4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子及用其检测细胞表面糖标记的方法
【专利摘要】本发明提供一种4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子及用其检测细胞表面糖标记的方法。本发明提供检测糖代谢标记的方法和提供更为接近天然产物的标签，并在标签不发生化学反应的基础上实现对标签的直接检测。在无需有毒催化剂等的条件下，运用纳米金表面增强拉曼技术实现对特殊拉曼信号标签标记的细胞表面糖检测。
【专利说明】4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子及用其检测细胞表面糖标记的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及化学糖生物学领域，尤其涉及4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子及用其检测细胞表面糖标记的方法。
【背景技术】
[0002]生物正交反应在化学生物学领域有非常广泛的运用，是一种两步化学标记法。在糖生物学领域，第一步，通过有机合成方法在天然单糖分子上修饰生物正交基团(例如:叠氮或端炔，最为常用)，而后通过生物体自身代谢被整合到生物糖链中；第二步，通过上一步的整合后，天然糖链中带有了一个化学报告基团，用一个携带生物正交互补的基团的分子，通过化学反应的方式对目标分子进行检测、成像和分离。虽然这种两步化学标记法在生物分子的检测、成像和分离方面，尤其是生物分子动态变化方面，取得了重要的进展；然而，此方法仍存在一系列的问题需要研究者们解决。一，合成修饰上的正交基团对分子单体本身的理化性质有一定的改变；二，后续的化学反应检测体系的生物相容性问题；三，活体动态标记很受限制。
[0003]针对这些问题，研究者们的解决思路集中在改善化学反应的生物相容性方面；以Ac4ManNAz生物代谢标记为例，其方略为:
[0004]以铜催化叠氮与炔[3+2]环加成反应为例。此反应催化用的的Cu (I)的细胞毒性非常强，研究者们把重心一方面放在开发配体来降低其毒性，并提高反应速率上(以BTTAA最为常用)，另一方面放在活化炔上(以环辛炔及其衍生物最为成功)。配体的方法虽然能够很大程度地加快反应速率，但Cu (I)的毒性只能得到一定程度的降低；而活化炔的方法不使用Cu (I)催化剂，仅通`过环张力和共轭的方式来降低环加成反应的活化能，实现提高反应速率的目的。活化炔的方法最大的缺点就是炔的活化很复杂，合成成本高、吸附背景高、相对于催化反应速率慢、而且生物相溶性问题也未得到很好的解决。
[0005]拉曼(Raman)是一种非化学标记的成像和检测方法,可以对特定的具有Raman信号的基团进行检测和成像。在细胞的Raman成像中，存在一段Raman信号沉默的区域(1800-2800^1),即此区域内没有细胞的任何信号。所以，使用Raman信号在此沉默区域的目标基团作为天然糖衍生物的修饰基团(例如，炔基的Raman信号在2100CHT1左右)进行细胞甚至活体切片的Raman检测和成像。然而，Raman信号相对于荧光信号来说非常弱，其对于细胞膜上富含的磷脂的检测和成像都显得有些困难(需要使用功率较强的激光器)，那么对于细胞膜表面的少量的含Raman信号基团的非天然糖的检测和成像更是不可实现。
[0006]表面增强拉曼(SERS)是Au、Ag等金属表面对于Raman信号的一种增强现象,一般可以实现IO6-1O12的增强效果。这一增强很可能就使得细胞膜表面的少量的含Raman信号基团的非天然糖的检测和成像成为可能。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服现有技术中的上述缺陷，提供4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子及用其检测细胞表面糖标记的方法，在标签不发生化学反应的基础上实现对标签的直接检测。
[0008]具体地，本发明提供一种4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子，其通过下述方法制备:
[0009]I)将HAuCl4 (氯金酸)水溶液加热至回流，在搅拌下加入柠檬酸钠溶液；
[0010]2)室温冷却，获得金纳米粒子晶种；
[0011]3)将获得的金纳米粒子晶种加入超纯水中，在搅拌下加入柠檬酸钠、HAuCl4和盐酸羟胺溶液，室温搅拌，获得金纳米粒子；
[0012]4)向获得的金纳米粒子中加入4-巯基苯硼酸的乙醇溶液，室温搅拌8-24小时，即得所述4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子。
[0013]优选地，步骤I)所述HAuCl4水溶液的质量浓度为0.01%，柠檬酸钠溶液的质量浓度为1%。
[0014]优选地，步骤3)中柠檬酸钠的质量浓度为1%、HAuCl4的质量浓度为1%，的盐酸羟胺溶液的浓度为10mM。
[0015]所述的4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子可以用于检测细胞表面糖标记。
[0016]本发明还提供一种检测细胞表面糖标记的方法，其包含以下步骤:
[0017]I)使用含非天然单糖的培养基培养细胞；
[0018]2)将培养的细胞与权利要求1制备的4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子的溶液共孵育，使4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子结合到细胞表面的唾液酸上；
[0019]3)使用拉曼光谱仪检测细胞膜表面的拉曼标签信号，根据采集的信号判断细胞表面是否存在所述非天然单糖。
[0020]优选地，所述非天然单糖为含叠氮、炔基或氘代甲基的非天然单糖。更优选地，所述非天然单糖为Ac4ManNAz或d3-Ac4ManNAz。
[0021]优选地，所述细胞为HeLa和/或CHO细胞。所述Ac4ManNAz的浓度范围为0.01 μ M至 100 μ Μ。
[0022]更优选地50 μ M的Ac4ManNAl培养CHO细胞时，孵育时间最少为34小时。
[0023]本发明提供4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子及用其检测细胞表面糖标记的方法，检测糖代谢标记，并提供了更为接近天然产物的标签，在标签不发生化学反应的基础上实现对标签的直接检测。在无需有毒催化剂等的条件下，运用纳米金表面增强拉曼技术实现对特殊拉曼信号标签标记的细胞表面糖检测的方法。这种方法在无需有毒催化剂等的条件下，运用纳米金表面增强拉曼技术实现对特殊拉曼信号标签标记的细胞表面糖检测的方法。这种方法实现了高灵敏度的检测。而且该方法适用于各种细胞表面非天然糖的检测。
[0024]为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1是使用纳米金表面增强拉曼技术实现对特殊拉曼信号标签标记的细胞表面糖检测的示意图。[0026]图2是Raman光谱仪的暗场成像，图中的亮点(箭头所示)表示金纳米粒子。
[0027]图3和图4分别是CHO和HeLa细胞中检测细胞膜表面的叠氮和炔基的Raman信号。
[0028]图5和图6分别是CHO和HeLa细胞中检测氘代甲基的Raman信号。
【具体实施方式】
[0029]请参照图1，其是使用纳米金表面增强拉曼技术实现对特殊拉曼信号标签标记的细胞表面糖检测的示意图，非天然的单糖(以式I的Ac4ManNAz为例)被代谢到细胞表面后变为非天然的唾液酸(式II的NeuNAz)，4-巯基苯硼酸(MPBA)修饰的金纳米粒子(AuMPBA)与唾液酸8，9-位上两个羟基反应生成如图所示的产物。通过金纳米粒子(AuNPs)的表面增强拉曼就可以实现对非天然Raman标签的检测。
[0030]
【权利要求】
1.一种4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子，其特征在于，其通过下述方法制备: 1)将HAuCl4水溶液加热至回流，在搅拌下加入柠檬酸钠溶液； 2)室温冷却，获得金纳米粒子晶种； 3)将获得的金纳米粒子晶种加入超纯水中，在搅拌下加入柠檬酸钠、HAuCl4和盐酸羟胺溶液，室温搅拌，获得金纳米粒子； 4)向获得的金纳米粒子中加入4-巯基苯硼酸的乙醇溶液，室温搅拌8-24小时，即得所述4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子，其特征在于，步骤I)所述HAuCl4水溶液的质量浓度为0.01%，柠檬酸钠溶液的质量浓度为1%。
3.根据权利要求1所述的4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子，其特征在于，步骤3)中柠檬酸钠的质量浓度为1%、HAuCl4的质量浓度为1%，的盐酸羟胺溶液的浓度为10mM。
4.权利要求1所述的4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子在检测细胞表面糖标记中的应用。
5.一种检测细胞表面糖标记的方法，其特征在于，包含以下步骤: O使用含非天然单糖的培养基培养细胞； 2)将培养的细胞与权利要求1制备的4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子的溶液共孵育，使4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子结合到细胞表面的唾液酸上； 3)使用拉曼光谱仪检测细胞膜表面的拉曼标签信号，根据采集的信号判断细胞表面是否存在所述非天然单糖。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述非天然单糖为含叠氮、炔基或氘代甲基的非天然单糖。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述非天然单糖为Ac4ManNAz或d3-Ac4ManNAz。
8.根据权利要求5至7任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为HeLa和/或CHO细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述Ac4ManNAz的浓度范围为0.01 μ M至100 μ Μ。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，50μ M的Ac4ManNAl培养CHO细胞时，孵育时间最少为34小时。
【文档编号】B22F9/24GK103674925SQ201210342478
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月14日 优先权日:2012年9月14日
【发明者】陈兴, 田中群, 田向东, 林亮, 洪森炼 申请人:北京大学