本发明属于农业微生物
技术领域：
。更具体地，本发明涉及一种土壤生物修复剂。
背景技术：
：土壤是农业生产中物质转化与能量交换的重要载体和场所，也是生态系统的核心部分，在各种环境要素中，土壤又是污染物的最终受体。随着石油制品和化学农药在农田上的广泛应用，遗留在土壤中的石油污染物及农药残留物由于其难以根除而成为亟待解决的问题。石油农业造成的生态环境恶化、土壤盐碱化板结、病虫害泛滥、白色污染严重、农产品质量下降等一系列突出问题对农业可持续发展的威胁越来越大。随着科技发展，我国农业现代化的推进，耕地土壤质量下降越发明显，范围越来越广，其程度越来越严重，农业可持续发展面临严重威胁。一方面土壤养分失衡、结构破坏、土壤板结。另一方面因土壤污染具有隐蔽性、滞后性等特征，不仅降低了土壤资源质量，而且使农业遭受损失，残留农药进入水体和食物链，造成食品安全隐患，威胁到人们的身体健康。2013年5月份爆出的山东潍坊农民滥用神农丹生产毒姜的事件就是典型案例。我国农业未来发展中面临着既要保持高产，又必须减少资源污染的双重压力。迫切需要可行的技术方案降解农业生产中化肥和农药污染残留，提高土壤使用效率，保障土壤健康，构建支撑农业可持续发展的物质基础。因此，人们对土壤问题进行大量的研究，取得一些重要成果。例如CN105950159A公开一种功能化土壤调理剂及制备方法，该方法实现了板结土壤、盐碱地土壤、重金属污染土壤的调理。CN106047352A公开一种含保水剂的土壤调理剂对轻度盐碱地进行原土绿化的方法。CN104817385A公开一种园林废弃物生物质炭基土壤调理剂及制备方法，它具有营养元素释放协调持久、肥料养分利用率高，有效地改良和培肥土壤，增加有机质，提高土壤保水保肥能力，改善作物品质，提高作物产量。制约土壤改良和修复技术产品行业的技术瓶颈主要有两个方面，一是农业生态环境被破坏，部分土壤中微生物失衡，自我修复能力下降，土壤改良和修复有益微生物的应用技术远远无法满足由于土壤微生态破坏而造成的不利影响，而且多数土壤改良和修复的微生物应用技术仍处于研究阶段，形成有效产品少；二是因施肥技术与肥料品种不配套，施肥技术手段落后，致使化肥比例严重失调、化肥投入效益明显下降。在施肥中，存在重大量元素肥轻中微量元素肥的现象，造成土壤板结，不利于作物吸收利用，进而形成土壤环境问题。本发明针对这些问题，在总结现有技术的基础上，通过大量试验研究与分析，终于完成本发明。技术实现要素：[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种土壤生物修复剂。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种土壤生物修复剂。该土壤生物修复剂由1-2重量份蜡样杆菌菌粉、6-12重量份寡雄腐霉菌粉、6-12重量份绿色木霉菌粉、4-8重量份多食鞘氨醇杆菌发酵物、50-60重量份食用菌菌渣、7-15重量份氨基酸螯合钙、4-10重量份氨基酸螯合锌与0.10-0.50重量份DA-6组成。根据本发明的一种优选实施方式，所述的蜡样芽孢杆菌菌粉活菌数≥200.0亿/g、寡雄腐霉菌粉活菌数≥10.0亿/g、绿色木霉菌粉活菌数≥10.0亿/g与多食鞘氨醇杆菌发酵物≥5.0亿/g。根据本发明的另一种优选实施方式，多食鞘氨醇杆菌发酵物是按照下述步骤制备得到的：A、活化培养制备牛肉膏蛋白胨液体培养基：将5g牛肉膏、10g蛋白胨、10g葡萄糖、5gNaCl加到1000ml蒸馏水中，煮沸溶化，然后在温度121℃下灭菌30min，得到牛肉膏蛋白胨液体培养基；在无菌的条件下，将0.1g多食鞘氨醇杆菌接种到200mL上述牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度30℃与转速180r/min的条件下培养48h，得到多食鞘氨醇杆菌活化培养物；B、菌种提纯在无菌的条件下，使用无菌接种环从步骤A得到的多食鞘氨醇杆菌活化培养物中挑取少量培养物加到牛肉膏蛋白胨培养基平板中，划线，在恒温培养箱中在温度30℃下恒温培养48h，得到纯多食鞘氨醇杆菌培养物；C、种子液培养制备种子液培养基：6gMgSO4.·7H2O、6gNaCl、20g豆粕粉与10g玉米粉混合均匀，加水至1000mL溶解，将其溶液的pH调节至7.1，然后在温度121℃下灭菌30min，得到种子液培养基；从步骤B得到的牛肉膏蛋白胨培养基平板上挑取单个多食鞘氨醇杆菌菌落接种到上述种子液培养基中，在温度30℃与转速220r/min的条件下震荡培养36h，得到多食鞘氨醇杆菌种子培养物；D、发酵培养麸皮、玉米粉、豆粕粉按照重量比1-4.5：0.5-2：0.5-1.5混合均匀，再加水调节至含水量为以重量计40-50％，灭菌，得到固体发酵培养基；然后，按照接种量为以固体发酵培养基重量计8-10％，将步骤C得到的多食鞘氨醇杆菌种子培养物接种到所述固体发酵培养基中，在温度28-35℃的条件下进行固体发酵培养3-4d，得到的固体发酵培养产物然后进行机械翻拌、低温烘干与粉碎，得到所述的多食鞘氨醇杆菌发酵物。根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，所述固体发酵培养物在温度30-38℃的条件下进行低温烘干。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的食用菌菌渣是香菇菌渣或平菇菌渣。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的氨基酸螯合钙是按照下述制备步骤制备得到的：在反应釜中将水加热至温度80℃，按照复合氨基酸与钙盐配体摩尔比1：2往水中加入复合氨基酸与钙盐，完全溶解，然后将其溶液的pH调节至8.0，在温度70℃下进行螯合反应60min，再经浓缩、干燥、粉碎，得到氨基酸螯合钙。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的氨基酸螯合锌是按照下述制备步骤制备得到的：在反应釜中将水加热至温度40℃，按照复合氨基酸与锌盐配体摩尔比2：1往水中加入复合氨基酸与锌盐，完全溶解，然后将其溶液的pH调节至7.0，在温度35℃下进行螯合反应30min，再经浓缩、干燥、粉碎，得到氨基酸螯合锌。根据本发明的另一种优选实施方式，该土壤生物修复剂由1.2-1.8重量份蜡样杆菌菌粉、8-10重量份寡雄腐霉菌粉、8-10重量份绿色木霉菌粉、5-7重量份多食鞘氨醇杆菌发酵物、52-58重量份食用菌菌渣、9-13重量份氨基酸螯合钙、5-9重量份氨基酸螯合锌与0.20-0.40重量份DA-6组成。根据本发明的另一种优选实施方式，该土壤生物修复剂由1.5重量份蜡样杆菌菌粉、9重量份寡雄腐霉菌粉、9重量份绿色木霉菌粉、6重量份多食鞘氨醇杆菌发酵物、54-56重量份食用菌菌渣、10-12重量份氨基酸螯合钙、6-8重量份氨基酸螯合锌与0.28-0.32重量份DA-6组成。根据本发明的另一种优选方式，本发明土壤生物修复剂的总有效活菌数≥0.5亿/g、纤维素酶活≥90.0U/g、蛋白酶活≥30.0U/g、钙含量以重量计≥0.50％、锌含量以重量计≥0.10％、细度(≤3mm)≥70.0％，pH5.5～8.5，水含量以重量计≤35.0％。下面将更详细的描述本发明。本发明涉及一种土壤生物修复剂。该土壤生物修复剂由1-2重量份蜡样杆菌菌粉、6-12重量份寡雄腐霉菌粉、6-12重量份绿色木霉菌粉、4-8重量份多食鞘氨醇杆菌发酵物、50-60重量份食用菌菌渣、7-15重量份氨基酸螯合钙、4-10重量份氨基酸螯合锌与0.10-0.50重量份DA-6组成。蜡样芽胞杆菌其分类命名为蜡样芽胞杆菌Y1(Bacillus ；cereus ；Y1),可产生抗菌物质，抑制有害微生物繁殖，降解土壤中的有害成分，该菌株可在高浓度的甲氰菊酯环境下生长，并可高效降解，可用于受甲氰菊酯污染的水体、土壤的生物净化，改善生态环境。蜡样芽胞杆菌菌粉在本发明土壤生物修复剂中的主要作用是抑制有害微生物繁殖，修复受甲氰菊酯类农药污染的水体和土壤，改善植物生长环境。本发明使用的蜡样芽胞杆菌菌粉是目前市场上销售的产品，例如由江苏绿科生物技术有限公司、沧州旺发生物技术有限公司、河南仰韶生化工程有限公司、武汉丰田生物科技有限公司销售的蜡样芽胞杆菌菌粉。采用将在下面详细描述的检测方法检测确定，本发明使用的蜡样芽胞杆菌菌粉活菌数≥200亿/g。寡雄腐霉是真菌天敌，是一种在自然界中存在的攻击性很强的寄生真菌，能在多种农作物根部定殖，不仅不会对作物产生致病作用，而且还能抑制或杀死其它致病真菌和土传病原菌，诱导植物产生防御反应，减少病原菌入侵。寡雄腐霉菌粉具有促进种子萌发、为植物提供健康生长最佳环境、促进根系生长的有益作用，它还具有有利于生态平衡、使用方便、显著提高作物产量、在作物整个生长周期都起作用、货架期长的特点，因此有利于农业的可持续发展，是实现有机农业的重要途径。寡雄腐霉菌粉在本发明土壤生物修复剂中的主要作用是产生大量的酶类分泌物对植物的多种病原真菌菌丝生长有抑制作用，降低病害发病率，促进植株生长。本发明使用的寡雄腐霉菌粉是目前市场上销售的产品，例如河南省农业微生物工程技术研究中心生产的寡雄腐霉菌粉，采用将在下面详细描述的检测方法检测确定，本发明使用的寡雄腐霉菌粉活菌数≥10亿/g。绿色木霉是一种重寄生菌，能分泌多种抗生素类代谢产物，如绿色木霉素、抗菌肽、胶霉素等；还可能产生多种具有生物活性的酶系，是产纤维素酶活性最高的菌株之一，所产生的纤维素酶对作物纤维有降解作用，效果非常好；绿色木霉又是一种资源丰富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用。现有研究工作表明，用绿色木霉和寡雄腐霉拌种处理能够对土传病害有良好的防效。绿色木霉菌粉在本发明土壤生物修复剂中的主要作用是加速土壤中作物秸秆和畜禽粪便的分解，防治土传性真菌病害。本发明使用的绿色木霉菌粉是目前市场上销售的产品，例如由沂源翰林农业发展有限公司、广州绿辉生物科技有限公司、山东长泰生物科技有限公司、沂源康源生物科技有限公司销售的绿色木霉菌粉，采用将在下面详细描述的检测方法检测确定，本发明使用的绿色木霉菌粉活菌数≥10亿/g。当然，也可以根据现有技术文献，使用常规的培养基采用常规培养方法进行逐级培养，得到所述的蜡样芽胞杆菌菌粉、寡雄腐霉菌粉和绿色木霉菌粉。多食鞘氨醇杆菌属于鞘脂杆菌科，该菌具有降解原油的能力，而且还能产生脂肽类表面活性剂，具有解磷解钾功能，能够活化土壤中的中微量元素，提高或延长肥效，减少化肥用量，提高作物抗逆性、预防或减轻植物病害。多食鞘氨醇杆菌发酵物在本发明土壤生物修复剂中的主要作用是降解土壤中石油污染物，提高肥效，并提高作物抗逆性。本发明使用的多食鞘氨醇杆菌发酵物是按照下述步骤制备得到：A、活化培养制备牛肉膏蛋白胨液体培养基：将5g牛肉膏、10g蛋白胨、10g葡萄糖、5gNaCl加到1000ml蒸馏水中，煮沸溶化，然后在温度121℃下灭菌30min，得到牛肉膏蛋白胨液体培养基；在无菌的条件下，将0.1g由上海丰寿生物科技有限公司公司或上海莼试生物技术有限公司公司提供的多食鞘氨醇杆菌接种到200mL上述牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度30℃与转速180r/min的条件下培养48h，得到多食鞘氨醇杆菌活化培养物。本发明使用的灭菌设备是本
技术领域：
里通常使用的、目前市场上销售的产品，下面使用的灭菌设备也如此，因此不再赘述。B、菌种提纯在无菌的条件下，使用无菌接种环从步骤A得到的多食鞘氨醇杆菌活化培养物中挑取少量培养物加到牛肉膏蛋白胨培养基平板中，划线，在恒温培养箱中在温度30℃下恒温培养48h，得到纯多食鞘氨醇杆菌培养物。所述的牛肉膏蛋白胨平板培养基是本
技术领域：
的技术人员熟知的培养基，它由5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、18-20g营养琼脂与1000ml水配制而成。本发明使用的恒温培养箱是是目前市场上销售的产品，例如由上海博迅实业有限公司医疗设备厂以商品名生化培养箱销售的产品。C、种子液培养制备种子液培养基：6gMgSO4.·7H2O、6gNaCl、20g豆粕粉与10g玉米粉混合均匀，加水至1000mL溶解，将其溶液的pH调节至7.1，然后在温度121℃下灭菌30min，得到种子液培养基；从步骤B得到的牛肉膏蛋白胨培养基平板上挑取单个多食鞘氨醇杆菌菌落接种到上述种子液培养基中，在温度30℃与转速220r/min的条件下震荡培养36h，得到多食鞘氨醇杆菌种子培养物；在本发明中，使用无机碱或无机酸水溶液调节种子液培养基的pH，所述的无机碱例如是氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钠，它的浓度通常是1-2N；所述的无机酸例如是磷酸、硫酸或硝酸，它的浓度通常是1-2N；D、发酵培养麸皮、玉米粉、豆粕粉按照重量比1-4.5：0.5-2：0.5-1.5混合均匀，再加水调节至含水量为以重量计40-50％，灭菌，得到固体发酵培养基；然后，按照接种量为以固体发酵培养基重量计8-10％，将步骤C得到的多食鞘氨醇杆菌种子培养物接种到所述固体发酵培养基中，在温度28-35℃的条件下进行固体发酵培养3-4d，得到的固体发酵培养产物然后进行机械翻拌、低温烘干与粉碎，得到所述的多食鞘氨醇杆菌发酵物。本发明使用的豆粕粉是豆粕粉或豆子豆粉，来自中粮黄海粮油工业(河南)有限公司生产的大豆油得到的豆粕粉。麸皮、玉米粉、豆粕粉都是目前市场上销售的产品，其粒度通常是60～300目。麸皮、玉米粉与豆粕粉混合所使用的设备是本
技术领域：
里通常使用的、在目前市场上销售的混合设备。在这个步骤中，固体发酵培养产物优选地是在温度30-38℃条件下进行低温烘干的。采用将在下面详细具体描述的检测方法检测确定，所述的多食鞘氨醇杆菌发酵物的活菌数≥5亿/g。本发明的土壤生物修复剂中使用的食用菌菌渣，即食用菌废料，又被称作菌糠，是食用菌栽培后被食用菌菌丝利用后的植物残体，极难降解。我国每年最少产生350万吨菌渣，在全国各地农村，食用菌菌渣通常是被随意丢弃或者燃烧，由此产生的环境问题不容忽视。实际上，食用菌菌渣营养丰富，它的营养相当于通常麦麸、豆粕所含有的营养。本发明的土壤生物修复剂，所使用的食用菌菌渣主要作用是改善土壤肥力，提供植物营养，提高果蔬中叶绿素或可溶性糖的含量。本发明的食用菌菌渣是平菇菌渣或者香菇菌渣。本发明的食用菌菌渣例如是来自三门峡富康食用菌专业合作社生产平菇得到的平菇菌渣、来自三门峡绿之源生物科技有限公司生产香菇得到的香菇菌渣。所述的食用菌菌渣在使用前需要进行剥去外层薄膜，粉碎预处理，收集粒度80-100目的食用菌菌渣。本发明使用的氨基酸螯合钙制备方法如下：在反应釜中将水加热至温度80℃，按照复合氨基酸与钙盐配体摩尔比1：2往水中加入复合氨基酸与钙盐，完全溶解，然后将其溶液的pH调节至8.0，在温度70℃下进行螯合反应60min，再经浓缩、干燥、粉碎，得到氨基酸螯合钙。所述的钙盐例如是硝酸钙，当然也可以使用能够与氨基酸螯合的其它钙盐，这些钙盐也在本发明保护范围之内。氨基酸螯合锌是按照与氨基酸螯合钙制备方法相同的方法制备的，只是pH7.0、螯合反应温度35℃、反应时间30min、加入复合氨基酸与锌盐配体的摩尔比为2：1。所述的锌盐例如是七水硫酸锌，当然也可以使用能够与氨基酸螯合的其它锌盐，这些锌盐也在本发明保护范围之内。本发明使用的复合氨基酸粉是目前市场上销售的产品，例如由成都螯合生物科技有限公司、四川绵竹新华化工有限公司、上海依赫生物科技有限公司、新乡市中信化工有限公司、山西祁县同力化工有限公司、郑州润达化工有限公司、郑州凯岚水处理材料有限公司销售的产品。DA-6是DA-6胺鲜酯，化学名称己酸二乙氨基乙醇酯，纯白色粉状晶体，易溶于水。它是广谱性植物生长调节剂，促进细胞分裂和生长，加速生长点的分化，能提高植株体内叶绿素、蛋白质、核酸含量和光合速率，提高过氧化物酶及硝酸还原酶的活性，促进植株的碳、氮代谢，增强植株对水肥吸收和干物质的积累，调节植物体内水分平衡，增强作物、果树的抗病、抗旱、抗寒能力；延缓植株衰老，促进作物早熟、增产、提高作物果实品质，提高作物产量。DA-6在本发明土壤生物修复剂中的主要作用在于增强提高肥效、改善作物果实品质，提高作物产量。本发明使用的DA-6是目前市场上销售的产品，例如由郑州郑氏化工产品有限公司、郑州卓越农业科技有限公司、郑州中科化工产品有限公司、郑州信联生化科技有限公司销售的产品。在本发明的土壤生物修复剂中，其它组分的含量在所述的范围内时，如果所述蜡样杆菌菌粉的量小于1重量份，则不利于产生抗菌物质，不能抑制有害微生物的繁殖与降解土壤中的有害成分；如果所述蜡样杆菌菌粉量大于2重量份，则不利于该土壤生物修复剂中其他种类微生物生长繁殖；因此，所述蜡样杆菌菌粉的量为1-2重量份是可行的，优选地是1.2-1.8重量份，更优选地是1.5重量份。同样地，其它组分的含量在所述的范围内时，如果所述寡雄腐霉发酵物量小于6重量份，则寡雄腐霉菌不能很好地在作物根际定殖；如果所述寡雄腐霉发酵物量大于12重量份，则不能与绿色木霉以最佳比例复配，从而不能发挥最优抗病效果；因此，所述蜡样杆菌菌粉量为6-12重量份是可行的，优选地是8-10重量份，更优选地是9重量份。其它组分的含量在所述的范围内时，如果所述绿色木霉菌粉量小于6重量份，则绿色木霉菌不能很好地在作物根际定殖；如果所述绿色木霉菌量大于12重量份，则不能与寡雄腐霉发酵物以最佳比例复配，从而不能发挥最优抗病效果；因此，所述绿色木霉菌粉量为6-12重量份是可行的，优选地是8-10重量份，更优选地是9重量份。同样地，其它组分的含量在所述的范围内时，如果所述多食鞘氨醇杆菌发酵物的量小于4重量份，则不能在作物根基形成优势菌群，造成纤维降解效果不明显；如果所述多食鞘氨醇杆菌发酵物量大于8重量份，则不利于该土壤生物修复剂中其它种类微生物的生长繁殖；因此，所述多食鞘氨醇杆菌发酵物量为4-8重量份是可行的，优选地是5-7重量份，更优选地是6重量份。其它组分的含量在所述的范围内时，如果所述食用菌菌渣量小于50重量份，则不利于土壤生物修复剂中微生物生长繁殖；如果所述食用菌菌渣量大于60重量份，则会造成单位质量菌剂中有益微生物比例减少；因此，所述食用菌菌渣量为50-60重量份是可行的，优选地是52-58重量份，更优选地是54-56重量份。其它组分的含量在所述的范围内时，如果所述氨基酸螯合钙量小于7重量份，则不能满足农作物在生长过程中对钙元素的需求；如果所述氨基酸螯合钙量大于15重量份，则会造成其它中微量元素比例失衡；因此，所述氨基酸螯合钙量为7-15重量份是可行的，优选地是9-13重量份，更优选地是10-12重量份。其它组分的含量在所述的范围内时，如果所述氨基酸螯合锌量小于4重量份，则不能满足农作物在生长过程中对锌元素的需求；如果所述氨基酸螯合锌量大于10重量份，则会造成其它中微量元素比例失衡；因此，所述氨基酸螯合锌量为4-10重量份是可行的，优选地是5-9重量份，更优选地是6-8重量份。其它组分的含量在所述的范围内时，如果所述DA-6的量小于0.10重量份，则不能有效的促进作物碳氮代谢和干物质的积累，如果所述DA-6的量大于0.50重量份。则会产生药害，因此，所述DA-6的量为0.10-0.50重量份是可行的，优选地是0.20-0.40重量份，更优选地是0.28-0.32重量份。优选地，本发明土壤生物修复剂由1.2-1.8重量份蜡样杆菌菌粉、8-10重量份寡雄腐霉菌粉、8-10重量份绿色木霉菌粉、5-7重量份多食鞘氨醇杆菌发酵物、52-58重量份食用菌菌渣、9-13重量份氨基酸螯合钙、5-9重量份氨基酸螯合锌与0.20-0.40重量份DA-6组成。更优选地，本发明土壤生物修复剂由1.5重量份蜡样杆菌菌粉、9重量份寡雄腐霉菌粉、9重量份绿色木霉菌粉、6重量份多食鞘氨醇杆菌发酵物、54-56重量份食用菌菌渣、10-12重量份氨基酸螯合钙、6-8重量份氨基酸螯合锌与0.28-0.32重量份DA-6组成。本发明土壤生物修复剂制备方法如下：按照前面描述的方法制备多食鞘氨醇杆菌培养物；按照前面描述的方法制备氨基酸螯合钙与氨基酸螯合锌；按照前面描述的方法处理食用菌菌渣；将多食鞘氨醇杆菌培养物、氨基酸螯合钙、氨基酸螯合锌、食用菌菌渣、蜡样杆菌菌粉、寡雄腐霉菌粉、绿色木霉菌粉与DA-6按照前面描述的重量比进行混合，得到本发明土壤生物修复剂。采用将在下面详细描述的检测方法检测确定，本发明土壤生物修复剂的有效活菌数≥0.50亿/g。根据农用微生物菌剂(GB20287-2006)标准采用比色法测定本发明土壤生物修复剂的纤维素酶活≥90U/g。根据农用微生物菌剂(GB20287-2006)标准采用比色法测定本发明土壤生物修复剂的蛋白酶活≥30U/g。根据NY/T2272土壤调理剂钙、镁、硅含量测定方法，测定本发明土壤生物修复剂的CaO含量以重量计≥0.50％。根据复混肥料中铜铁锰锌硼钼含量测定方法，采用GB/T14540-20033.8原子吸收分光光度法测定，测定本发明土壤生物修复剂的锌含量以重量计≥0.10％。根据农用微生物菌剂(GB20287-2006)标准测定本发明土壤生物修复剂的细度(≤3mm)≥70.0％。根据农用微生物菌剂(GB20287-2006)标准测定本发明土壤生物修复剂的pH值为5.5～8.5。根据农用微生物菌剂(GB20287-2006)标准测定本发明土壤生物修复剂的水分含量以重量计≤35％。在本发明中，将蜡样杆菌菌粉、寡雄腐霉发酵物、绿色木霉菌粉、多食鞘氨醇杆菌发酵物、食用菌菌渣、氨基酸螯合钙、氨基酸螯合锌与DA-6按照重量比1-2：6-12：6-12：4-8：50-60：7-15：4-10：0.1-0.5混合均匀，得到本发明的土壤生物修复剂。下面描述根据“农用微生物菌剂(GB20287-2006)”标准检测蜡样芽胞杆菌、寡雄腐霉、绿色木霉和多食鞘氨醇杆菌活菌数的方法。采用平板计数法检测本发明土壤生物修复剂活菌数，在检测蜡样芽胞杆菌和多食鞘氨醇杆菌活菌数时使用营养琼脂培养基，在检测寡雄腐霉和绿色木霉活菌数时使用孟加拉红培养基。具体检测步骤如下：I、系列稀释：称取10g样品，加到100mL有玻璃珠的无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上以转速200r/min充分振荡30min，得到母液菌悬液(基础液)。用无菌移液管吸取5.0mL母液菌悬液分别加到45mL无菌水中，然后按照体积比1:10进行系列稀释，分别得到稀释度分别为1:1×101、1:1×102、1:1×103、1:1×104……的稀释菌悬液。II、加样及培养：每个样品取3个连续稀释度，用无菌移液管分别吸取0.1mL不同稀释度菌悬液，加到预先制备的固体培养基平板上，分别用无菌玻璃刮刀将不同稀释度菌悬液均匀地涂于琼脂表面。每一稀释度重复3次，同时以无菌水作空白对照，多食鞘氨醇杆菌、蜡样芽孢杆菌在温度37℃下、绿色木霉和寡雄腐霉在温度28℃下进行培养。III、菌落识别：根据所检测寡雄腐霉菌，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等常规技术手段确认有效菌。菌落计数：以出现20～300个菌落数的稀释度的平板为计数标准(丝状真菌为10～150个菌落数)，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。当只有一个稀释度，其平均菌落数为20～300个时，则以该平均菌落数计算。若有两个稀释度，其平均菌落数均在20～300个之间时，应按两者菌落总数之比值决定。若其比值小于等于2应计算两者的平均数；若大于2则以稀释度小的菌落平均数计算。根据下式(1)计算有效活菌数：nm＝xkv1/(m0v2)x10-8………(1)式中：nm代表质量有效活菌数，亿/g；x代表菌落平均数，个；k代表稀释倍数；v2代表菌悬液加入量，mL；m0代表样品量，g。本发明的土壤生物修复剂可采用穴施、沟施或撒施后耕翻，作为基肥亦可用于追肥施用。本
技术领域：
的技术人员可以根据实际生产情况确定本发明土壤生物修复剂的施用量及施用方法，这对于本
技术领域：
的技术人员而言不存在任何技术问题，是很容易实现的。[有益效果]本发明的有益效果是：本发明土壤生物修复剂含有大量有益活性菌及代谢酶，能分解土壤中动植物残体、畜禽粪便，改善作物根际土壤微环境，能够疏松土壤，缓解土壤板结和盐碱化，促进农作物根部发育，抑制有害微生物活动，减少土传病害发生，减少农药使用量，增强农作物的抗逆性，进而提高作物产质量；同时对“石油农业”污染及农药残留具有较强地降解修复作用；产品中螯合态中微量元素可缓解植物缺素症，减轻或清除土壤中重金属污染，提高化肥的利用率，减少过量施肥带来的危害，有利于节约资源、保护环境。【附图说明】图1是不同处理的苹果产量图。【具体实施方式】通过下述实施例将能够更好地理解本发明。实施例1：本发明土壤生物修复剂制备该实施例按照下述方式实施：第一，制备多食鞘氨醇杆菌发酵物A、活化培养制备牛肉膏蛋白胨液体培养基：将5g牛肉膏、10g蛋白胨、10g葡萄糖、5gNaCl加到1000ml蒸馏水中，煮沸溶化，然后在温度121℃下灭菌30min，得到牛肉膏蛋白胨液体培养基；在无菌的条件下，将0.1g多食鞘氨醇杆菌接种到200mL上述牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度30℃与转速180r/min的条件下培养48h，得到多食鞘氨醇杆菌活化培养物；B、菌种提纯将5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g氯化钠与18-20g营养琼脂加到1000ml水中，溶解，然后在温度121℃下灭菌30min，得到牛肉膏蛋白胨固体培养基。在无菌的条件下，使用无菌接种环从步骤A得到的多食鞘氨醇杆菌活化培养物中挑取少量培养物加到牛肉膏蛋白胨培养基平板中，划线，在恒温培养箱中在温度30℃下恒温培养48h，得到纯多食鞘氨醇杆菌培养物；C、种子液培养制备种子液培养基：6gMgSO4.·7H2O、6gNaCl、20g豆粕粉与10g玉米粉混合均匀，加水至1000mL溶解，将其溶液的pH调节至7.1，然后在温度121℃下灭菌30min，得到种子液培养基。从步骤B得到的牛肉膏蛋白胨培养基平板上挑取单个多食鞘氨醇杆菌菌落接种到上述种子液培养基中，在温度30℃与转速220r/min的条件下震荡培养36h，得到多食鞘氨醇杆菌种子培养物；D、发酵培养麸皮、玉米粉、豆粕粉按照重量比1：0.5：0.5混合均匀，再加水调节至含水量为以重量计40％，灭菌，得到固体发酵培养基；然后，按照接种量为以固体发酵培养基重量计8％，将步骤C得到的多食鞘氨醇杆菌种子培养物接种到所述固体发酵培养基中，在温度28℃的条件下进行固体发酵培养4d，得到的固体发酵培养产物然后进行机械翻拌、在温度30℃的条件下低温烘干，粉碎，得到所述的多食鞘氨醇杆菌发酵物。第二，制备氨基酸螯合钙：在反应釜中将水加热至温度80℃，按照复合氨基酸与钙盐配体摩尔比1：2往水中加入由四川绵竹新华化工有限公司销售的复合氨基酸，由新乡市中信化工有限公司销售的硝酸钙，完全溶解，然后将其溶液的pH调节至8.0，在温度70℃下进行螯合反应60min，再经浓缩、干燥、粉碎，得到氨基酸螯合钙。在反应釜中将水加热至温度40℃，按照复合氨基酸与锌盐配体摩尔比2：1往水中加入由四川绵竹新华化工有限公司销售的复合氨基酸粉，由郑州润达化工有限公司销售的七水硫酸锌，完全溶解，然后将其溶液的pH调节至7.0，在温度35℃下进行螯合反应30min，再经浓缩、干燥、粉碎，得到氨基酸螯合锌。第三，剥去平菇菌渣外层薄膜，使用常见的粉碎机粉碎，收集粒度80-100目的平菇食用菌菌渣。第四，上述制备的多食鞘氨醇杆菌发酵物、江苏绿科生物技术有限公司销售的蜡样杆菌菌粉、河南省农业微生物工程技术研究中心生产的寡雄腐霉菌粉、沂源翰林农业发展有限公司销售的绿色木霉菌粉、上述预处理平菇食用菌菌渣、上述制备的氨基酸螯合钙、氨基酸螯合锌与郑州郑氏化工产品有限公司销售的DA-6，按照重量比4：1：12：12：50：7：10：0.5混合均匀，得到本发明土壤生物修复剂。采用本说明书中描述的方法进行检测，本实施例制备的土壤生物修复剂的总有效活菌数1.1亿/g、纤维素酶活148U/g、蛋白酶活65U/g、钙含量以重量计0.58％、锌含量以重量计0.35％、细度(≤3mm)85％，pH6.5，水含量以重量计22.2％。实施例2：本发明土壤生物修复剂制备该实施例按照下述方式实施：第一，制备多食鞘氨醇杆菌发酵物A、活化培养按照与实施例1相同的方式制备牛肉膏蛋白胨液体培养基。在无菌的条件下，将0.1g多食鞘氨醇杆菌接种到200mL上述牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度30℃与转速180r/min的条件下培养48h，得到多食鞘氨醇杆菌活化培养物；B、菌种提纯按照与实施例1相同的方式制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，并进行菌种提纯。C、种子液培养按照与实施例1相同的方式制备种子液培养基。从步骤B得到的牛肉膏蛋白胨培养基平板上挑取单个多食鞘氨醇杆菌菌落接种到上述种子液培养基中，在温度30℃与转速220r/min的条件下震荡培养36h，得到多食鞘氨醇杆菌种子培养物；D、发酵培养麸皮、玉米粉、豆粕粉按照重量比4.5：2：1.5混合均匀，再加水调节至含水量为以重量计50％，灭菌，得到固体发酵培养基；然后，按照接种量为以固体发酵培养基重量计10％，将步骤C得到的多食鞘氨醇杆菌种子培养物接种到所述固体发酵培养基中，在温度35℃的条件下进行固体发酵培养3d，得到的固体发酵培养产物然后进行机械翻拌、在温度38℃的条件下低温烘干，粉碎，得到所述的多食鞘氨醇杆菌发酵物。第二、按照与实施例1相同的方式制备氨基酸螯合钙和氨基酸螯合锌。第三，剥去香菇菌渣外层薄膜，使用常见的粉碎机粉碎，收集粒度80-100目的香菇食用菌菌渣。第四，将上述制备的多食鞘氨醇杆菌发酵物、由沧州旺发生物技术有限公司销售的蜡样杆菌菌粉、由河南省农业微生物工程技术研究中心生产的寡雄腐霉菌粉、由广州绿辉生物科技有限公司销售的绿色木霉菌粉、上述预处理的香菇食用菌菌渣、上述制备的氨基酸螯合钙、氨基酸螯合锌与由郑州卓越农业科技有限公司销售的DA-6，按照重量比7：1.8：6：6：60：15：4：0.1混合，得到本发明的土壤生物修复剂。采用本说明书中描述的方法进行检测，本实施例制备的土壤生物修复剂的总有效活菌数1.4亿/g、纤维素酶活162U/g、蛋白酶活73U/g、钙含量以重量计0.85％、锌含量以重量计0.18％、细度(≤3mm)86％，pH6.5，水含量以重量计23.8％。实施例3：本发明土壤生物修复剂制备该实施例按照下述方式实施：第一，制备多食鞘氨醇杆菌A、活化培养按照与实施例1相同的方式制备牛肉膏蛋白胨液体培养基。在无菌的条件下，将0.1g由上海丰寿生物科技有限公司提供的多食鞘氨醇杆菌接种到200mL上述牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度30℃与转速180r/min的条件下培养48h，得到多食鞘氨醇杆菌活化培养物；B、菌种提纯按照与实施例1相同的方式进行牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备，并进行菌种提纯。C、种子液培养按照与实施例1相同的方式制备种子液培养基。从步骤B得到的牛肉膏蛋白胨培养基平板上挑取单个多食鞘氨醇杆菌菌落接种到上述种子液培养基中，在温度30℃与转速220r/min的条件下震荡培养36h，得到多食鞘氨醇杆菌种子培养物；D、发酵培养麸皮、玉米粉、豆粕粉按照重量比2：1：1.2混合均匀，再加水调节至含水量为以重量计44％，灭菌，得到固体发酵培养基；然后，按照接种量为以固体发酵培养基重量计9％，将步骤C得到的多食鞘氨醇杆菌种子培养物接种到所述固体发酵培养基中，在温度32℃的条件下进行固体发酵培养4d，得到的固体发酵培养产物然后进行机械翻拌、在温度35℃的条件下低温烘干，粉碎，得到所述的多食鞘氨醇杆菌发酵物。第二、按照与实施例1相同的方式制备氨基酸螯合钙和氨基酸螯合锌。第三，剥去平菇菌渣外层薄膜，使用常见的粉碎机粉碎，收集粒度80-100目的平菇食用菌菌渣。第四，将上述制备的多食鞘氨醇杆菌发酵物、由河南仰韶生化工程有限公司销售的蜡样杆菌菌粉、由河南省农业微生物工程技术研究中心生产的寡雄腐霉菌粉、由山东长泰生物科技有限公司销售的绿色木霉菌粉、上述预处理的平菇食用菌菌渣、上述制备的氨基酸螯合钙、氨基酸螯合锌与由郑州中科化工产品有限公司销售的DA-6，按照重量比8：2：10：8：55：12：6：0.3混合均匀，得到本发明的土壤生物修复剂。采用本说明书中描述的方法进行检测，本实施例制备的土壤生物修复剂的总有效活菌数1.3亿/g、纤维素酶活172U/g、蛋白酶活78U/g、钙含量以重量计0.72％、锌含量以重量计0.28％、细度(≤3mm)88％，pH6.8，水含量以重量计22.5％。实施例4：本发明土壤生物修复剂制备该实施例按照下述方式实施：第一，制备多食鞘氨醇杆菌A、活化培养按照与实施例1相同的方式制备牛肉膏蛋白胨液体培养基。在无菌的条件下，将0.1g上海莼试生物技术有限公司提供的多食鞘氨醇杆菌接种到200mL上述牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度30℃与转速180r/min的条件下培养48h，得到多食鞘氨醇杆菌活化培养物；B、菌种提纯按照与实施例1相同的方式制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，并进行菌种提纯。C、种子液培养按照与实施例1相同的方式制备种子液培养基。从步骤B得到的牛肉膏蛋白胨培养基平板上挑取单个多食鞘氨醇杆菌菌落接种到上述种子液培养基中，在温度30℃与转速220r/min的条件下震荡培养36h，得到多食鞘氨醇杆菌种子培养物；D、发酵培养麸皮、玉米粉、豆粕粉按照重量比3：1.5：1混合均匀，再加水调节至含水量为以重量计48％，灭菌，得到固体发酵培养基；然后，按照接种量为以固体发酵培养基重量计9％，将步骤C得到的多食鞘氨醇杆菌种子培养物接种到所述固体发酵培养基中，在温度33℃的条件下进行固体发酵培养3d，得到的固体发酵培养产物然后进行机械翻拌、在温度32℃的条件下低温烘干，粉碎，得到所述的多食鞘氨醇杆菌发酵物。第二，按照与实施例1相同的方式制备氨基酸螯合钙和氨基酸螯合锌。第三，剥去香菇菌渣外层薄膜，使用常见的粉碎机粉碎，收集粒度80-100目的香菇食用菌菌渣。第四，将上述制备的多食鞘氨醇杆菌发酵物、由武汉丰田生物技术有限公司销售的蜡样杆菌菌粉、由河南省农业微生物工程技术研究中心生产的寡雄腐霉菌粉、由沂源康源生物科技有限公司销售的绿色木霉菌粉、上述预处理的香菇食用菌菌渣、上述制备的氨基酸螯合钙、氨基酸螯合锌与由郑州信联生化科技有限公司销售的DA-6，按照重量比6：1.5：8：10：58：8：9：0.4混合均匀，得到本发明的土壤生物修复剂。采用本说明书描述的方法进行检测，本实施例制备的土壤生物修复剂的总有效活菌数1.5亿/g、纤维素酶活172U/g、蛋白酶活74U/g、钙含量以重量计0.62％、锌含量以重量计0.31％、细度(≤3mm)88％，pH6.7，水含量以重量计23.6％。试验实施例1：本发明土壤生物修复剂的苹果树栽培应用试验试验品种：十年生红富士苹果树。试验时间：田间应用试验在2013年-2014年进行两年，并进行一年跟踪。试验地概况：烟台市牟平区，土壤类型为棕壤,表层质地为轻壤,肥力均匀，排灌条件良好，以前未进行过肥料试验。处理1：在3月中旬在树冠区按照每亩60kg众德牌土壤调理剂将其土壤调理剂翻入地下，其它农艺措施和田间管理均按照当地优质苹果生产技术规范执行。处理2：施用与处理1等量的本发明土壤生物修复剂，其它农艺措施和田间管理均按照当地优质苹果生产技术规范执行。在试验期间观察果树和果实外观变化。果实成熟后分次采收，当年10月初开始采收，在11月中旬采收结束。在各试验地单收、单称、单记重，统计每个试验地每次采收产量，并随机抽取200个苹果进行糖度和酸度化验分析。在11月底采集两个不同处理的土壤样品，对pH值进行化验分析。试验结果：不同处理对苹果品质影响试验结果列于表1中。表1：苹果糖度和酸度化验结果表1的结果清楚表明，本发明土壤生物修复剂糖度提高0.8％,酸度降低0.03％，改善苹果口感，提升了果实品质。不同处理对苹果农残及重金属降解影响试验结果列于表2中。表2：苹果重要农药残留及重金属检测表2的结果清楚表明，试验前及处理1中甲氰菊酯、氰戊菊酯残留和各种重金属残留量虽均在极限范围内，但表现较高，本发明土壤生物修复剂能有效降低甲氰菊酯、氰戊菊酯残留和重金属残留。由此可见，施用所述土壤生物康复剂能够降解农药残留、固定土壤中重金属等污染物，可修复土壤，最终保证食品安全。不同处理对苹果产量影响试验结果见附图1。由附图1可看出，本发明土壤生物修复剂亩增产221.2kg,增产率为7.10％。由此可见，施用所述的土壤生物修复剂可显著提高苹果产量。不同处理对苹果经济效益影响试验结果列于表3中。表3：不同处理对苹果经济效益的影响注：苹果单价为6元/kg。供试肥料与人工费共计费用180元/亩。表3的结果清楚表明，本发明土壤生物修复剂亩增值1147.2元，投入产出比为1:16.59。由此可见，施用所述的土壤生物修复剂可以提高苹果经济效益。不同土壤调理剂对土壤理化性能影响试验结果列于表4中。表4：不同处理对土壤理化性能的影响从上图可以看出，本发明土壤生物修复剂降低了土壤容重，提高了有机质含量，有一定的解磷解钾作用，提高了化肥利用率，减少了浪费。由此可见，施用所述的土壤生物修复剂可以改良土壤团粒结构，营造土壤良好环境，增强土壤保水保肥能力，有助于提高微生物活力。本发明土壤生物修复剂不仅可以提高苹果产量和品质，而且可以降低农残和重金属；降低土壤容重，改善土壤团粒结构；同时有一定的解磷解钾作用，提高，化肥利用率；增强土壤保水保肥能力有助于提高微生物活力。试验实施例2：本发明土壤生物修复剂的番茄栽培应用试验试验品种：圭粉四号番茄试验地点：曹岗乡清河集村大棚内试验时间：2013年4月至2015年8月试验方法：本试验设4个处理，3次重复，采用完全随机区组设计，小区面积40m2。作为基肥于移栽前起垄时一次性条施土壤垄体20cm深，移栽行距0.6米，株距0.4米，移栽密度2778株/亩。处理1：常规施肥80kg/亩(20kg尿素、10kg磷酸一铵与50kg硫酸钾)，其它养护措施均按照当地番茄种植技术规范执行。处理2：在处理1的基础上增施80kg/亩本发明土壤生物修复剂，其它养护措施均按照当地番茄种植技术规范执行。处理3：在处理1的基础上增施80kg/亩本发明土壤生物修复剂微生物被灭活的基质，其它养护措施均按照当地番茄种植技术规范执行。处理4：空白对照不同处理对番茄生物学性状影响试验结果列于表5中。表5：不同处理对番茄生物学性状的影响处理叶色果色果型单株结果(个)单果重(克)1灰绿粉红肩绿略有小果和畸形果14171.92深绿粉红光亮整齐一致16175.33灰绿粉红肩绿略有小果和畸形果14172.84浅绿粉红肩绿不整齐13156.5从表5列出的结果可以看出，使用本发明土壤生物修复剂的圭粉四号番茄单果重较处理1、处理3和处理4分别增加3.4克、2.5克和18.8克，改善果型，从而提高产量和商品性。不同处理对番茄抗病性试验结果列于表6中。表6：不同处理对番茄开花期抗病性的影响其中：西红柿花叶病病情指数分级标准如下：0级：全株无病；1级：全株1/4以下叶片有少数病斑；2级：全株1/2以下叶片有少量病斑或1/4以下叶片有较多病斑；3级：全株3/4以下叶片发病或全株1/4以下叶片全叶枯黄；4级：全株3/4以上叶片发病或全株1/2以下叶片枯黄～整株枯黄。番茄根结线虫病情指数分级标准如下：0级为根系无虫瘿；1级：次生根根端有小虫瘿，占总根系的10％以下；2级：侧根根端形成虫瘿，占侧根总数的10％～30％；3级：主根根端形成虫瘿，有虫瘿侧根数占总数的30％～70％；4级：根系形成须根团，有虫瘿侧根数占总数的70％～100％。表6的结果清楚表明，本发明土壤生物修复剂处理在西红柿开花期主要病害的病株率和病指最低，表明本发明土壤生物修复剂中特定功能微生物对病原菌有拮抗作用，在一定程度上抑制和消灭了病害源，有利于提高番茄植株抗病性。不同处理对番茄品质影响试验结果列于表7中。表7：不同处理对番茄品质的影响处理可溶性糖％可溶性固形物％总酸％维生素C(mg/100g)14.444.590.4414.0924.784.720.4014.3534.564.554.4214.1344.324.504.4414.08表7的结果清楚表明，本发明土壤生物修复剂可提高可溶性糖、可溶性固形物、维生素C含量，降低总酸含量。总体来看，以处理2表现最优，处理1和处理3差异不显著，由此可见，施用本发明土壤生物修复剂有利于改善果实口感，提高番茄品质。不同处理对番茄产量影响试验结果列于表8中。表8：不同处理的产量结果统计表表8的结果清楚表明，本发明土壤生物修复剂亩产量较处理1、处理3分别增产350kg和512kg，增产率分别提高6.1％和9.1％。由此可见，本发明的土壤生物修复剂无论在抗病防病方面，还是在增产提质方面均有显著提高。根据Excel2007和DPS7.05对表8中列出的小区产量进行了统计分析，其分析结果列于表5和表6中。表5：小区产量方差分析表变异来源平方和自由度方差FF0.05F0.01处理间1974.873658.2934.2**4.769.78区组间6.0423.020.165.1410.92机误115.5619.25总变异2096.4111F区组间＝0.16＜F0.05区组间差异不显著；F处理间＝34.2＜F0.01处理间差异极显著。表6LSD多重比较表上述统计分析结果说明：经方差分析，处理间产量差异达极显著水平。用PISD法进行多重比较，本发明产品与处理1、处理3和处理4之间差异显著。由此可见，本发明的土壤生物修复剂无论在防病抗病方面，还是在增产提质方面均优于常规施肥。当前第1页1 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