单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用。该构建方法包括以下步骤：从单细胞中制备cDNA样品；对cDNA样品进行片段化文库构建，得到单细胞的转录组测序文库；其中，片段化文库构建步骤中采用物理破碎的方式对cDNA样品进行片段化，且对片段化的cDNA样品无需进行纯化的步骤。本发明通过采用物理破碎的方式对单细胞样品进行片段化，使破碎片段较小且相对均匀，进而使得所构建的单细胞转录组测序文库的峰宽较为集中；且片段化后的样品不经纯化步骤减少了样品损失不仅能够实现微量样品的单细胞转录组测序文库的构建，而且还能增加数据量产出的稳定性，从而提高了大规模单细胞转录组文库高通量测序的可靠性。
【专利说明】单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及高通量测序【技术领域】，具体而言，涉及一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用。
【背景技术】
[0002]随着现代生物学的发展，细胞群体的研究已不再能满足科研的需求，单细胞研究不仅能解决组织细胞所不能解决的细胞异质性问题，而且还为解析单细胞的行为、机制以及与机体的关系提供了新的研究方向。目前，将高通量测序运用于单细胞研究的单细胞测序成为时下单细胞研究的一种新途径，主要包括单细胞全基因组测序及单细胞转录组测序。
[0003]对于单细胞转录组测序来说，转录组测序文库的构建是主要的难点，因为单细胞中mRNA含量低至10pg，无法通过常规的RNA转录组文库的构建方法来构建。因此，目前市场上能够利用如此少量的mRNA进行单细胞转录组测序文库构建的产品只有Illumina公司的 DNA 文库构建试剂盒(iIlumina Nextera XT DNA sample preparat1n kit)。
[0004]Illumina公司的该试剂盒是采用化学方法对样品进行片段化，即用转座酶对cDNA进行打断的方式建库。其具体流程图1所示，单细胞经裂解后，mRNA经反转录得到cDNA，然后对cDNA进行预扩增后，采用转座酶打断的方式对cDNA进行片段化处理。于此同时，转座酶在打断后同时会在破碎片段的两端加上接头，然后再经PCR对片段进行富集，该步骤中PCR的引物会在破碎片段的两端带上标签序列(index)，加标签序列的目的是给不同的样品带上不同的标签，以便从得到的混合测序数据中分离出各样品所对应的测序数据。
[0005]Illumina公司的上述DNA文库构建试剂盒具有能从低至Ing的样品起始量进行文库构建的巨大优势，但也存在文库上机定量的不准，数据量产出不稳定的问题。因为如果是数据产出过量，浪费成本；如果产量不足，还需要后期额外加测，耽误项目周期。
[0006]因此，仍需要对现有的单细胞转录组测序文库构建方法进行改进，以使所构建的转录组测序文库能够满足数据量产出稳定的要求。
【发明内容】
[0007]本发明旨在提供一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用，以提高文库的数据量的产出稳定性。
[0008]为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种单细胞的转录组测序文库的构建方法，该构建方法包括以下步骤:从单细胞中制备cDNA样品；对cDNA样品进行片段化文库构建，得到单细胞的转录组测序文库；其中，片段化文库构建步骤中采用物理破碎的方式对cDNA样品进行片段化，且对片段化的产物无需进行纯化的步骤。
[0009]进一步地，上述对cDNA样品进行片段化文库构建的步骤包括:步骤SI，对cDNA样品采用物理破碎的方式进行片段化，得到片段化样品；步骤S2，对片段化样品不经过纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，得到修复后样品；步骤S3，对修复后样品进行接头连接，得到带接头样品；步骤S4，对带接头样品进行扩增，得到单细胞的转录组测序文库。
[0010]进一步地，上述物理破碎的方式为采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA样品进行片段化；优选自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA样品进行片段化时的参数设置为:循环数8%~12%，峰值入射功率170~180瓦；循环数/爆发200~220个；时间300~360s ;温度4~8°C。
[0011]进一步地，自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA样品进行片段化后得到的片段化样品的长度为150~200bp。
[0012]进一步地，在得到片段化样品之后，以及对片段化样品进行末端修复的步骤之前，还包括对片段化样品进行浓缩的步骤；优选采用Thermo Scientific公司的ThermoScientific DNA SpeedlllV 离心浓缩系统。
[0013]进一步地，在所述步骤S2中采用NEB公司的末端修复酶试剂组合对所述片段化样品不经纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所述末端修复酶试剂组合包括10 X的NEBNext末端修复反应缓冲液和NEBNext末端制备酶混合物；在所述步骤S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端连接酶混合物和NEBNext接头对所述修复后样品进行接头连接；在所述步骤S4中采用KAPA B1公司的2 X的KaPA HiFi反应混合物对所述接头样品进行扩增。
[0014]进一步地，当片段化样品的量低至3ng时，在步骤S3中，对接头进行稀释后再进行接头连接；优选将接头稀释至1.0~2.0 μ M ;更优选稀释至1.5 μ Μ。 [0015]进一步地，在步骤S4中，扩增采用其中一条上带有标签序列的扩增引物进行扩增，优选标签序列为扩增引物上的一段6~10个按特定顺序排列的碱基序列；更优选扩增引物的序列为带有标签序列的SEQ ID N0.1:
[0016]5，-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’和不带有标签序列的SEQ ID N0.2:
[0017]5，-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3，。
[0018]进一步地，在步骤S4中，扩增的循环次数为10~15次，优选13次。
[0019]根据本发明的另一方面，提供了一种上述任一种构建方法在研究细胞异质性方面的应用。
[0020]应用本发明的技术方案，通过采用物理破碎的方式对单细胞样品进行片段化，使破碎片段大小较小且相对均匀，使得所构建的单细胞转录组测序文库的峰宽较为集中；且片段化后的样品不经过纯化步骤减少了样品的损失使得本发明的构建方法不仅能够实现微量样品的单细胞转录组测序文库的构建，而且还能增加数据量产出的稳定性，从而提高了大规模单细胞转录组文库高通量测序的可靠性。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
[0022]图1示出了现有技术的单细胞转录组测序文库的构建流程；[0023]图2示出了采用现有技术所构建的单细胞转录组测序文库的插入片段大小及峰宽；
[0024]图3示出了本发明的实施例中所采用的单细胞转录组测序文库的构建流程；
[0025]图4示出了本发明的实施例中单细胞的RNA样品经反转录后得到的全长cDNA的大小；
[0026]图5示出了本发明的实施例中所构建的猪卵细胞转录组测序文库的插入片段大小及峰宽；
[0027]图6示出了本发明的实施例中所构建的猪卵细胞转录组测序文库中碱基含量及碱基分布情况；以及
[0028]图7示出了本发明的实施例中所构建的猪卵细胞转录组测序文库上机测序后实际所得的片段化样品的大小分布。
【具体实施方式】
[0029]需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0030]在本发明中的术语“单细胞”是指单一类型细胞的单个细胞；“微量样品”是指起始量在3~20ng的cDNA样品。
[0031]正如背景技 术部分提到的，Illumina公司的DNA文库构建试剂盒中所提供的文库构建方法是采用转座酶随机打断的方式进行片段化，且片段化和连接头在同一步骤中完成，减少了单独片段化和加接头步步骤后对各自产物进行纯化的步骤，有效降低了样品的损失，具有起始样品量低(通常为2~15ng，最低可达Ing)的极大优势而倍受推崇。然而，本发明的发明人通过对上述试剂盒的使用和研究发现，采用上述试剂盒所构建的测序文库存在插入峰很宽的问题,大约在300bp~100bp之间，如图2所示。文库峰宽的宽窄会对上机定量的准确性产生影响，进而影响上机量和产出。文库峰宽越宽，定量的偏差就越大，在上机成簇过程中扩增效果会受到影响，优先扩增小片段，使得小片段过量扩增而相对较大的片段扩增量相对较少。因此，导致数据产出偏差较大，稳定性差。
[0032]为了改善上述缺陷，本发明的发明人对单细胞测序文库构建方法进行了大量的研究和实验，提出了一种单细胞转录组测序文库的构建方法，该构建方法包括以下步骤:从单细胞中制备cDNA样品；对cDNA样品进行片段化文库构建，得到单细胞的测序文库；其中，片段化文库构建步骤中采用物理破碎的方式对cDNA样品进行片段化，且对片段化的cDNA样品无需进行纯化的步骤。
[0033]本发明的上述构建方法，通过采用物理破碎的方式对单细胞的cDNA样品进行片段化，使破碎片段大小较小，使得所构建的单细胞转录组测序文库的峰宽较为集中，且对片段化的样品不经纯化进行文库构建，减少了样品损失，不仅能够实现微量样品的单细胞转录组测序文库的构建，而且还能提高文库上机定量的准确性，使得下机数据量产出稳定，从而提高了大规模单细胞转录组文库高通量测序的可靠性。
[0034]在本发明的构建方法的cDNA样品，是在单细胞样品裂解后，直接将细胞中的mRNA反转录成双链cDNA。反转录的步骤通常包括:由细胞样品进行反转录，得到第一链cDNA ;对第一链cDNA进行扩增，得到双链的cDNA。[0035]对上述得到的第一链cDNA和双链cDNA最好都经过纯化的步骤，纯化的步骤能够使得样品的纯度更高，提高后续构建所得到文库的质量。该步骤中可以采用市售的纯化试剂盒进行相应的纯化步骤，在本发明中，优选使用Clontech公司的APRI Ampure XP磁珠进行纯化，该纯化方法纯化效率高，纯化速度快，且操作更方便。
[0036]在本发明的一种优选的实施例中，对cDNA样品进行片段化文库构建的步骤包括:步骤SI，对DNA样品或cDNA样品采用物理破碎的方式进行片段化，得到片段化样品；步骤S2，对片段化样品不经过纯化直接进行末端修复和添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，得到修复后样品；步骤S3，对修复后样品进行接头连接，得到带接头样品；步骤S4，对带接头样品进行扩增，得到单细胞转录组的测序文库。
[0037]在上述实施例中，采用物理破碎的方式进行片段化，相比化学破碎的方式(转座酶随机打断的方式)，物理破碎的方式对单细胞样品进行片段化具有使破碎得到的片段大小的较小，且能使破碎片段大小较为集中，片段大小相对均匀，使得后续对文库定量检测的准确度大大提高，进而使得上机扩增成簇步骤中各插入片段的扩增效率相对均等，减少了偏差扩增现象，使数据量产出更稳定，进而避免因为数据量产出不足需要额外加测而耽误项目周期或者数据量产出过多浪费成本。且对上述片段化样品不经过纯化直接进行后续步骤，能减少样品损失，使本发明的上述构建方法能够适用于单细胞转录组的文库构建。
[0038]对样品进行物理破碎的方式通常米用超声破碎，适用于本发明的超声破碎仪包括DNA切割超声破碎仪Q800R或自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220。物理破碎方式具有重复性好，得到的片段较小，使所构建的文库的峰宽较窄的优点。在本发明一种优选的实施例中，采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对样品进行片段化。更优选自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对样品进行片段化时的参数设置为:循环数8~12%，峰值入射功率170~180瓦；循环数/爆发200~220个；时间300~360s ;温度4~8°C。
[0039]在上述自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA样品进行片段化的步骤中，得到的片段化样品的长度为150~200bp。发明人通过大量的实验发现，当设置CovarisS220的参数在上述范围内时，通常可得到长度为150~200bp的片段化样品，这使得所构建的转录组测序文库的峰宽集中在270~320bp，提高文库定量的准确性，从而提高了产出数据量的稳定性。
[0040]在上述采用物理破碎方式得到片段化样品后，通常还需要经过磁珠纯化或过吸附柱纯化的方法对片段化的样品进行纯化浓缩。但在本发明中，当片段化样品的体积大于末端修复酶反应体系所要求的最小体积时，在进行末端修复的步骤之前，还包括对片段化样品进行浓缩的步骤。此处的浓缩不是用磁珠纯化或者过柱子的浓缩方法，而是采用浓缩仪浓缩的方法，能够更大程度地既避免片段化的样品损失。在本发明一种优选的实施例中，采用Thermo Scientific公司的Thermo Scientific DNA SpeedlllV离心浓缩系统。通过浓缩步骤使片段化样品的浓度得到相对提高，并且符合文库构建试剂盒的体系要求。当片段化样品的体积小于反应体系所需的最小体积时，可通过加高纯水稀释至所需的最小体积。
[0041]在上述所说的文库构建中，在上述步骤S2中采用NEB公司的末端修复酶试剂组合，其末端修复酶试剂组合包括1X的NEBNext末端修复反应缓冲液(1XNEBNext EndRepair React1n Buffer)和 NEBNext 末端制备酶混合物(NEBNext End Prep Enzyme Mix)；经发明人的大量实验验证，上述末端修复酶试剂组合在一步反应中完成修复与加A的步骤，方便快捷，减少出错几率。在上述步骤S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端连接酶混合物(Blunt/TA Ligase Master Mix)和NEBNext接头进行接头连接的步骤,该连接酶混合物对接头的连接效率较高，利于增加最终的文库产量。在步骤S4中采用2XΚΑΡΑ.B1公司的KaPA HiFi反应混合物进行扩增，采用这种聚合酶扩增稳定性好，保真性更高，且对于高GC含量模板的扩增一样有效。上述各步骤中所用到的试剂并不仅限于上述几种，只要能够达与上述几种效果相当或更好的市售试剂或自配制试剂同样适用于本发明。
[0042]在上述转录组测序文库构建的过程中，根据所得到片段化样品的总量适当调整接头的用量。根据发明人大量实验所得的经验，当片段化样品的量在低至3ng时，在进行接头连接的步骤中，先对接头进行稀释至1.0~2.0 μ M ;优选稀释至1.5 μ M后再进行接头连接。将上述接头浓度稀释至上述浓度范围时，既能与建库起始量低相匹配，又能减少接头使用量，还可以避免接头污染。这样，本发明的这种方法也能够由相对较低的起始量实现单细胞转录组测序文库的构建。
[0043]在本发明的上述构建方法的扩增步骤中，扩增引物采用发明人自己设计的单端带有标签序列的扩增引物进行扩增。单端带有标签序列的扩增引物是指两条扩增引物中的其中一条上带有标签序列。自己设计可以根据所欲混合测序的样品数量的多少，设计6~10个按特定顺序排列的碱基序列作为标签序列。利用发明人自己合成的单端带有标签序的引物序列，这使得本发明所构建的转录组测序文库能够与其他单端带有标签序列的文库样品进行混合测序，提高通道(lane)及测序仪的有效利用率，减少资源的浪费。
[0044]在本发明一种优选的实施例中，扩增引物序列采用带有标签序列的SEQ ID N0.1:
[0045]5， -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’和不带有标签序列的SEQ ID N0.2:
[0046]5，-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3，。本发明的上述带有标签序列的引物中的标签序列为CGTGAT。
[0047]由于Illumina公司的DNA文库构建试剂盒采用双标签序列(index),当有多个样品需要上机时，无法与其他样品混合在一个通道(lane)中进行测序，而需要单独占用一个通道来进行测序，这样造成测序仪器空间的浪费和测序成本的增高。而本发明通过使用单端带有标签序列的引物进行扩增，使得所构建的文库能够与其他具有单端标签序列的样品的文库进行混合测序，从而减少资源浪费，降低成本。
[0048]在本发明的上述扩增步骤中，一般扩增循环次数为10次，在此基础上，在不同的样品测序文库的实际构建过程中，可根据片段化样品的起始量的多少对循环次数进行调整。在本发明中优选上述扩增循环次数为10~15次，更优选13次。将扩增次数控制在上述范围内，既能实现对片段化样品的有效扩增，使其满足上机测序浓度的要求；又不至于造成片段化样品的过度扩增，造成非特异性扩增从而减少测序数据的实际有效量。
[0049]由于本发明的上述构建方法能够有效提高单细胞转录组测序文库的测序质量，提高所测数据的有效量，这为单细胞生物学的研究提供了一种新的研究手段。因此，本发明的上述单细胞转录组测 序文库的构建方法能够应用于细胞异质性的研究。
[0050]下面将结合实施例来进一步说明本发明的有益效果。
[0051]下列实施例是参照附图3，以猪卵细胞样品进行详细说明本发明的构建方法。下列实施例中所涉及的方法如无特别说明均为常规方法，前期反转和预扩增所用的试剂来自Clontech公司；2XKaPA HiFi反应混合物(Master Mix)购自美国ΚΑΡΑ.B1公司；其他试剂如无特别说明均为NEB公司的产品；所有水为超纯水。
[0052]实验一、第一链cDNA的合成(在洁净工作室)
[0053]I)配制细胞裂解液:裂解液(Triton-Χ-ΙΟΟ溶液)19 μ L
[0054]RNA酶抑制剂I μ L
[0055]总体积20 μ L。
[0056]2)单细胞样品制备:取I μ L含单个猪卵细胞的培养基转移至含有2.5 μ L细胞裂解液的无RNA酶的200 μ L PCR管中，然后立即置于干冰上。
[0057]3)将单细胞样品放置在经-20°C预冷的PCR管架上，向其中加入3’SMART⑶S引物II A (12 μ M) I μ I。混匀各组份，然后瞬时离心，将反应管放在PCR仪中，72°C，孵育3min。然后将反应管放回预冷的PCR架中。
[0058]与此同时，在室温中混匀以下试剂:
[0059]
【权利要求】
1.一种单细胞的转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤: 从单细胞中制备CDNA样品； 对所述cDNA样品进行片段化文库构建，得到所述单细胞的转录组测序文库； 其中，所述片段化文库构建步骤中采用物理破碎的方式对所述cDNA样品进行片段化，且对片段化的产物无需进行纯化的步骤。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，对所述cDNA样品进行片段化文库构建的步骤包括: 步骤SI，对所述cDNA样品采用物理破碎的方式进行片段化，得到片段化样品； 步骤S2，对所述片段化样品不经过纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，得到修复后样品； 步骤S3，对所述修复后样品进行接头连接，得到带接头样品； 步骤S4，对所述带 接头样品进行扩增，得到所述单细胞的转录组测序文库。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述物理破碎的方式为采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对所述cDNA样品进行片段化；优选所述自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对所述cDNA样品进行片段化时的参数设置为:循环数8%~12%，峰值入射功率170~180瓦；循环数/爆发200~220个；时间300~360s ;温度4~8V。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对所述cDNA样品进行片段化后得到的所述片段化样品的长度为150~200bp。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在得到所述片段化样品之后，以及对所述片段化样品进行所述末端修复的步骤之前，还包括对所述片段化样品进行浓缩的步骤；优选米用 Thermo Scientific 公司的 Thermo Scientific DNA SpeedlllV 离心浓缩系统。
6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于， 在所述步骤S2中采用NEB公司的末端修复酶试剂组合对所述片段化样品不经纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所述末端修复酶试剂组合包括1X的NEBNext末端修复反应缓冲液和NEBNext末端制备酶混合物； 在所述步骤S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端连接酶混合物和NEBNext接头对所述修复后样品进行接头连接； 在所述步骤S4中采用KAPA B1公司的2X的KaPA HiFi反应混合物对所述接头样品进行扩增。
7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，当所述片段化样品的量低至3ng时，在所述步骤S3中，对所述接头进行稀释后再进行接头连接；优选将所述接头稀释至1.0~2.0 μ M ;更优选稀释至1.5 μ Mo
8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S4中，所述扩增采用其中一条上带有标签序列的扩增引物进行扩增，优选所述标签序列为所述扩增引物上的一段6~10个按特定顺序排列的碱基序列；更优选所述扩增引物的序列为带有标签序列的SEQID N0.1:5’ -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCCGATCT-3 ’ 和不带有标签序列的SEQ ID N0.2:
5’ -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT CT-3’。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S4中，所述扩增的循环次数为10~15次，优选13次。
10.权利要求1 至9中任一项所述的构建方法在研究细胞异质性方面的应用。
【文档编号】C40B50/06GK104032377SQ201410308023
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】王大伟, 王苗英, 王棪, 曹志生, 刘运超, 朱海浩 申请人:北京诺禾致源生物信息科技有限公司