基于单液滴微环境精密调控的低缺陷蛋白单晶体培养系统的制作方法

本发明属于结构生物学、结晶学及X射线晶体衍射学技术领域，具体涉及一种基于单液滴微环境精密调控的低缺陷蛋白单晶体培养系统。

背景技术：

结构生物学是以生命物质的精确空间结构及其运动为基础来阐明生命活动规律和生命现象本质的学科，其核心内容是研究蛋白质及其复合物、组装体和由此形成的细胞各类组分的三维结构、运动和相互作用，以及它们与正常生物学功能和异常病理现象间的关系。这一学科内涵决定了结构生物学将在后基因组时代中处于战略性关键地位，是生命科学中最具有挑战性的前沿领域之一。蛋白分子是结构生物学最重要的研究对象，解析蛋白结构目前已有多种技术手段，而其中精度和可靠度最高、应用最广泛的仍为X射线晶体衍射法。蛋白质分子的结晶过程一般分为三个阶段：成核过程、晶体生长和生长停止；目前用于蛋白晶体培养的方法主要有以下四种：蒸发扩散结晶法、批量静置结晶法、平衡透析法和晶种接种或重复接种法。

然而，以上方法均无法实现对蛋白结晶进程和状态的实时感知，无法对成核速率、晶体生长速率进行精确控制，即只是给出初始条件等待结果自然产生而不能对过程进行有效的实时干预，故无法有效地控制结晶品质，所得的晶体质量具有很大的随机性，结果难以准确重复，也难以获得适用于X射线晶体衍射的大粒度、低缺陷密度的蛋白单晶体，不利于相关学科研究的开展。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于单液滴微环境精密调控的低缺陷蛋白单晶体培养系统，以解决上述背景技术中提出的无法实现对蛋白结晶进程和状态的实时感知，无法对成核速率、晶体生长速率进行精确控制，无法有效地控制结晶品质，得到的晶体质量具有很大的随机性，结果难以准确重复，难以获得适用于X射线晶体衍射的大粒度、低缺陷密度的蛋白单晶体而不利于相关学科研究的开展的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于单液滴微环境精密调控的低缺陷蛋白单晶体培养系统，包括载样池、进样系统、温度控制系统、外加磁场组件、光学元件组a、光学元件组b和传输及供电系统，所述载样池由载样池外壁和光学玻璃内嵌组成，所述光学玻璃内嵌的外侧设置有载样池外壁，且载样池外壁与光学玻璃内嵌为一体式结构，所述载样池外壁的顶端通过铰链固定设置有载样池上盖，所述载样池上盖的中心位置处设置有进样孔，所述载样池的内部设置有载样通道，所述进样系统由固定支架、转换器和六个相同的加样臂组成，所述固定底座的一端设置有束线器b，所述固定底座的上表面通过螺母固定设置有固定支架，所述固定支架的一端设置有转换器，所述转换器的下方竖直连接有六个加样臂，且所述加样臂呈正六边形对称分布，所述加样臂由玻璃针头微量进样器、微量注射泵、导轨滑块升降器构成，且所述六个加样臂中距离固定支架最远的一个加样臂所处的位置称为工作位，所述处于工作位的加样臂上玻璃针头微量进样器的玻璃针头正对载样池上盖中心的进样孔；所述温度控制系统由Pt-100精密级标准铂电阻温度传感器、铝箔-碳化硅陶瓷复合薄层磁屏蔽薄壳、隔热无机绝缘薄壳、电压灵敏低噪声前置放大电路、数字控制器、可控硅触发器、可控硅执行器、红外灯共用底座、红外灯和保护外壳e组成，所述铝箔-碳化硅陶瓷复合薄层磁屏蔽薄壳的外侧设置有隔热无机绝缘薄壳，所述隔热无机绝缘薄壳的下方设置有电压灵敏低噪声前置放大电路，所述电压灵敏低噪声前置放大电路的下方设置有数字控制器，所述数字控制器的下方设置有可控硅触发器，所述可控硅触发器的一侧设置有可控硅执行器，所述可控硅执行器的底端设置有红外灯共用底座，所述四个相同的红外灯分为两组，均通过导线连接到红外灯共用底座，每组的两个红外灯相对放置且灯头中轴位于同一水平直线上，所述两组红外灯的灯头中轴正交于同一水平面内，各红外灯灯头朝向两中轴的交点且与两中轴的交点的距离相等，所述红外灯灯头中轴十字叉旋转45°后与光学元件组a及光学元件组b的中轴十字叉重合，即两个中轴十字叉错开45°，所述线路a和线路b通过集线盒连接到高精度可调电源，通以稳恒电流，所述线路c通过集线盒连接到计算机；所述光学元件组a为一套激光粒度分析仪组件，由激光器、显微物镜、针孔挡板、准直镜、电动滑块导轨、傅立叶透镜、CCD图像传感器a、A/D转换器a、保护外壳a、保护外壳b和数据线接头组成，所述保护外壳a的内部通过卡合固定设置有电动滑块导轨，所述电动滑块导轨内侧通过卡合设置有准直镜，所述准直镜的一侧设置有显微物镜，所述显微物镜与准直镜之间设置有针孔挡板，所述显微物镜、针孔挡板、准直镜能够在电动滑块导轨的驱动下水平滑动，所述显微物镜的一侧设置有激光器，所述激光器的一端设置有数据线接头，所述保护外壳b的内部设置有A/D转换器a，所述A/D转换器a的一端设置有数据线接头，所述保护外壳b的另一端设置有傅立叶透镜，所述傅立叶透镜的一侧设置有CCD图像传感器a；所述光学元件组b为一套改进的自动式阿贝折光仪组件，由白光光源、光源转轮、狭缝挡板(中央有一条贯穿上下的竖向狭缝)、旋转动镜、半抛物面镜、串联窄带光纤光栅色散补偿器、升降半透镜、控制电路、CCD图像传感器b、A/D转换器b、保护外壳c、保护外壳d、数据线接头组成，所述保护外壳c的内部设置有光源转轮，所述光源转轮的一端设置有白光光源，所述保护外壳d的内部设置有控制电路，所述控制电路的上方设置有旋转动镜，所述旋转动镜的上方设置有半抛物面镜，所述半抛物面镜的一侧设置有串联窄带光纤光栅色散补偿器，所述串联窄带光纤光栅色散补偿器的一侧设置有升降半透镜，所述升降半透镜的一侧设置有CCD图像传感器b，所述CCD图像传感器b的一侧设置有A/D转换器b；所述传输及供电系统由各连接线路、固定底座、集线盒、高精度可调电源组成，且所述各连接线路、固定底座、集线盒和高精度可调电源之间通过导线及数据线连接。

优选的，所述载样池外壁为不透明非导磁金属(不含铁、钴、镍)材质圆筒结构，侧面与光学元件组a及光学元件组b的保护外壳a、保护外壳b、保护外壳c、保护外壳d相接处为4处圆形开孔，侧面与温度控制系统的四个红外灯的灯头相接处为4处正方形开孔，红外灯灯头中轴十字叉旋转45°后与光学元件组a及光学元件组b的中轴十字叉重合，即两个中轴十字叉错开45°，所述光学玻璃内嵌为高透光率且折射率已知的光学玻璃材质，表面由透明超疏水薄膜包覆；其结构可视作一个直径与载样池外壁内径相等、高与载样池外壁内高相等的圆柱从中轴挖去一个直径2mm、高与载样池外壁内高相等的圆柱，再从上下两底面分别挖去一个半径与载样池外壁内半径相等的半球体得到的几何结构，光学玻璃内嵌能够刚好嵌入载样池外壁内部。

优选的，所述保护外壳e为厚度2mm的经过去氢退火工艺加工的Mumetal(添加铜、铬的含镍76％的镍铁合金)材质，具有高导磁率，能够有效屏蔽外加磁场，消除外加磁场对其内部器件工作造成的干扰。

优选的，所述所有传输线路包被的外皮均为“绝缘层-铝箔-绝缘层”三层复合结构，其中铝箔厚度在0.12mm以上。

优选的，所述半抛物面镜为只有中轴所在水平面以上的半个部分的抛物面镜，其顶点位于保护外壳d内部的圆柱状空间的左方底面的圆心，其中轴与保护外壳d内部的圆柱状空间的中轴重合；所述升降半透镜为一块固定在微型升降架上的只有中轴所在水平面以上的半个部分的凸透镜，微型升降架将透镜部分升至顶端时透镜的一侧焦点恰好落在CCD图像传感器b的传感表面中央。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明结构科学合理，自动化程度高，使用安全便捷；实现了沿二次成核路径进行的两步结晶法的全自动化过程控制，先在不稳态成核，再在亚稳态使晶体进一步生长，整个过程中通过对体系状态的实时监测和对结晶添加剂浓度、温度、外加磁场强度等因素的实时反馈调控来实现对结晶速率和结晶进程的精准控制，从而能够在最优条件下得到粒度大、晶体缺陷密度小的优质蛋白单晶体；解决了上述背景技术中提出的现有的蛋白晶体培养方法无法实现对蛋白结晶进程和状态的实时感知，无法对成核速率、晶体生长速率进行精确控制，无法有效地控制结晶品质，得到的晶体质量具有很大的随机性，结果难以准确重复，难以获得适用于X射线晶体衍射的大粒度、低缺陷密度的蛋白单晶体而不利于相关学科研究的开展的问题。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为本发明图1所示装置过载样池中轴与光学元件组b中轴所在的竖直平面的剖面结构示意图；

图3为本发明图1所示装置过载样池中轴与光学元件组a中轴所在的竖直平面的剖面结构示意图；

图4为本发明图2中光学组件的局部放大结构示意图；

图中：1-固定底座、2-固定支架、3-转换器、4-加样臂、5-玻璃针头微量进样器、6-微量注射泵、7-导轨滑块升降器、8-定位挡板、9-内嵌导轨滑块升降器、10-引导杆、11-载样池外壁、12-光学玻璃内嵌、13-载样池上盖、14-进样孔、15-固定扣、16-载样通道、17-蛋白液滴、18-白光光源、19-光源转轮、20-保护外壳c、21-保护外壳d、22-数据线接头、23-旋转动镜、24-半抛物面镜、25-控制电路、26-串联窄带光纤光栅色散补偿器、27-升降半透镜、28-CCD图像传感器b、29-A/D转换器b、30-Pt-100精密级标准铂电阻温度传感器、31-铝箔-碳化硅陶瓷复合薄层磁屏蔽薄壳、32-隔热无机绝缘薄壳、33-电压灵敏低噪声前置放大电路、34-数字控制器、35-可控硅触发器、36-可控硅执行器、37-红外灯共用底座、38-束线器a、39-保护外壳e、40-线路a、41-线路b、42-线路c、43-保护外壳a、44-保护外壳b、45-激光器、46-电动滑块导轨、47-显微物镜、48-针孔挡板、49-准直镜、50-傅立叶透镜、51-CCD图像传感器a、52-A/D转换器a、53-红外灯、54-Helmholtz线圈a、55-Helmholtz线圈b、56-高精度可调电源、57-集线盒、58-束线器b、59-狭缝挡板。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1、图2、图3和图4，本发明提供一种基于单液滴微环境精密调控的低缺陷蛋白单晶体培养系统技术方案：基于单液滴微环境精密调控的低缺陷蛋白单晶体培养系统，包括载样池、进样系统、温度控制系统、外加磁场组件、光学元件组a、光学元件组b和传输及供电系统，载样池由载样池外壁和光学玻璃内嵌组成，光学玻璃内嵌的外侧设置有载样池外壁，且载样池外壁与光学玻璃内嵌为一体式结构，载样池外壁的顶端通过铰链固定设置有载样池上盖，载样池上盖的中心位置处设置有进样孔，载样池的内部设置有载样通道，进样系统由固定支架、转换器和六个相同的加样臂组成，固定底座的一端设置有束线器b，固定底座的上表面通过螺母固定设置有固定支架，固定支架的一端设置有转换器，转换器的下方竖直连接有六个加样臂，且加样臂呈正六边形对称分布，加样臂由玻璃针头微量进样器、微量注射泵、导轨滑块升降器构成，且六个加样臂中距离固定支架最远的一个加样臂所处的位置称为工作位，处于工作位的加样臂上玻璃针头微量进样器的玻璃针头正对载样池上盖中心的进样孔；温度控制系统由Pt-100精密级标准铂电阻温度传感器、铝箔-碳化硅陶瓷复合薄层磁屏蔽薄壳、隔热无机绝缘薄壳、电压灵敏低噪声前置放大电路、数字控制器、可控硅触发器、可控硅执行器、红外灯共用底座、红外灯和保护外壳e组成，铝箔-碳化硅陶瓷复合薄层磁屏蔽薄壳的外侧设置有隔热无机绝缘薄壳，隔热无机绝缘薄壳的下方设置有电压灵敏低噪声前置放大电路，电压灵敏低噪声前置放大电路的下方设置有数字控制器，数字控制器的下方设置有可控硅触发器，可控硅触发器的一侧设置有可控硅执行器，可控硅执行器的底端设置有红外灯共用底座，四个相同的红外灯分为两组，均通过导线连接到红外灯共用底座，每组的两个红外灯相对放置且灯头中轴位于同一水平直线上，两组红外灯的灯头中轴正交于同一水平面内，各红外灯灯头朝向两中轴的交点且与两中轴的交点的距离相等，红外灯灯头中轴十字叉旋转45°后与光学元件组a及光学元件组b的中轴十字叉重合，即两个中轴十字叉错开45°，线路a和线路b通过集线盒连接到高精度可调电源，通以稳恒电流，线路c通过集线盒连接到计算机；光学元件组a为一套激光粒度分析仪组件，由激光器、显微物镜、针孔挡板、准直镜、电动滑块导轨、傅立叶透镜、CCD图像传感器a、A/D转换器a、保护外壳a、保护外壳b和数据线接头组成，保护外壳a的内部通过卡合固定设置有电动滑块导轨，电动滑块导轨内侧通过卡合设置有准直镜，准直镜的一侧设置有显微物镜，显微物镜与准直镜之间设置有针孔挡板，显微物镜、针孔挡板、准直镜能够在电动滑块导轨的驱动下水平滑动，显微物镜的一侧设置有激光器，激光器的一端设置有数据线接头，保护外壳b的内部设置有A/D转换器a，A/D转换器a的一端设置有数据线接头，保护外壳b的另一端设置有傅立叶透镜，傅立叶透镜的一侧设置有CCD图像传感器a；光学元件组b为一套改进的自动式阿贝折光仪组件，由白光光源、光源转轮、狭缝挡板(中央有一条贯穿上下的竖向狭缝)、旋转动镜、半抛物面镜、串联窄带光纤光栅色散补偿器、升降半透镜、控制电路、CCD图像传感器b、A/D转换器b、保护外壳c、保护外壳d、数据线接头组成，保护外壳c的内部设置有光源转轮，光源转轮的一端设置有白光光源，保护外壳d的内部设置有控制电路，控制电路的上方设置有旋转动镜，旋转动镜的上方设置有半抛物面镜，半抛物面镜的一侧设置有串联窄带光纤光栅色散补偿器，串联窄带光纤光栅色散补偿器的一侧设置有升降半透镜，升降半透镜的一侧设置有CCD图像传感器b，CCD图像传感器b的一侧设置有A/D转换器b；传输及供电系统由各连接线路、固定底座、集线盒、高精度可调电源组成，且各连接线路、固定底座、集线盒和高精度可调电源之间通过导线及数据线连接。

本实施例中，优选的，载样池外壁为不透明非导磁金属(不含铁、钴、镍)材质圆筒结构，侧面与光学元件组a及光学元件组b的保护外壳a、保护外壳b、保护外壳c、保护外壳d相接处为4处圆形开孔，侧面与温度控制系统的四个红外灯的灯头相接处为4处正方形开孔，红外灯灯头中轴十字叉旋转45°后与光学元件组a及光学元件组b的中轴十字叉重合，即两个中轴十字叉错开45°，光学玻璃内嵌为高透光率且折射率已知的光学玻璃材质，表面由透明超疏水薄膜包覆；其结构可视作一个直径与载样池外壁内径相等、高与载样池外壁内高相等的圆柱从中轴挖去一个直径2mm、高与载样池外壁内高相等的圆柱，再从上下两底面分别挖去一个半径与载样池外壁内半径相等的半球体得到的几何结构，光学玻璃内嵌能够刚好嵌入载样池外壁内部。

本实施例中，优选的，保护外壳e为厚度2mm的经过去氢退火工艺加工的Mumetal(添加铜、铬的含镍76％的镍铁合金)材质，具有高导磁率，能够有效屏蔽外加磁场，消除外加磁场对其内部器件工作造成的干扰。

本实施例中，优选的，所有传输线路包被的外皮均为“绝缘层-铝箔-绝缘层”三层复合结构，其中铝箔厚度在0.12mm以上。

本实施例中，优选的，半抛物面镜为只有中轴所在水平面以上的半个部分的抛物面镜，其顶点位于保护外壳d内部的圆柱状空间的左方底面的圆心，其中轴与保护外壳d内部的圆柱状空间的中轴重合；升降半透镜为一块固定在微型升降架上的只有中轴所在水平面以上的半个部分的凸透镜，微型升降架将透镜部分升至顶端时透镜的一侧焦点恰好落在CCD图像传感器b的传感表面中央。

本发明中的激光粒度分析仪根据光的散射原理测量颗粒大小，具有测量的动态范围大、测量速度快等优点，能够用于测量各种固体粉末、乳液颗粒、雾滴的粒度分布。光在行进中遇到微小颗粒时，会发生散射，大颗粒的散射角较小，小颗粒的散射角较大。

同时利用CCD图像传感器实时得到透过样品的光强，结合载样通道处于真空状态时测得的参比光强计算得到蛋白液滴的实时透光率数据。(当采用光源照射结晶溶液时，由于晶体颗粒的干扰，光的强度将有所减弱，即透射光的光强要小于入射光的光强，两光强之比习惯称为透光率，采用r表示。依据Beer-Lambert定律，透光率的大小主要取决于体系中已有晶体颗粒的粒度与数目，其值对应表征着晶体颗粒的表面积总和，即

式中：I₁和I₂分别为入射光和透射光的光强，w为透光检测室宽度，k_a为晶体的表面积形状因子，L和L₀分别为晶体和新核的粒度,f(L,t)为晶体粒度分布函数。)

保护外壳a、保护外壳b为厚度2mm的经过去氢退火工艺加工的Mumetal(添加铜、铬的含镍76％的镍铁合金)材质，具有高导磁率，能够有效屏蔽外加磁场，消除外加磁场对其内部器件工作造成的干扰。

所有传输线路包被的外皮均为“绝缘层-铝箔-绝缘层”三层复合结构，其中铝箔厚度在0.12mm以上，能够起到良好的磁屏蔽作用。

在计算机控制系统的控制下改进型自动式阿贝折光仪组件即光学元件组b每隔一个较短的时间间隔进行一次测量，在单次测量中，开始时升降半透镜处于降下状态(透镜部分降到底部，完全位于通路下半部分；这里将保护外壳d内部的圆柱状空间以过其中轴线的水平面为界分为上、下两部分，分别称为“通路上半部分”和“通路下半部分”)，白光光源发出的光线穿过狭缝挡板，经过分别相当于进光棱镜、折射棱镜的光学玻璃内嵌的前后两块玻璃部分及其间的载样通道中的蛋白溶液层折射后射出，经旋转动镜及半抛物面镜的反射从通路上半部分向右方射去，经过串联窄带光纤光栅色散补偿器后投射在CCD图像传感器b上，最终在计算机控制系统内产生图像；计算机控制系统调节光源转轮改变入射光方向直至使CCD图像传感器b捕获的图像中出现明显的明暗分界(即图像中出现亮度差超过设定阈值的两部分)，再调节串联窄带光纤光栅色散补偿器消除色散，而后升降半透镜变为升起状态(透镜部分升到顶部，完全位于通路上半部分)，计算机控制系统控制旋转动镜绕其转轴转动改变其镜面所在平面与水平面间的二面角大小直至CCD图像传感器b捕获的投射图案变为一个位于图像中央的亮点(此状态下经旋转动镜反射后的光线恰好经过半抛物面镜的焦点，经半抛物面镜反射后成为一束水平向右射去的平行光，经升降半透镜折射后汇聚于升降半透镜的右焦点，即CCD图像传感器b的传感表面中央；在光源转轮转过的角度确定的情况下能实现此状态的旋转动镜的旋转角度是唯一的)，此时再降下升降半透镜，记录投射图案在图像上的位置，计算机控制系统根据旋转动镜转过的角度和最后投射图案在图像上的位置计算出经过分别相当于进光棱镜、折射棱镜的光学玻璃内嵌的前后两块玻璃部分及其间的载样通道中的蛋白溶液层折射后的出射光线与水平方向间的夹角，再结合光源转轮转过的角度及光学玻璃内嵌的折射率计算得到蛋白液滴的折射率，从而根据蛋白溶液折射率与浓度间的关系得到蛋白溶液的浓度，然后光源转轮和旋转动镜复位，至此一次测量完成。

计算机控制系统由PC(个人计算机)以及PC与其他各硬件间的连接线路组成。

计算机控制系统依靠控制程序和各相关功能软件，负责整个晶体培养系统运行的过程控制，尤其是实时数据的处理反馈和各设备的运行控制，以实现整个晶体培养系统运行的自动化和结晶路径及条件的最优化。

六个加样臂均竖直连接于转换器上，呈正六边形对称分布，距离固定支架最远的一个加样臂所处的位置称为工作位，处于工作位的加样臂的玻璃针头微量进样器的玻璃针头正对载样池的上盖中央的进样孔；转换器能够以60°为单位绕其中轴转动以将所需要的加样臂移动到工作位；每个加样臂的玻璃针头微量进样器中储有一种结晶添加剂，当需要将此种结晶添加剂定量添加到蛋白液滴中时，计算机控制系统驱动转换器将相应加样臂移动到工作位，然后驱动导轨滑块升降器使其滑块下降到指定位置导致该加样臂向下伸长至其玻璃针头微量进样器的玻璃针头穿过载样池上盖的进样孔并伸入载样通道中的蛋白液滴中央(导轨滑块升降器的滑块位于初始位置时加样臂的下端即玻璃针头微量进样器的玻璃针头高于载样池、外加磁场组件等其他器件的上端，不会与其他器件接触)，计算机控制系统驱动微量注射泵的内嵌导轨滑块升降器的滑块精确下降相应距离从而推动玻璃针头微量进样器的活塞下降相同距离将相应体积的添加剂液体精确地从玻璃针头微量进样器中压出而排入蛋白液滴中(玻璃针头微量进样器的针筒是内径确定的圆筒，故排出液体的体积可直接换算为活塞下降的距离)，液体排出结束后，微量注射泵的内嵌导轨滑块升降器保持不动而导轨滑块升降器的滑块上升回原位置从而将玻璃针头微量进样器的玻璃针头从载样池中抽出(玻璃针头微量进样器的玻璃针头的外表面经过超疏水处理，可有效防止玻璃针头抽出时将蛋白液滴中的液体带出)，至此，一个加样过程完成。

本发明的工作原理及使用流程：本发明安装好后，首先检查本发明的安装固定以及安全防护，然后即可使用；使用时，本系统的一个完整工作周期分为“学习阶段”和“正式运行阶段”两个阶段：

【1】“学习阶段”

由于目前蛋白结晶学领域内关于各类环境因素对蛋白结晶过程影响的热力学和动力学机理研究大多还停留在现象描述和假说提出阶段，鲜有明确的公式作为条件参数计算依据，故若要对各因素对结晶过程的影响效果进行分析和预判以找出最优条件，必须基于实际的实验结果，通过大量的实验数据统计分析得出最优条件。然而，由于影响蛋白结晶过程的环境因素众多，即使只考虑影响较显著的因素，也需要同时考虑多个因素(如多种结晶添加剂的浓度、温度、外加磁场强度等)，由于各因素的作用效果不一定相互独立，即可能存在因素间相互作用，单独分析单一因素寻找最优值的方法并不可靠，故为了找到总体最优条件，必须同时考虑所有因素的作用。然而，同时考虑各因素的作用必然导致庞大的实验量，不仅工作量庞大难以完成，也难以获取足够的样品量来支持实验的开展。为解决这一问题，我们采用正交实验法，在保证结论准确性不产生显著损失的情况下最大程度地减少所需实验次数。

正交实验法是研究多因素多水平的一种实验设计方法，它根据正交性从全面实验中挑选出部分有代表性的点进行实验，这些有代表性的点具备均匀分散、齐整可比的特点。正交实验法是一种高效、经济的实验设计方法，它利用一套规格化的表格(即正交表)来设计实验方案和分析实验结果，能够在大量的实验条件中选出少数几个代表性强的实验条件，并通过这几次实验的数据，找到较好的条件，即最优的或较优的方案。

(1)正交表的设计

正交表是一整套规则的设计表格，现在广泛使用的L_n[t^c]类型的正交表构造思想比较成熟，它以L为正交表的代号，n为实验的次数，t为水平数，c为列数，也就是可能安排最多的因素个数。

以L₉[3⁴]类型正交表的构造过程为例：

1)确定正交表的行和列

共有四个因素，每个因素有3个水平，共需安排9次实验。因此，该正交表是一个4列、9行的表。生成正交表的表头如下表所示。

对每个因素的水平进行编号，分别为1、2、3，并将实验按照水平数3进行分组，即每三个实验为一组。

对于第一列：第一组实验中，全部使用因素1的第1个水平；第二组实验中，全部使用因素1的第2个水平；第三组实验中，全部使用因素1的第3个水平；

对于第二列：每一组实验中，都分别使用因素2的三个水平1、2、3；

对于第三列：每一项实验中，确定每一个水平编号；

对于第四列：每一项实验中，确定每一个水平编号。

3)生成正交表

将各因素的水平编号填入表中可得正交表。

面对一种新的蛋白样品时，计算机控制系统自动生成正交实验方案，通过开展微阵列正交实验，在损耗最少样品的情况下，得到各因素共同变化时的各粗略情况范围下的晶体生长速率、初次成核速率、二次成核速率的值，找到最接近目标最优值的小范围，在这个小范围内再开展精细化的正交实验，从而找到对应目标相应的最优的总体条件，同时测得相应蛋白溶液的饱和浓度c_sat。

【2】“正式运行阶段”

在“正式运行阶段”内，系统工作又分为“成核阶段”(第一阶段)和“晶体生长阶段”(第二阶段)两个子阶段。每一个子阶段中，系统根据结晶相图和理论上得到的最优的晶体生长速率、初次成核速率、二次成核速率的值，结合在“学习阶段”得到的相应最优值对应的总体最优条件，来调节各环境因素的值，使系统时刻保持最优状态。

而控制系统的另一个任务，便是准确地找到两个子阶段间的转折点，在转折点到来时及时转变系统状态，控制系统根据人为构造的判定变量K^*的增减趋势进行转折点的判定。

下面对动力学参量的计算方法和成核阶段与晶体生长阶段间分界点的判断量的构造进行阐述：

[1]动力学参量的计算

成核速率B₀采用阿雷尼乌斯表达式关联体系过饱和度计算，即：

式中：B₀为成核速率；k_b、b、E_b均为成核动力学参数；R为理想气体常数；T为温度；S为过饱和度。

生长晶体的质量为单位时间内结晶体系中晶粒生长引起的体积变化与晶粒密度的乘积，可表示为：

式中：ΔM_G为生长晶体的质量；m_L为溶剂质量；c₀为溶液初始浓度；k_V为晶体的体积形状因子；ρ_v为晶体密度；为透光率的自然对数；k_a为晶体表面积形状因子；w为透光检测室的宽度；ρ₀为溶液密度；k_g、g均为晶体生长动力学参数，S为溶液过饱和度。

故，可建立表示结晶过程的模型表达式：

式中：c为溶液浓度(即单位质量溶剂中溶解的溶质质量)；t为结晶时间；c₀为溶液初始浓度；ρ₀为溶液密度；k_b、b、E_b均为成核动力学参数；R为理想气体常数；T为温度；S为过饱和度；m_L为溶剂质量；k_V为晶体的体积形状因子；ρ_c为晶体密度；为透光率的自然对数；k_a为晶体表面积形状因子；w为透光检测室的宽度；k_g、g均为晶体生长动力学参数。

由上式可知，只要测定结晶过程中溶液的实时透光率和实时浓度，利用非线性回归方法可求取晶核形成和晶体生长的动力学参数k_b、E_b、b、k_g和g。

得到k_b，b，k_g，g值后，便可根据结晶动力学经验公式：

G＝k_gS^g (6)

计算得到晶体生长速率G、初次成核速率和二次成核速率(依据不同的成核机理，成核速率B⁰可分为初次成核速率和二次成核速率分别对应着未添加晶种的自发成核结晶过程和有晶种存在的二次成核结晶过程。)

式中：S为相对过饱和度；c为溶液浓度；c_sat为对应温度下溶液的饱和浓度即溶解度；G为晶体生长速率；k_g和g为晶体生长动力学参数；为初次成核速率；为二次成核速率；k_b和b为晶体成核动力学参数；μ₃为CSD(晶体粒度分布函数，即f(L,t))的3阶矩量。

μ₃的求解：

定义μ_i为晶体粒度分布函数CSD的i阶矩量，式(9)至式(11)给出了CSD各阶矩量的定义及其相互间的代换关系，即

式中：f(L,t)为CSD(晶体粒度分布函数)；μ_i为CSD的i阶矩量；L为晶体粒度；t为结晶时间；G为晶体生长速率；μ₀为CSD的0阶矩量，其值表征着体系中的晶体总粒数；B⁰为晶体成核速率。

前面提到，依据Beer-Lambert定律，透光率的大小主要取决于体系中已有晶体颗粒的粒度与数目，其值对应表征着晶体颗粒的表面积总和，即

由μ₂的定义即式(9)可知，式(1)可改写为

式中：

r--结晶体系的透光率，无因次；

k_a--晶体表面积形状因子，无因次；

w--透光检测室的宽度，cm；

L₀--新核的粒度，cm；

μ₂--晶体粒度分布函数的二阶矩量，cm²·cm^-3；

f(L,t)--CSD(晶体粒度分布函数)。

通过非线性回归方法可求μ₂，再根据(10)式解得μ₃。

[2]成核阶段与晶体生长阶段间分界点的识别模型

1)动力学依据及建模推导

结晶学研究中，由于CSD的二阶、三阶矩量分别表征着体系中晶体的总表面积和体积，故当晶体的数目或粒度增加时，CSD的二阶与三阶矩量值会呈现出不同幅度的增长，而两者又可分别与体系的透光率和浓度相关联。故分析体系透光率和浓度的变化可为成核与晶体生长两过程的动力学研究提供重要的信息。

动力学建模推导：

由Beer-Lambert定律可知，体系透光率r的对数值可与CSD的二阶矩量μ₂相关联，即

式中：

r--结晶体系的透光率，无因次；

k_a--晶体表面积形状因子，无因次；

w--透光检测室的宽度，cm；

L0--新核的粒度，cm；

μ₂--晶体粒度分布函数的二阶矩量，cm²·cm^-3；

f(L,t)--CSD(晶体粒度分布函数)。

设dt时间内，单位体积晶浆中晶体数目由N增加至N+dN，粒度由L增加至L+dl,则由此造成溶液浓度c和透光率的自然对数lnr随时间的变化率分别为

式中：

c--溶液浓度(单位质量溶剂中溶解的溶质质量)，g·g^-1；

t--结晶时间，min；

ρ_c--晶体密度，g·cm^-3；

k_V--晶体体积形状因子，无因次；

V--晶浆体积，cm^-3；

m_L--溶剂质量，g；

N--单位体积晶浆中的晶体数目，无因次；

dl--晶体的粒度增加量，cm；

w--透光检测室的宽度，cm。

将式(13)和式(14)移项相除，整理可得

式中：μ₁--晶体粒度分布函数的一阶矩量，cm·cm^-3。

式(15)中，因且μ₁>0，故另由于(晶体的破损或聚并)，因此有

除μ₁外，式(16)中其余变量均为可测取或换算的物理量，μ₂可依据式(12)由透光率数据算取。μ₁与晶体数目的比值μ₁/N征着体系中晶体的平均粒度，对于伴有成核产生的结晶过程，因晶体数目N处于不断地变化，故μ₁值通常难以准确获取。

2)判据变量的提出

为替换式(16)中难以确定的CSD一阶矩量μ₁，现定义一无因次变量K，令

式中：K--新定义的变量，无因次；

μ₃--晶体粒度分布函数的三阶矩量，cm³·cm^-3。

将式(17)代入式(16)，可得

式(18)中，μ₃还可通过溶质的质量衡算进行表达，以便于化简。对于未添加或添加晶种的结晶过程(即初次成核与二次成核结晶过程)，相应的衡算式均可写为

m_L(c₀-c)+m_S＝ρ_ck_VVμ₃ (19)

即

式中：

c₀--溶液的初始浓度，g·g^-1；

m_S--添加的晶种质量(对于未添加晶种的结晶过程m_S＝0),g。

联立式(12)、式(18)和式(20)，整理可得

对于式(21)，当且仅当体系中晶体数目不变即式(15)中时，等式才严格成立。

为便于表达，可进一步令式(21)的右边项为K^*，即

式中：K^*--与变量K一样亦为新定义的变量，无因次。

K与K^*变化趋势具有高度相似性，这种相似性是由于结晶过程中新生晶核的粒度L₀通常远小于生长后的晶体粒度，故导致项要远小于和两项，即式(16)可表示为

从而式(21)可改写为

由式(24)可知变量K与K^*在数值上近似相等，故两者的曲线走势也必然吻合。

3)识别模型判据的确立

通过模拟计算发现，变量K与K^*的数值均具有在成核阶段单调递减、晶体生长阶段单调递增的变化特性。基于K与K^*的这一变化特性，可将其数值的增减趋势作为成核阶段与晶体生长阶段定量判别的判据。

由于根据式(17)计算K值时需己知CSD的低阶矩量μ₁、μ₂和μ₃及相应的动力学参数，而结晶操作中在线测定μ₁值较为困难，运用动力学参数计算μ值又较为繁琐，故K变量的实际应用受到较大限制。而若利用式(22)计算K^*值，则只需获知溶液浓度和透光率等若干可直接测量的结晶信息，而且便于对过程的同步分析。因此，我们以参数K^*的增减趋势作为区分成核阶段与晶体生长阶段的判据。

系统运行控制原理：

(1)通过控制温度与蛋白浓度的关系，先使体系状态处于不稳态(第一阶段)，形成适宜数量的晶核时，再改使体系状态处于亚稳态(第二阶段)，进行晶体生长。

(2)通过控制动力学参数k_b,b,k_g,g来控制成核速率和生长速率，在不稳态(第一阶段)促进成核，在亚稳态(第二阶段)促进晶体生长。

(3)通过K^*值的增减趋势的改变来判断第一阶段与第二阶段的转折点，从而及时将体系状态从利于成核的不稳态迁移到利于晶体生长的亚稳态。

(4)通过正交实验学习得到的成核速率和生长速率与各影响因子(各结晶添加剂浓度、温度、外加磁场强度等)值之间的相关关系来调控各影响因子的大小，通过实时的反馈调控进行实时调整，始终保持相应时刻的最优状态。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。