技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种掺铒荧光生物活性玻璃及其制备方法。
背景技术：
上转换发光现象最早是在1959年采用960nm的红外光激发多晶ZnS时观察到的。1962年，人们又在硒化物中观察到上转换发光现象，1966年，Auzel在研究钨酸镱钠玻璃时，意外发现当基质材料中掺入Yb3+离子时，Er3+、Ho3+和Tm3+离子在红外光激发时，其发光效率几乎提高了两个数量级，由此正式提出了“上转换发光”的概念。
稀土掺杂材料上转换发光现象在大量的实验中观察到后，60至70年代，人们对其机理进行了详细的研究。80年代初期，实现了闪光灯泵浦的上转换激光，并进入了第一次研究高潮时期，但由于当时材料合成方法及泵浦源能量的限制使其发展受到了阻碍。80年代后期，红外大功率二极管激光器问世及其商品化，以及稀土掺杂的重金属氟化物玻璃材料的制备成功使小型全固体上转换激光的实现成为了可能，至此又掀起了研制上转换激光器的第二次高潮。1986年，已有报导Ti宝石激光器泵浦的上转换激光器输出功率已达到1W，半导体二极管激光器泵浦的上转换激光器的输出达到100mW。上世纪末，人们对光纤的认识也给上转换激光器的研究带来了一定的启发，上转换光纤激光器的研究从而倍受重视。但由于上转换效率始终难以令人满意，并且由于短波长半导体激光器的问世，使上转换激光的研究进入了低潮。近两年来,随着世界各国对生命科学研究投入的加大，生物检测、药物靶标等研究受到了人们的广泛重视。而上转换发光是在红外光激发下产生可见光的过程，因此，利用上转换发光材料作为荧光标记材料可以大大降低噪声的影响。上转换发光材料，特别是纳米级上转换发光材料又重新受到了重视，并且近年来出现了很多研究报道。
最近,用上转换荧光材料作为生物分子荧光标记探针受到了广泛关注。荧光探针在生物芯片技术中起着示踪标记的作用,它的优劣直接影响到了检测的效果。应用于生物体标记的荧光材料主要包括有机染料、稀土螯合物、量子点等。这些材料普遍存在着的一些问题是:有机染料价格昂贵、稳定性低、容易受到干扰而使测试的灵敏度下降,而且对细胞的毒副作用也比较大;稀土螯合物的发光受配体和溶剂性质的影响比较大,因此可以采用的发光体系有限。量子点由于具有宽的激发光谱、窄的发射光谱、可精确调谐的发射波长、可忽略的光漂白等优越的荧光特性,是一类理想的荧光探针,近年来被人们广泛深入的研究。但是它同时又具有一个缺点,就是被检测的生物体会发生自感荧光与它干扰,这样就不能区分量子点发出的荧光和生物自身发出的荧光。于是人们把目光集中到稀土上转换发光纳米晶上来。由于稀土纳米晶的发光在自然界中非常少见,生物物体自身更是不具备这种性质,所以它用于生物检测就具有独特的优势。稀土掺杂纳米发光材料与量子点一样具有优良的荧光品质,目前其制备工作己经取得了一定的进展,稀土掺杂纳米发光颗粒的合成与光谱性能的研究是近些年来材料科学领域的一个新兴研究增长点,最近几年相关研究的进展更是日新月异。利用稀土上转换荧光材料制作成的荧光探针以及与其匹配的扫描设备大大降低原料和设备的成本,而且由于上转换发光材料是用红外光作为激发光源,激发能量较低而不会损伤生物样品,也不会激发出背底荧光,从而使检测灵敏度和线性范围得到大大的提高。
但目前有关荧光探针的报道中所使用的稀土上转换荧光材料的颗粒太大,大于所标记的生物分子如蛋白质或DNA,因而悬浮性差,样品均匀度低,影响了其在生物标记中的应用,因此为了方便偶联,标记粒子的尺寸最好和被标记的抗原、抗体的尺寸同等大小。目前,具备纳米尺寸的上转换发光材料是最近几年开始研究的,但是对于上转换材料来说,尺寸达到十几个纳米的时候,材料表面出现大量的缺陷,这些缺陷能够捕获电子,降低上转换效率,同时由于激发光都是长波,波长远比粒子的尺寸大,容易绕过粒子,穿透到材料的内部。寻找更理想的基质材料将是研究的热点。
技术实现要素：
本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种掺铒荧光生物活性玻璃及其制备方法，获得单分散，尺寸均一，具有良好生物活性、荧光性，可用于标记示踪，且生物活性玻璃矿化产物能促进骨组织的修复与再生。同时，利用铒离子光致发光特点，结合活体成像技术，有望应用在靶向载药体系中，达到实时监控药物在体内的分布情况的目的。
本发明通过以下技术方案实现。
一种掺铒荧光生物活性玻璃的制备方法，包括以下步骤：
（1）将十二胺加入乙醇溶液中，搅拌至完全溶解，得十二胺溶液；
（2）向步骤（1）所得的十二胺溶液中加入正硅酸乙酯、磷酸三乙酯、四水硝酸钙和硝酸铒，搅拌得到玻璃溶胶；
（3）将步骤（2）所得玻璃溶胶离心、干燥，再置于马弗炉中烧结，即得掺铒荧光生物活性玻璃。
优选的，步骤（1）所述乙醇溶液的体积浓度为78-80%。
优选的，步骤（1）所述十二胺和乙醇溶液的质量体积比为1g:26ml-1 g:27 ml。
优选的，步骤（2）所述正硅酸乙酯和乙醇溶液的质量体积比为1 g:10 ml -1 g:13 ml；所述磷酸三乙酯和乙醇溶液的质量体积比为1 g:90 ml -1 g:110 ml；所述四水硝酸钙和乙醇溶液的质量体积比为1 g:16 ml -1 g:23 ml。
优选的，物料添加顺序依次为十二胺，正硅酸乙酯，磷酸三乙酯，四水硝酸钙和硝酸铒。
优选的，步骤（2）所述搅拌的时间为1-5 h。
优选的，步骤（3）所述烧结的温度为400-800℃，烧结的时间为1-5 h。
优选的，所述铒在掺铒荧光生物活性玻璃中的掺杂量为1-5wt％。
优选的，一种掺铒荧光生物活性玻璃及制备方法，包括以下步骤：
先将4 g十二胺加入至25 ml去离子水和80 ml无水乙醇的混合溶液中，在40℃水浴锅中搅拌至完全溶解；随后加入9.6g正硅酸乙酯，搅拌30 min；加入1.14g磷酸三乙酯，搅拌30 min；加入6.35g四水硝酸钙和0.68g硝酸铒；将得到的溶液继续搅拌3 h；最后将玻璃溶胶离心得到白色沉淀，置于60℃干燥箱干燥24 h，再置于马弗炉650℃烧结3 h ，即得掺铒1％微纳米生物活性玻璃粉体。
由以上所述的制备方法得到的掺铒荧光生物活性玻璃，具有良好生物活性，荧光性，可用于标记示踪，且生物活性玻璃矿化产物能促进骨组织的修复与再生。
优选的，所述掺铒荧光生物活性玻璃的平均粒径为400-500nm。
本发明采用溶胶凝胶法结合有机模板自组装技术制备掺铒荧光生物活性玻璃，在生物玻璃的制备过程中引入稀土元素铒，实现发光特性；铒的上转换发光特性在生物成像领域的优势，穿透深度大，信噪比高，无背景荧光；掺铒后不改变生物玻璃的生物相容性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明选取生物活性玻璃和铒两种材料进行复合，铒元素以硝酸盐的形式加入生物活性玻璃的合成中。该掺铒荧光生物活性玻璃具有良好的生物相容性和荧光性；合成材料来源广泛，价格低廉；制备方法简单方便，且转化效率高；荧光剂用量少，发光明显，并不改变材料的生物活性。
附图说明
图1为掺铒荧光生物活性玻璃的制备流程图。
图2a、图2b、图2c、图2d分别为BG, BG-Er1, BG-Er3, BG-Er5的SEM照片。
图3a为BG-Er1,BG-Er3,BG-Er5在980 nm激发光激发下的发射图谱。
图3b为BG-Er1,BG-Er3,BG-Er5的铒离子能级图。
图4为BG，BG-Er1,BG-Er3,BG-Er5和BMSC细胞共培养不同天数（1 d,4 d）后的细胞活力值图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的掺铒荧光生物活性玻璃的制备流程图如图1所示。
实施例1：BG-Er1的制备过程
掺铒荧光生物活性玻璃粉体由溶胶-凝胶法结合有机模板自组装技术制得，具体合成过程如下：先将4 g十二胺加入至25 ml去离子水和80 ml无水乙醇的混合溶液中，在40℃水浴锅中搅拌至完全溶解；随后加入9.6g正硅酸乙酯，搅拌30 min；加入1.14g磷酸三乙酯，搅拌30 min；加入6.35g四水硝酸钙和0.68g硝酸铒；将得到的溶液继续搅拌3 h；最后将玻璃溶胶离心得到白色沉淀，置于60℃干燥箱干燥24 h，再置于马弗炉650℃烧结3 h ，即得掺铒1wt％微纳米荧光生物活性玻璃粉体，标记为BG-Er1。
实施例2：BG-Er3的制备过程
掺铒荧光生物活性玻璃粉体由溶胶-凝胶法结合有机模板自组装技术制得，具体合成过程如下：先将4 g十二胺加入至25 ml去离子水和80 ml无水乙醇的混合溶液中，在40℃水浴锅中搅拌至完全溶解；随后加入8.72g正硅酸乙酯，搅拌30 min；加入1.04g磷酸三乙酯，搅拌30 min；加入5.44g四水硝酸钙和1.86g硝酸铒；将得到的溶液继续搅拌3 h；最后将玻璃溶胶离心得到白色沉淀，置于60℃干燥箱干燥24 h，再置于马弗炉650℃烧结3 h ，即得掺铒3 wt％微纳米荧光生物活性玻璃粉体，标记为BG-Er3。
实施例3：BG-Er5的制备过程
掺铒荧光生物活性玻璃粉体由溶胶-凝胶法结合有机模板自组装技术制得，具体合成过程如下：先将4 g十二胺加入至25 ml去离子水和80 ml无水乙醇的混合溶液中，在40℃水浴锅中搅拌至完全溶解；随后加入8.0g正硅酸乙酯，搅拌30 min；加入0.95g磷酸三乙酯，搅拌30 min；加入4.68g四水硝酸钙和2.84g硝酸铒；将得到的溶液继续搅拌3 h；最后将玻璃溶胶离心得到白色沉淀，置于60℃干燥箱干燥24 h，再置于马弗炉650℃烧结3 h ，即得掺铒5 wt％微纳米荧光生物活性玻璃粉体，标记为BG-Er5。
对比例
荧光生物活性玻璃粉体由溶胶-凝胶法结合有机模板自组装技术制得，具体合成过程如下：先将4 g十二胺加入至25 ml去离子水和80 ml无水乙醇的混合溶液中，在40℃水浴锅中搅拌至完全溶解；随后加入9.6g正硅酸乙酯，搅拌30 min；加入1.14g磷酸三乙酯，搅拌30 min；加入6.35g四水硝酸钙，将得到的溶液继续搅拌3 h；最后将玻璃溶胶离心得到白色沉淀，置于60℃干燥箱干燥24 h，再置于马弗炉650℃烧结3 h ，即得荧光生物活性玻璃粉体，标记为BG。
对比例所得荧光生物活性玻璃粉体的SEM照片如图2a所示，可见生物玻璃呈单分散微球状，微球之间相互紧密连在一起，构成类似“葡萄”状的团聚体。经Nano Measurer1.2软件随机测量30个微球的直径，发现生物玻璃的粒径较均一，最小的粒径是392 nm，最大的粒径是501 nm，平均粒径为453 nm。图2b、图2c、图2d分别代表BG-Er1,3,5的SEM照片，从图中可以看出，掺铒荧光生物活性玻璃仍然是单分散微球状，平均粒径为400-500nm，而且分散性有所提高，表面较为粗糙，有一些不成球的纳米粒子堆积在荧光生物玻璃的表面。
图3a为实施例1-3所得材料的发射光谱图，从图中可以看出，掺铒荧光生物玻璃在980 nm激发下，发射出524 nm，547 nm，657 nm三个波长的光，随着铒离子含量升高，荧光强度逐渐变强。图3b为铒离子能级图，图3b与图3a相对应。其中547 nm发射峰最强，524 nm发射峰强次之，它们都在绿光波段（492-577 nm），所以材料发绿光，而且随着掺铒含量的增加，发射峰的强度是逐渐增加的。
图4为细胞增殖结果柱状图，从左到右依次是空白组（只有细胞），BG，BG-Er1，BG-Er3，BG-Er5。横坐标为时间，纵坐标为细胞活力值。相比于空白组，添加生物玻璃及掺杂铒离子的生物玻璃对细胞增殖有促进作用，说明该材料具有良好的生物相容性。不同掺杂浓度的生物玻璃之间，细胞活力值接近，并未明显影响该材料的生物相容性。