专利名称：生物芯片制备方法
技术领域：
本发明涉及一种制备生物芯片的方法，特别是利用复配缓冲溶液诱导的蛋白质相转变来将基础生物分子及其上的目标生物分子固定在基材表面。
背景技术：
目前，发展低成本的具有实际大规模使用价值的生物芯片，特别是下一代的蛋白质和糖质芯片已经成为生物科技，药物开发，免疫分析等领域的核心和基础内容之一。这其中，如何将生物分子诸如基因，蛋白质或者糖质简单有效的固定在基材表面，同时不使其失去生物活性是技术成功的关键所在。在这个过程中，一个重要的需要解决的问题就是生物分子对于基体的吸附性污染。为了有效的抑制生物分子对各种基材的非特异性污染，特殊的分子涂层必须施加到基材表面用以抵抗生物分子的非特异性吸附。这些分子涂层属于反应惰性的材料，包括自组装单分子层，两亲性聚合物刷以及聚酯类高分子刷。随之而来的一个重要问题就是为了固定生物分子，这些分子涂层必须进行化学活化以提供可供生物分子反应的表面基团。在生物分子固定之后，这些剩余的未反应的基团必须再一次进行反应而转化为惰性结构，这个过程称之为钝化。这些活化和钝化反应极大的增加了制造成本和时间，更重要的是，由于表面化学反应的热力学和动力学限制，活化和钝化反应均不可能 100%进行，从而造成生物分子固定后的表面的性质的恶化，造成不可避免的在进一步的使用过程中的生物分子污染，即生物芯片中普遍存在的高背景，低信噪比问题。发明内容
为了克服上述不足以制备零背景，超高信噪比的下一代生物芯片，本发明提供了一种新的表面生物分子固定方法，该方法可以在不需要活化和钝化基材的前提下实现有效的生物分子固定，从而可以有效地保护基材表面不受化学处理的影响，为实现大规模的制造低成本的生物芯片以及应用提供了实际的技术基础。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是利用生物分子在溶液中的相转变来在各种基材表面固定生物分子，对各种无机，有机，金属基材，采用含有膦盐酸盐和哌嗪环两种物质的复配溶液，诱导基础生物分子发生相转变而稳定的附着于基材表面上，基础生物分子所携带的功能性单元则暴露在表面上可进一步用来结合和识别目标生物分子以实现生物芯片，生物分子微阵列制造。
本发明所采用的基础生物分子包括天然溶菌酶，人工诱导的突变体，含有溶菌酶部分序列结构的多肽，蛋白质，基因或者他们之间的结合体，溶菌酶的来源物种为人，鸡， 牛，鼠或者骆驼，基础生物分子浓度为10_8到10、g/ml，溶菌酶的英文名称为lysozyme。
本发明所采用的与基础生物分子相联接的功能性单元为可以起到识别和结合大分子或者大分子组装体的生物小分子，短肽或者颗粒，生物素或含有生物素结构的分子或含有脲基结构的分子或者基团或者多肽，生物素的英文名称为biotin，脲基的英文名称为 Ureido0
本发明所采用的目标生物分子包括亲和素，链霉抗生物素蛋白，脱糖亲和素或者上述任何的基因突变体或者上述分子与其他分子，结构或者颗粒的结合体，包覆体等或者含有部分亲和素序列结构的多肽；携带有生物素基团的基因，蛋白质，多肽，细胞，病毒，细菌，真菌等，亲和素的英文名称为avidin，链霉抗生物素蛋白的英文名称为str印tavidin， 脱糖亲和素的英文名称为NeutrAvidin。
本发明所采用的膦盐酸盐分子包括含膦盐酸盐结构的分子或者混合物，膦盐酸盐浓度为ImM到1M，其优选三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
本发明所采用的哌嗪环包括任何含有哌嗪结构的分子或混合物，哌嗪分子浓度为 ImM到1M，哌嗪的英文名称为piperazine，其优选4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
本发明所采用的复配溶液为同时含有膦盐酸盐和哌嗪环两种物质的缓冲溶液，非缓冲溶液，细胞裂解液，血清，血浆，唾液，尿液，组织液，人体分泌物等各种体液。溶液PH为 1-14，膦盐酸盐与哌嗪环两种物质的摩尔比为0. 001 1000。
本发明所采用的基材包括各种无机有机材料以及其上的无机/有机涂层或者溶液相，包括天然和人工合成的高分子基板和高分子涂层，无机基板和无机涂层，金属基板和金属涂层，生物材料基板和生物材料涂层。
本发明提供一种用含有功能性单元的基础生物分子作为固定载体，采用含有一定量膦盐酸盐结构及哌嗪环两种物质的复配溶液作为溶液相，当含有功能性单元的基础生物分子溶解在含有一定量膦盐酸盐及哌嗪环两种物质的复配溶液中时，基础生物分子可以快速的发生相转变而稳定的吸收在各种基材表面，这种吸附非常稳定，可以经受住超声波的清洗剥离过程。吸附后，功能性单元暴露在表面上，用来进一步特异性的吸附目标生物分子，整个过程不需要任何的化学合成反应的参与，从而从根本上解决了化学反应对于基材完整性，均一性的损坏，可以在真正意义上建立一个零背景，高信噪比的生物芯片平台。
本发明的有益效果是可以在极低成本，极短时间内构建真正意义上的零背景干扰，高信噪比的生物芯片平台，达到国际先进水平，填补了国内空白，并与国外同类产品技术在本质上有所不同，具有独创性，并使产品成本较国外同类产品大幅度降低。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明第一个实施例的光学显微镜，扫描电子显微镜以及原子力扫描照片图。
图2是本发明第二个实施例的光学显微镜照片图。
图3是本发明第三个实施例的表面等离子体共振图。
图4是本发明第四个实施例的表面等离子体共振图。
图5是本发明第五个实施例的光学显微镜照片图。
图6是本发明第六个实施例的表面等离子体共振图。
图7是本发明第七个实施例的光学显微镜照片图。
具体实施方式
实施例1
用于固定生物分子的表面为普通玻璃基材，基础生物分子为物种为鸡的溶菌酶，膦盐酸盐与哌嗪环两种物质的复配溶液为含有IOOmM三(2-羧乙基)膦盐酸盐即 tris (2-carboxyethyl) phosphine 的 IOmM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸即 4-(2-hydroxyethyl)-1 -piperazineethanesulfonic acid的缓冲溶液，溶液pH为7. 4。本实施例用显微镜跟踪观察了物种来源为鸡的溶菌酶在含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的4-羟乙基哌嗪乙磺酸的缓冲溶液中的相转变过程。首先将溶菌酶按照ang/ml的浓度溶解在不含有三(2-羧乙基) 膦盐酸盐的纯的IOmM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液(pH 7.4)当中，然后将该溶液与含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐和4-羟乙基哌嗪乙磺酸两种物质的复配溶液等体积混合而得到溶菌酶浓度为lmg/ml，三(2-羧乙基)膦盐酸盐浓度为50mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为 IOmM,pH 7. 4的混合溶液。在不同的时间点下取出适量该混合溶液，滴加到玻璃基材上，静置10分钟，然后用滤纸吸去多余的溶液，并继而用纯的IOmM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液(PH 7.4)洗涤表面3遍，最后用滤纸吸去多余的溶液，将玻璃片放在光学显微镜下观察。 当溶菌酶分子和含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐与4-羟乙基哌嗪乙磺酸两种物质的复配溶液混合后，在1分钟内引发相转变，溶菌酶分子聚集形成球状颗粒(图1G，原子力照片)，继而进一步组装形成纤维状聚集体(图IA-E光学显微镜照片和图IF扫描电子显微镜照片)， 这些聚集体不可逆的稳定的吸附到未经过任何化学和物理活化过程的玻璃基材表面上。
实施例2
所用材料与操作方法除基础生物分子为物种来源为人的溶菌酶外其他条件同实施例1。本实施例用显微镜跟踪观察了物种来源为人的溶菌酶在含有50mM三(2-羧乙基) 膦盐酸盐的IOmM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸的缓冲溶液中的相转变过程。当溶菌酶分子与含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐和4-羟乙基哌嗪乙磺酸两种物质的复配溶液混合后，在1分钟内引发相转变，溶菌酶分子聚集组装形成纤维状聚集体(图IA-C光学显微镜照片)，这些聚集体不可逆的稳定的吸附到未经过任何化学和物理活化过程的玻璃基材表面上。
实施例3
用于固定生物分子的表面为三乙氧基封端的自组装单分子层即trienthylene glycol self-assembling monolayer，基体为涂有50nm金层的玻璃表面，三乙氧基封端的自组装单分子层在金表面自组装形成规整结构并将三乙氧基暴露在表面上，这种分子层为一类经典的阻抗蛋白质非特异性吸附的功能性涂层。包括纤维蛋白原，溶菌酶在内的各种蛋白质都可以无吸附的通过该表面，从而导致零吸附，零污染的背景；基础生物分子为物种为鸡的溶菌酶，对照的基础生物分子为纤维蛋白原即fibronogen，三(2-羧乙基)膦盐酸盐与4-羟乙基哌嗪乙磺酸两种物质的复配溶液为含有50mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐的10mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液，溶液pH为7.4。本实施例采用表面等离子体共振谱(Surface Plasmon Resonance, SPR)验证了溶菌酶在含有三(2_羧乙基)膦盐酸盐的 4-羟乙基哌嗪乙磺酸复配缓冲溶液中的特异性相转变和表面吸附。用注射枪将不同的溶液分别注入表面等离子体共振谱仪中，发现如果只是将溶菌酶或者纤维蛋白原溶于普通的纯的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液，没有任何相转变发生，基材表现出经典的阻止蛋白质吸附的性能。然而如果将溶菌酶溶于含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的4-羟乙基哌嗪乙磺酸复配缓冲溶液中，溶菌酶在三乙氧基封端的自组装单分子层上表现出强的吸附信号。与之相对的是，纤维蛋白原在同样的含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的4-羟乙基哌嗪乙磺酸复配缓冲溶液中依然保持着对三乙氧基封端的自组装单分子层的近乎零的吸附。该结果清楚的表明含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的4-羟乙基哌嗪乙磺酸复配缓冲溶液可以有效的，高度选择性的和稳定地将溶菌酶捕获到表面上来。
实施例4
所用材料与操作方法除三(2-羧乙基)膦盐酸盐浓度降为ImM和对照样品选用含有ImM 二硫苏糖醇(Dithiothreitol，简称DTT)，10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸的溶菌酶缓冲溶液外其他条件同实施例3。本实施例采用表面等离子体共振谱验证了溶菌酶在含有低浓度三(2-羧乙基)膦盐酸盐的4-羟乙基哌嗪乙磺酸复配缓冲溶液中的特异性相转变和表面吸附。如果只是将溶菌酶溶于与三(2-羧乙基)膦盐酸盐具有类似二硫键还原功能的 ImM 二硫苏糖醇和IOmM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸两种物质的复配缓冲溶液，没有任何相转变发生，基材表现出经典的阻止蛋白质吸附的性能。然而如果将溶菌酶溶于含有ImM三(2-羧乙基)膦盐酸盐的IOmM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸复配缓冲溶液中，溶菌酶在三乙氧基封端的自组装单分子层上表现出明显的吸附信号。该结果表明尽管实施例1和2中所用到的相对高的三(2-羧乙基)膦盐酸盐浓度(50mM)对诱导溶菌酶相转变是有效的，本实施例进一步证明除了高浓度，含有低浓度三(2-羧乙基)膦盐酸盐(ImM)的4-羟乙基哌嗪乙磺酸复配缓冲溶液仍然可以有效的，高度选择性的和稳定地将溶菌酶捕获到表面上来。
实施例5
所用材料与操作方法除在复配溶液中额外添加l_200mM葡萄糖即glucose外其他条件同实施例1。本实施例用显微镜跟踪观察了物种来源为鸡的溶菌酶在含有50mM三 O-羧乙基)膦盐酸盐和l_200mM葡萄糖的IOmM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸的缓冲溶液中的相转变过程，室温，正常大气压以及葡萄糖的加入使溶液条件接近于生理溶液条件。当溶菌酶分子与膦盐酸盐，葡萄糖和哌嗪的复配溶液混合后，在1分钟内引发相转变，溶菌酶分子聚集组装形成纤维状聚集体(图IA-C光学显微镜照片)，这些聚集体不可逆的稳定的吸附到未经过任何化学和物理活化过程的玻璃基材表面上。本实施例证明相转变可以稳定的在含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐和4-羟乙基哌嗪乙磺酸的生理溶液中进行。
实施例6
所用材料与操作方法除基础生物分子为携带有生物素的物种为鸡的溶菌酶外其他条件同实施例3。本实施例证明不仅纯的溶菌酶可以在含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的 4-羟乙基哌嗪乙磺酸复配缓冲溶液中吸附到表面上，含有功能性单元生物素的溶菌酶同样具有类似的功能。本实施例中端基与生物素结合的溶菌酶(生物素-溶菌酶，下同)被发现在含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的4-羟乙基哌嗪乙磺酸复配缓冲溶液中具有同样的刺激响应性，可以产生稳定的在三乙氧基封端的自组装单分子层表面的稳定的吸附应答。作为对照实验，如果只用纯的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液而不添加三(2-羧乙基)膦盐酸盐，刺激应答的吸附并不发生。
实施例7
用于固定生物分子的表面为三乙氧基封端的自组装单分子层，基体为涂有50nm 金层的玻璃表面，三乙氧基封端的自组装单分子层在金表面自组装形成规整结构并将三乙氧基暴露在表面上，这种分子层为一类经典的阻抗蛋白质非特异性吸附的功能性涂层；基础生物分子为携带有生物素的物种为鸡的溶菌酶，目标生物分子为携带有荧光素的链霉抗生物素蛋白，膦盐酸盐与哌嗪环两种物质的复配溶液为含有50mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐的IOmM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液，溶液pH为7. 4。本实施例证明了利用含有生物素端基的溶菌酶的刺激吸附应答性可以很方便的制备蛋白质微阵列。具体操作方法为首先将溶菌酶溶液与含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的IOmM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液相混合， 然后用蛋白质点样机将溶液点样到基材表面，形成阵列，然后将形成的阵列用IOmM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液洗涤，并进一步浸泡在含有荧光标记的链霉抗生物素蛋白缓冲溶液中，在37度下浸泡2小时取出并用IOmM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液洗涤，之后放置在荧光显微镜下观察在阵列上的荧光信号。该实施例中第一组实验证明只有将生物素-溶菌酶溶解在含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中，当该溶液与三乙氧基封端的自组装单分子层表面接触后，其相应的配体链霉抗生物素蛋白可以迅速的组装到表面上，其携带的荧光标记可以被荧光显微镜所检测。与之相对的是，如果只用不含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液重复上述试验，其相应的配体链霉抗生物素蛋白不会组装到表面上，在荧光显微镜下没有任何荧光信号被检出。同样的， 如果只用纯的溶菌酶而不与生物素结合，无论是在含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐或者不含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液当中都无法检测到荧光信号， 这说明携带荧光标记的配体链霉抗生物素蛋白在表面的吸附属于与生物素的特异性吸附， 而不是一般性的非特异性吸附。由于没有任何化学反应的干扰，三乙氧基封端的自组装单分子层基材可以保持完美的规整结构，从而可以保持优异的蛋白质吸附阻抗性能。第二组实验就证明了这一点。在第二组实验中，三乙氧基封端的自组装单分子层表面可以直接从含有生物素-溶菌酶的细胞裂解液(cell lysate)中将生物素-溶菌酶捕获下来，捕获下来的生物素-溶菌酶可以识别链霉抗生物素蛋白，从而产生荧光信号。对照实验表明，如果细胞裂解液中不含有生物素-溶菌酶，则该表面无法识别亲和素而产生荧光信号，再次表明链霉抗生物素蛋白在表面的吸附属于与生物素的特异性吸附。在第三组实验中，一系列的含有不同梯度的生物素-溶菌酶浓度的细胞裂解液同时点样在三乙氧基封端的自组装单分子层基材上以检测从细胞裂解液中捕获链霉抗生物素蛋白的灵敏度。结果表明，只需要非常低的生物素-溶菌酶浓度就可以用来捕捉链霉抗生物素蛋白，其所需要的最低的生物素-溶菌酶浓度可低至10pg/ml，相当于在每平方微米上的0. 001个分子。这个值甚至比单分子研究中所用的0. 05个分子每平方微米还要低50倍。这表明，该方法具有超高的灵敏度，极端低的生物素表面密度仍然可以导致有效的链霉抗生物素蛋白识别。这个结果对于制备高灵敏度的酶标板和生物芯片具有重要的基础指导意义。如此高的灵敏度是来源于在无任何化学处理的干扰下，对三乙氧基封端的自组装单分子层基材表面结构的完美保持。
权利要求
1.一种生物芯片制备方法，对各种无机，有机和金属基材，采用含有膦盐酸盐和哌嗪环两种物质的复配溶液，诱导基础生物分子发生相转变而稳定的附着于基材表面上，基础生物分子所携带的功能性单元则进一步暴露在表面上来结合和识别目标生物分子以实现生物芯片，生物分子微阵列制造。
2.根据权利要求1所述的生物芯片制备方法，其特征在于基础生物分子包括天然溶菌酶，人工诱导的突变体，含有溶菌酶部分序列结构的多肽，蛋白质，基因或者他们之间的结合体，溶菌酶序列结构的来源物种是人，鸡，牛，鼠，或者骆驼。
3.根据权利要求2所述的生物芯片制备方法，基础生物分子可以单独使用，或者与别的任何分子或颗粒化学或者物理结合后再使用，与基础生物分子的结合位点可以是羧基端，胺基端，或者是其他任何氨基酸序列处。
4.根据权利要求1所述的生物芯片制备方法，其特征在于目标生物分子为任何基因，蛋白质，多肽，细胞，病毒，细菌，真菌以及与目标生物分子化学或者物理结合的颗粒，包括亲和素，链霉抗生物素蛋白，脱糖亲和素，上述任何的基因突变体或者上述分子与其他分子、结构或者颗粒的结合体，包覆体或者含有部分亲和素序列结构的多肽。
5.根据权利要求1所述的生物芯片制备方法，功能性单元为可以起到识别和结合大分子或者大分子组装体的生物小分子，短肽或者颗粒，包括生物素或含有生物素结构的分子或含有脲基结构的分子或者基团或者多肽。
6.根据权利要求1所述的生物芯片制备方法，膦盐酸盐为任何含有膦盐酸盐结构单元的分子或者混合物，包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
7.根据权利要求1所述的生物芯片制备方法，哌嗪环为任何含有哌嗪结构的分子或混合物，包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
8.根据权利要求1所述的生物芯片制备方法，复配溶液包括缓冲溶液，非缓冲溶液，细胞裂解液，血清，血浆，唾液，尿液，组织液，人体分泌物及各种体液。
9.根据权利要求1所述的生物芯片制备方法，基材为各种无机，有机，金属，生物材料以及其上的无机，有机，金属，生物涂层或者溶液相，包括天然和人工合成的高分子基板和高分子涂层，无机基板和无机涂层，金属基板和金属涂层，生物材料基板和生物材料涂层。
全文摘要
本发明一种生物芯片制备方法涉及利用生物分子在溶液中的相转变来在各种基材表面固定生物分子的方法。对各种无机，有机，金属基材，采用含有膦盐酸盐和哌嗪环两种物质的复配溶液，诱导基础生物分子发生相转变而稳定的附着于基材表面上。基础生物分子所携带的功能性单元则进一步暴露在表面上来结合和识别目标生物分子以实现生物芯片，生物分子微阵列制造。
文档编号C40B40/08GK102505041SQ20111031112
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月8日 优先权日2011年10月8日
发明者杨鹏 申请人:杨鹏