第二条寡聚核苷酸，获得人工启动子的双链 DNA文库。
8.根据权利要求1所述的利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其特征在 于对于单个插入性DNA序列盒，创建核糖体结合位点文库的方法包括，a)获得插入性DNA序列盒，包含第一个同源区、第二个同源区和位于第一个和第二个 同源区之间的核糖体结合位点；b)获得第一条寡聚核苷酸，包含i)与靶染色体基因启动子的下游区同源的第一个核 酸片段，ii)具有靶基因的改造型核糖体结合位点的第二个核酸片段，iii)与靶染色体基 因自身启动子的上游区同源的第三个核酸片段；c)获得与第一条寡聚核苷酸互补的第二条寡聚核苷酸；d)在退火反应中混合第一条寡聚核苷酸和第二条寡聚核苷酸，获得包含改造型核糖体 结合位点的双链DNA文库。
9.根据权利要求1所述的利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，其特征在 于利用所述组合型启动子文库调节并优化相关代谢通路中多个基因表达的方法是，a)获 得包含所述组合型启动子的PCR产物文库；b)使用PCR产物转化细菌宿主细胞；c)获得生 长的转化型细菌；d)筛选靶染色体基因高表达的转化型细菌。
全文摘要
本发明提供一种利用组合型启动子调节染色体基因组功能的方法，通过构建人工组合型启动子文库替代染色体上自身启动子来调节并优化相关代谢通路中多个基因的表达，使所选择的微生物能有效地产生所需产物。组合型启动子包括四个人工合成的具有同源末端的双链DNA单元选择性标记、改造的调控子文库、改造的核心启动子文库和改造的核糖体结合位点文库，对这四个单元进行组装，然后转化到一个或多个靶细胞中取代特定细胞通路中多个靶染色体基因的自身启动子，导致大量靶细胞高表达目的基因。本发明可以构建多染色体位点中多种整合的菌株，人工组合型启动子能够准确、同时或单独调控细胞中几种基因活性，适用于真核和原核细胞中代谢优化和代谢控制分析。
文档编号C40B50/06GK101892258SQ20101021328
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者王德明 申请人:苏州神洲基因有限公司