一种四硫化三钼包覆金纳米棒的制备方法及应用与流程

本发明属于化学生物传感以及生物检测技术领域，具体涉及一种基于四硫化三钼包覆金纳米棒的制备方法及应用。

背景技术：

酶对生命活动是不可或缺的，人体的许多反应都需要酶的催化进行，它可以降低化学反应活化能，加快化学反应速率，控制化学反应程度等。天然酶是一种由生物体内生产，并且具有高效性、专一性、多样性、能与底物产生特异性反应等性质的蛋白质、核酸或其复合体，在食品、工农业、医药诸多领域应用广泛。但是，天然酶也存在很多不足之处。例如外在环境条件(强酸、强碱，高温)对催化活性的敏感性影响、稳定性差、易变性失活、难提纯，不易储存且价格昂贵等问题。因此，发现和制备具有低成本高效益的酶需要科研工作者进行深入的研究。与此同时，模拟酶应运而生。模拟酶是一类人工合成的非蛋白质分子，具有结构简单、化学性质稳定、价廉易得等特点。

纳米模拟酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶。纳米模拟酶本身是一种纳米材料，如比表面高，具有特殊的光、电、磁等物理化学性质。正是这些独特的性质，纳米材料模拟酶在生物传感、生物医学与成像方面等领域表现出得天独厚的优势。金纳米棒是一种尺度从几纳米到上百纳米的棒状金纳米颗粒，金纳米棒的表面等离子体共振波长可随其长宽比变化，从550nm到1550nm连续可调。由金纳米棒与硫代硫酸钠和五氯化钼制备的四硫化三钼包覆金纳米棒保留了金纳米棒化学和物理特性的同时也具备了过氧化物酶性质。利用四硫化三钼包覆金纳米棒的过氧化物模拟酶性质和抗原抗体特异性反应，可用于检测玉米赤霉烯酮、肠毒素、呕吐霉素等，为食品安全做出贡献。

玉米赤霉烯酮(zearalenone)又称f-2毒素，主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物，是玉米赤霉菌的代谢产物。

玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，主要作用于生殖系统，可使家畜，家禽和实验小鼠产生雌激素亢进症。妊娠期的动物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮的食物会引起流产、死胎和畸胎。食用含赤霉病麦面粉制作的面食也可引起中枢神经系统的中毒症状，如恶心、发冷、头痛、神智抑郁和共济失调等。这些物质一旦进入人体，会使人中毒且目前对动物玉米赤霉烯酮中毒尚无特效药治疗。食物中毒是一个全球性公共卫生问题，无论是过去还是现在，在发达的工业化国家和发展中国家，食物中毒都常有发生。我国每年发生的此类中毒事件也非常多，全国各地均有报告，是疾病预防控制部门重点监测的疾病。大量的事实表明，食品安全问题严重影响人们的生活，急需建立一种针对玉米赤霉烯酮的超高灵敏度快速分析方法。

研究表明四硫化三钼包覆金纳米棒具有一定的催化能力，在四硫化三钼包覆金纳米棒存在下，h2o2被快速催化分解，双氧水被催化分解产生羟基自由基，羟基自由基氧化tmb，不同浓度的氧化态tmb呈现不同的颜色。基于此，我们建立一种双模检测的新方法，既可利用颜色变化对待测物进行可视化半定量检测，又可以通过吸光度的大小对待测物的准确含量进行定量检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种四硫化三钼包覆金纳米棒模拟酶的制备方法及应用，制备简单，操作方便，适应普及。

本发明的目的是通过下述方式实现的：

一种四硫化三钼包覆金纳米棒模拟酶的制备方法，其特征在于，金纳米棒与硫代硫酸钠溶液、五氯化钼溶液反应4～8小时，得到具有过氧化物模拟酶活性的四硫化三钼包覆金纳米棒。

进一步地，金纳米棒的制备方法为：向锥形瓶中加入ctab溶液，在搅拌条件下先加入agno3溶液，再加入haucl4溶液，继续搅拌2～5分钟，然后逐滴加入抗坏血酸直至溶液褪色，ctab溶液、agno3溶液、haucl4及抗坏血酸的物质的量之比为260-320：0.7-0.9：2.5-3.5：0.2-0.4，静置2～3小时即得金纳米棒。

进一步地，ctab溶液的浓度为0.1～0.2mol/l，agno3溶液的浓度为0.008～0.014mol/l，haucl4溶液的浓度为0.015～0.025mol/l，抗坏血酸的浓度为0.008～0.012mol/l。

进一步地，金纳米棒、硫代硫酸钠溶液和五氯化钼溶液依次加入，三者的体积比为4～6：0.01～0.03：0.03～0.05，硫代硫酸钠溶液的浓度为0.08～0.12mol/l，五氯化钼溶液的浓度为0.08～0.12mol/l，值得说明的是，在硫代硫酸钠与五氯化钼满足计量关系为1:1的基础上加入的五氯化钼量越多即五氯化钼过量越多，四硫化三钼包覆层越厚。

上述制备方法得到的四硫化三钼包覆金纳米棒模拟酶应用于检测真菌毒素玉米赤霉烯酮的含量。

进一步地，应用具体为：先将四硫化三钼包覆金纳米棒通过金硫键与带有巯基的玉米赤霉烯酮dna适配体即zen-aptamer相连接，然后依据zen-aptamer与玉米赤霉烯酮的特异性结合，向连接了zen-aptamer的四硫化三钼包覆金纳米棒中加入玉米赤霉烯酮，反应15～30分钟，再向体系中加入双氧水、3,3',5,5'-四甲基联苯胺即tmb溶液，根据玉米赤霉烯酮的浓度不同，覆盖金棒-四硫化三钼的面积不一样，导致生成氧化态的tmb(ox-tmb)呈现的颜色不同，再根据ox-tmb在波长652nm处的吸光度值与玉米赤霉烯酮浓度的关系，从而计算得到待测样品中玉米赤霉烯酮的含量。

进一步地，zen-aptamer碱基序列为：

5’-ggaattcttgatgttgcctgggattgtttgggccttgtgttttcttccgttccaacttagtaggatcccgaa-3’。

进一步地，zen-aptamer与四硫化三钼包覆金纳米棒以4.9～5.2：4的体积比加入，反应8～12小时，采用转速为10000～12000r/min离心8～15min所得。

进一步地，tmb显色步骤中，加入的双氧水浓度为80～120mmol/l，tmb浓度为3～7mmol/l，两种溶液的体积比为1：1。

本发明的有益效果在于：

本发明利用四硫化三钼包覆金纳米棒催化分解双氧水的特性，再依据抗原与抗体的特异性结合，将玉米赤霉烯酮与修饰了四硫化三钼包覆金纳米棒的玉米赤霉烯酮适配体特异性作用，进而达到检测玉米赤霉烯酮的目的；本发明采用四硫化三钼包覆金纳米棒检测玉米赤霉烯酮，灵敏度高，现象明显，操作简便，能有效准确地测定作物中玉米赤霉烯酮的浓度。

本发明检测玉米赤霉烯酮为高灵敏度技术，它能快速准确地玉米赤霉烯酮，使四硫化三钼包覆金纳米棒成功取代传统的酶联免疫吸附反应中的生物酶。金纳米棒，在价格、稳定性等方面具有生物酶大分子无可比拟的优点，更重要的是，四硫化三钼金纳米棒不存在生物蛋白酶容易失去生物活性的问题。另一方面，引入tmb不同状态下表现出不同颜色，建立可视化检测，此外，金纳米粒子的高消光系数为这种检测方法提供了极高的检测灵敏度，与传统的酶联吸附方法相比，显著提高了检测的灵敏度以及稳定性。

通过本发明的方法处理，能得到不同颜色的tmb溶液，这种纳米颗粒的颜色变化可根据双氧水的浓度进行调控，通过颜色或吸光度值的变化达到了对玉米赤霉烯酮的超痕量检测，与现有技术相比，本发明方法简单，成本低，灵敏度高，能够实现快速准确的检测，并且对于其它生物大分子以及疾病的检测都具有十分重要的参比价值，具有很广阔的应用前景。

附图说明

图1为金纳米棒及四硫化三钼包覆金纳米棒的tem图，其中，a为金纳米棒，b为四硫化三钼包覆金纳米棒。

图2为金纳米棒、四硫化三钼包覆金纳米棒的紫外可见吸收光谱图。

图3为四硫化三钼包覆金纳米棒的xrd图。

图4为验证四硫化三钼包覆金纳米棒具有过氧化物模拟酶性质的显色图片。

图5为在不同ph条件下，四硫化三钼包覆金纳米棒催化双氧水产生羟基自由基使tmb被氧化变蓝，ox-tmb在652nm处的吸光度折线图。

图6为本发明实施例对玉米赤霉烯酮标准溶液的检测时的颜色变化图。

图7为玉米赤霉烯酮浓度与tmb在652nm处吸光度的线性方程。

图8为合成样品显色图。

具体实施方式

以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例1

四硫化三钼包覆金纳米棒的制备

取5ml金纳米棒，先加入0.1mmol/lna2s2o320μl，再加入0.1mmol/lmocl540μl，反应6小时，采用转速为10000r/min离心10min，用二次水分散，即得四硫化三钼包覆金纳米棒，其形态如图1所示，完整地保留了金纳米棒的形态且在金棒表面形成了一层壳状结构，且该复合物的纵向等离子体吸收峰相比金纳米棒的纵向等离子体吸收峰蓝移，如图2所示，这是因为四硫化三钼与金棒作用使金棒表面的折射率发生了改变，结合图3的粉末晶体衍射结果，表明四硫化三钼是以晶体形式包覆在金纳米棒表面。图4所示表明四硫化三钼包覆金纳米棒能催化双氧水氧化tmb变蓝，即证四硫化三钼包覆金纳米棒具有过氧化物模拟酶性质，并且在ph＝6条件下催化性最强，如图5所示。

实施例2

四硫化三钼包覆金纳米棒过氧化物模拟酶性质用于玉米赤霉烯酮的检测：

首先在离心管中加入300μl四硫化三钼包覆金纳米棒，再加入500μl1.0×10^-13μmol/l玉米赤霉烯酮的dna适配体zen-aptamer，接上zen-aptamer后，用0.01mol/l的pbs冲洗三次，再加入不同浓度玉米赤霉烯酮溶液，反应20分钟，用二次蒸馏水冲洗三次后，加入浓度为50mmol/l的双氧水溶液反应30分钟，再加入浓度为5mmol/l的tmb溶液。30分钟后，其颜色变化如图6所示，图中从左向右依次为加了0、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2mmol/l的玉米赤霉烯酮，由图可知，玉米赤霉烯酮浓度越高，tmb显色越浅。根据显色的氧化态tmb在652nm处的吸光度与玉米赤霉烯酮浓度之间的关系可获得线性关系很好的标准曲线，如图7所示，根据线性方程可计算出未知样品中玉米赤霉烯酮的含量。

上述碱基序列为zen-aptamer

5’-ggaattcttgatgttgcctgggattgtttgggccttgtgttttcttccgttccaacttagtaggatcccgaa-3’。

样品处理及回收率测定

称取从超市购买的玉米1.0g、大米0.5g，分别置于离心管中，分别加入4ml10ng/ml、5ng/ml玉米赤霉烯酮溶液，混合3小时再超声20分钟，离心，取上清液。

在12支离心管中，各加入与zen-aptamer作用好的四硫化三钼包覆金纳米棒，向其中6支离心管中分别加入500μl经玉米和大米处理过的玉米赤霉烯酮溶液，玉米和大米每种各为一组，共两组，每组3支，反应30分钟后，剩下的6支离心管中再分别加入500μl10ng/ml、500μl5ng/ml玉米赤霉烯酮标准溶液，反应30分钟。最后，将这18支离心管分别加入100μl50mmol/lh2o2与100μl5mmol/ltmb，20分钟后tmb显色基本稳定，如图8所示，测其在652nm处的吸光度，根据标准曲线，即可求得对应玉米赤霉烯酮浓度。通过计算，玉米、大米的回收率分别是101.2％、99.21％，表明这种检测方法系统误差小、准确度高。